制備可生物降解并具有骨再生功能的支架材料是骨組織工程當前研究的重點領域。絲素蛋白具備可用作骨組織工程支架材料的許多要素，其中通過仿生方式生物礦化制備的絲素蛋白/無機復合材料與單純絲素相比，由于具有較好的生物相容性、生物力學性能、可生物降解性以及骨誘導和傳導特性，展現出更好的應用前景。本文綜述了近年絲素蛋白生物硅化制備新型骨組織工程材料的研究進展，并展望了絲素蛋白生物硅化今后的發展方向。
引用本文： 鄭直, 寧美英, 李東. 絲素蛋白生物硅化材料在骨組織工程學中的應用. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(4): 643-646. doi: 10.7507/1001-5515.201705029 復制
引言
隨著生物醫學的快速發展，可生物降解并具有再生功能的生物醫用材料成為下一代骨組織工程研究的重要方向和熱點領域。通過骨支架材料、生物活性因子、細胞以及血管等不同因素的有效整合，實現骨組織的工程化，最終達到修復缺陷骨組織和骨再生的目的。骨支架材料不但要具有良好的生物相容性和組織誘導性，還需要優異的生物力學性能，這是骨組織工程研究的核心和難點之一。可生物降解的有機/無機復合材料由于具有良好的生物相容性和力學性能，已成為近年國內外的研究熱點。絲素蛋白由于具備優異的生物相容性、可降解性能和力學特性，成為骨組織工程研究領域的重要分支之一。但由于其機械性能不足，將絲素蛋白與無機材料進行復合成為近些年骨組織工程的重要研究方向。本文將對國內外生物硅化絲素蛋白復合材料制備及其在骨組織工程中的應用研究進行綜述和展望。
1 絲素蛋白的結構和生物學特性
蠶絲主要由絲素蛋白和絲膠蛋白組成。絲膠蛋白約占蠶絲的 25%，被認為是引起機體免疫反應的主要成分，因此其醫學應用受到一定限制。絲素蛋白占 70%～80%，主要含有 18 種氨基酸，其中 Gly、Ala 和 Ser 含量最多，約占 87%，在體內可被多種蛋白酶和膠原酶降解并能被完全吸收[1]，免疫原性低，生物相容性好[2]。絲素蛋白由一條重鏈（325 ku）和一條輕鏈（25 ku）通過二硫鍵連接。其結構包含結晶區和非結晶區：結晶區的絲素蛋白鏈間形成較為致密的 β-折疊，使其具備了較高的韌性和抗拉伸能力；非結晶區排列無序，肽鏈間作用力弱而且極性基團較多，使絲素蛋白延展性和彈性大大增強。絲素蛋白的生物力學性能甚至優于很多高性能合成纖維[3]。此外，絲素蛋白易于加工，可根據需求制備成膜、微球、凝膠、納米纖維或者三維結構的支架[4-5]。因此，絲素蛋白在醫用材料方面得到了很大的發展，作為手術縫合線已有近百年的使用歷史，近年來也被廣泛應用于人工皮膚、軟骨、骨、人造血管和韌帶等[2, 4, 6-7]。
2 絲素蛋白支架在骨組織工程中的應用
在骨組織修復應用中，絲素蛋白雖然表現出了較好的韌性，但再生的絲素蛋白經過溶解和冷凍干燥法重新制備成支架后，其力學性能大幅降低、韌性減小，植入體內后難以承受應力作用。同時，單一絲素蛋白成分植入體內再次水化后很難成形，從而失去支架形狀和機械強度。此外，骨細胞在單一絲素制備的支架材料上附著能力不佳，造成誘導成骨的能力有限[2, 8-9]。許多學者嘗試將絲素蛋白與其他高分子材料例如聚乳酸、聚已內酯等共混后制備成復合材料以增強其支架性能。這些高分子材料具備可降解、容易加工以及生物相容性好的特點，但也存在力學強度不足、代謝產物往往呈酸性、易引起無菌性炎癥等缺陷[10]。
為滿足骨缺損部位對修復材料的力學及功能要求，包括良好的強度和韌性，以及抗壓、抗張和抗扭轉等力學指標，通過仿生方法，將絲素蛋白與無機材料復合制備支架材料在近年來受到更多關注[5, 11]。利用仿生礦化原理和方法制備具有模擬天然骨組織結構和功能的復合材料是骨組織工程領域的研究前沿和熱點[11-12]。當前，相關研究多集中于絲素蛋白/羥基磷灰石復合材料，包括絲素蛋白與羥基磷灰石的共混材料或通過仿生礦化制備的復合材料。研究發現，與羥基磷灰石復合可顯著提升絲素蛋白的生物力學性能，同時其誘導成骨的能力也得到較大提高。但天然絲素蛋白礦化能力有限，通過絲素蛋白與羥基磷灰石共混的材料由于兩者之間難以形成共價鍵等緊密的結合，生物力學強度難以滿足實際應用需求[9, 13]。
3 硅基材料的生物學特性
在自然界中，參與生物礦化除了以鈣作為主要成分的無機相之外，另一大類是以硅為主要成分的無機組分。硅基材料在生物體內是通過各種生物分子的調控礦化，并在溫和條件［包括水相、pH 值接近中性和接近室溫（4～40℃）］下形成。此種條件對于有機/無機復合材料的形成特別重要，例如以蛋白作為有機相模板通常無法忍受嚴苛的條件[14]。硅基材料具有優異的生物相容性、骨傳導性和誘導性。植入體內的硅基生物活性玻璃可以和骨整合并且無任何毒性，不會在接觸面產生結締組織或者發生炎癥。此外，在硅基玻璃表面可有效地誘導羥基磷灰石類似物形成。但硅基材料本身質地較脆，難以單獨使用[15]。如將絲素蛋白與硅基材料一起制備成有機/無機復合材料，將綜合二者的優點，為新一代骨生物支架材料提供新的研究方向。
4 絲素蛋白/硅基復合材料在骨組織工程中的應用
4.1 天然絲素蛋白硅化材料
天然絲素蛋白中缺乏與生物硅化相關的特殊序列和基團，因此這方面的研究相對較少。邵正中團隊[16]通過溶膠凝膠法將絲素蛋白溶液和硅溶膠共沉淀制備出了共混薄膜。由于絲素蛋白含有谷氨酸和天冬氨酸等帶羧基的氨基酸，可與硅溶膠發生反應，因此觀察到溶膠水解后形成的二氧化硅顆粒（直徑大約 100 nm）均勻地分布在絲素蛋白連續相之間，但并沒有與絲素蛋白緊密結合。Hou 等[17]同樣采用溶膠凝膠法制備了絲素蛋白/二氧化硅雜化材料，采用正硅酸乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）作為前體溶液，采用 3-氨丙基三乙氧基硅烷（（3-aminopropyl）triethoxysilane，APTES）作為偶聯劑，同時加入了 2,4,6-三［（2-3-環氧丙烷-二烷基銨）丙基］-1,3,5-三嗪氯（2,4,6-tri［（2-epihydrin-3-bimethyl-ammonium）propyl］-1,3,5-triazine chloride，Tri-EBAC）作為交聯劑。絲素蛋白中的氨基與納米級二氧化硅顆粒表面含有的氨基通過 Tri-EBAC 交聯形成共價鍵，傅里葉變換紅外光譜等結果也證實了共價鍵的形成。
4.2 絲素蛋白與硅基共混材料
許多學者也嘗試將絲素蛋白與二氧化硅等硅基材料共混制備復合材料。朱勇團隊[18]將二氧化硅顆粒與絲素蛋白共混，同時加入了硅烷偶聯劑 KH-550，紅外結果顯示絲素蛋白與納米二氧化硅之間產生了一定的共價結合。陳建勇團隊[19-20]分別采用冷凍干燥法和靜電紡絲法制備了絲素蛋白與硅酸鈣納米顆粒復合材料。此復合材料可在模擬體液中有效地誘導羥基磷灰石進行礦化，體外細胞培養也表明其具有較好的生物相容性。將絲素蛋白、硅酸鈣納米粒子以及交聯劑共混后制備的納米薄膜相對于絲素蛋白自身，共混材料的生物力學性能得到較大提高，但硅酸鈣只是分散在絲素蛋白形成的空隙內，通過機械或者超聲的混合方式也無法將硅酸鈣納米粒子分散均勻。隨著共混材料中硅酸鈣含量的進一步提高，其力學性能不升反降[21]。絲素蛋白與硅酸鈣混合制備的復合材料也可在模擬體液中有效誘導磷灰石沉積，使其親水性和生物活性增強[20]。將不同粒徑大小的二氧化硅顆粒（24 nm～2 μm）與絲素蛋白溶液混合干燥，可制備出生物相容性優良的復合材料。體外干細胞培養表明，絲素蛋白/二氧化硅復合材料可有效地誘導干細胞向成骨方向分化，并形成礦化位點。由于采用了納米級別的顆粒，其生物降解性較好，為骨組織工程提供了一種新選擇[22]。將絲素蛋白與另外一種生物相容性較好的三元無機材料（CaO-MgO-SiO2）-透輝石納米顆粒混合后，力學性能增強，潤濕度增加[23]。絲素蛋白與鋰皂石（Na+0.7［（Si8Mg5.5Li0.3）O20（OH）4］?0.7）納米片混合可制備出生物活性較好的水凝膠，有效地促進成骨細胞增殖，并增強成骨方向的分化[24]。
4.3 基因工程化絲素蛋白生物硅化材料
為了提高絲素蛋白或者與其序列和結構非常相似的蛛絲蛋白生物硅化的能力，可將蛛絲蛋白工程化并在溫和條件下進行生物硅化，這一方法在 2006 年被首次報道[25]。將蛛絲蛋白末端融合一段與二氧化硅生物礦化相關的片段 R5 后，其生物硅化能力大大增強。對比實驗表明，R5 序列本身誘導大的二氧化硅顆粒（直徑 0.5～10 μm）形成，融合蛋白誘導形成納米級別的二氧化硅顆粒（直徑 0.5～2 μm）。但不含 R5 序列的蛋白，無法誘導二氧化硅顆粒在其膜表面沉積。此外，只有 R5 在其 C 端融合才會誘導二氧化硅沉積[25]。R5 與分子量更大的蛛絲蛋白片段融合也同樣證明了它在任何一端都不會影響蛋白的潤濕性以及表面能，但在 C 端可更好地誘導生物硅化，這表明蛋白的不同折疊方式可能影響了蛋白表面電荷暴露的程度[26]。和生物硅化相關的另外一個 Pep1 片段也具有類似作用，可誘導約 100 nm 大小的二氧化硅顆粒形成。通過將 Pep1 和絲素蛋白片段制備的融合蛋白與 Pep1 和絲素蛋白化學偶聯對比研究發現，即便一個絲素蛋白可以化學偶聯更多的 Pep1 片段，但融合蛋白仍可誘導更大粒徑的二氧化硅顆粒形成。這可能是由于化學偶聯的分子是以單體形式存在，但融合蛋白是幾個或者多個分子聚集的結果[27]。以上研究也都證明了，這些與生物硅化相關的片段蛋白并沒有起到加速和催化二氧化硅沉積的作用，只是形成了特異的礦化位點并起到模板的作用[25, 27]。二氧化硅形成的機制可能是通過靜電相互作用，在 R5 等具有正電荷的蛋白表面沉積。將不同的二氧化硅結合多肽（silica-binding peptide，SiBPs）A1、A3 和 R5 與蛛絲來源的骨架片段融合后，分別比較了它們在液相-液相以及液相-固相界面上沉積二氧化硅能力的差異。含有 A3 片段的融合蛋白在液相-液相界面沉積效率最高，但在液相-固相界面最低。隨著融合蛋白 β 折疊結構的增加，其生物礦化能力反而下降。分子量較大的融合蛋白礦化形成的二氧化硅顆粒較大，說明蛋白分子量變化與二氧化硅顆粒大小密切相關[28]。通過在絲素蛋白或者蛛絲蛋白片段末端融合與生物硅化相關的不同片段以及調整礦化前體溶液的 pH 值，可起到調節和優化蛋白表面電荷密度和疏水區的作用，從而對礦化二氧化硅形貌、大小以及分布起到控制作用[29]。此外，通過加入甘油，可以控制二氧化硅納米顆粒在融合蛋白內的分布程度。由于通過生物礦化所獲得的二氧化硅顆粒孔隙率大，表面富含羥基基團，可有效地進一步誘導羥基磷灰石的沉積。這些生物硅化后的融合蛋白具備良好的生物相容性和骨誘導、骨傳導能力，可促進干細胞向成骨方向的分化[26, 30]。
5 總結與展望
在臨床骨組織修復和骨組織工程應用中，骨生物材料需要具備優異的生物相容性，包括無細胞毒性、較低的炎癥反應和免疫原性并能提供細胞附著、增殖和分化的微環境。材料還需要具有良好的骨傳導性和骨誘導性，有利于細胞的遷移、增殖、分化和組織再生并與自體骨形成緊密的骨性愈合材料。同時還必須具備一定的機械強度、韌性和彈性，其力學性能必須與天然骨接近或者相匹配，可生物降解并與修復部位適應，其降解產物無毒副作用，最終能被逐步吸收。為了滿足產業化的需要，原材料最好相對容易獲得、加工簡便且價格低廉。絲素蛋白具有優異的生物力學性能、良好的可降解性和生物相容性、易于加工以及取材方便、價格低廉等特性，無疑是骨組織工程最佳候選者之一。通過將絲素蛋白與硅基材料復合，不但力學性能大大加強，而且骨誘導和骨傳導能力也得到大幅提高。
通過生物礦化得到的絲素蛋白/硅基復合材料不但表面富含可提高生物活性的羥基，而且孔隙率大，可通過摻入其他活性分子例如骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、藥物或者生物活性載體等進一步提高復合材料的生物活性。生物礦化的方式不同于化學方法，一般不會引入對細胞有毒性的其他物質，同時由于是在溫和條件下進行，蛋白等有機成分得到有效保護，不易發生變性。
與此同時，我們也應當認識到，生物體內有機/無機復合物的形成是一個多重的復雜過程，包括：細胞外基質的組裝；選擇性地轉運無機離子到特定部分；隨后礦物進行成核和礦化，使有機、無機相之間形成密切的結合。最終形成的礦化材料具有精妙的組裝方式和復雜的多級結構，從而表現出優異的生物力學性能和其他特性，目前通過人工方法是難以企及的。通過基因工程的方法，將絲素蛋白片段與具備礦化能力的多肽融合，可大大增強材料本身的生物礦化能力，但同時也存在諸多缺陷。由于融合蛋白中只有末端的相關片段具有礦化能力，最終形成的復合材料難以均一，與天然骨組織中膠原纖維的全區域礦化相比差異較大。當前絲素/礦化相關片段融合蛋白通過生物硅化所形成的二氧化硅大多還是以納米顆粒的形式存在，所形成復合材料的有機和無機相之間結合并不緊密，其力學性能也有待進一步驗證。最后，由于是通過基因工程方法制備融合蛋白，當前高昂的成本也將成為其產業化的巨大制約因素。
絲素蛋白由氨基酸所組成，可進一步探索通過化學修飾某些氨基酸或者偶聯其他分子提高其生物硅化能力，或者通過化學手段控制硅基材料在其表面的共價交聯和沉積，都可能提高復合材料的力學性能并優化其生物學特性。由于絲素蛋白可組裝成為不同形貌的納米級材料，在不同組裝方式下通過生物硅化所形成的復合材料的生物力學性能也需要進一步評估和優化。隨著骨組織工程技術的飛速發展，除了物理和化學手段控制下的不同組裝，通過三維打印方法將納米級別的絲素蛋白/二氧化硅復合材料作為最小單元制備骨修復材料，可能成為一個新的研究方向。
引言
隨著生物醫學的快速發展，可生物降解并具有再生功能的生物醫用材料成為下一代骨組織工程研究的重要方向和熱點領域。通過骨支架材料、生物活性因子、細胞以及血管等不同因素的有效整合，實現骨組織的工程化，最終達到修復缺陷骨組織和骨再生的目的。骨支架材料不但要具有良好的生物相容性和組織誘導性，還需要優異的生物力學性能，這是骨組織工程研究的核心和難點之一。可生物降解的有機/無機復合材料由于具有良好的生物相容性和力學性能，已成為近年國內外的研究熱點。絲素蛋白由于具備優異的生物相容性、可降解性能和力學特性，成為骨組織工程研究領域的重要分支之一。但由于其機械性能不足，將絲素蛋白與無機材料進行復合成為近些年骨組織工程的重要研究方向。本文將對國內外生物硅化絲素蛋白復合材料制備及其在骨組織工程中的應用研究進行綜述和展望。
1 絲素蛋白的結構和生物學特性
蠶絲主要由絲素蛋白和絲膠蛋白組成。絲膠蛋白約占蠶絲的 25%，被認為是引起機體免疫反應的主要成分，因此其醫學應用受到一定限制。絲素蛋白占 70%～80%，主要含有 18 種氨基酸，其中 Gly、Ala 和 Ser 含量最多，約占 87%，在體內可被多種蛋白酶和膠原酶降解并能被完全吸收[1]，免疫原性低，生物相容性好[2]。絲素蛋白由一條重鏈（325 ku）和一條輕鏈（25 ku）通過二硫鍵連接。其結構包含結晶區和非結晶區：結晶區的絲素蛋白鏈間形成較為致密的 β-折疊，使其具備了較高的韌性和抗拉伸能力；非結晶區排列無序，肽鏈間作用力弱而且極性基團較多，使絲素蛋白延展性和彈性大大增強。絲素蛋白的生物力學性能甚至優于很多高性能合成纖維[3]。此外，絲素蛋白易于加工，可根據需求制備成膜、微球、凝膠、納米纖維或者三維結構的支架[4-5]。因此，絲素蛋白在醫用材料方面得到了很大的發展，作為手術縫合線已有近百年的使用歷史，近年來也被廣泛應用于人工皮膚、軟骨、骨、人造血管和韌帶等[2, 4, 6-7]。
2 絲素蛋白支架在骨組織工程中的應用
在骨組織修復應用中，絲素蛋白雖然表現出了較好的韌性，但再生的絲素蛋白經過溶解和冷凍干燥法重新制備成支架后，其力學性能大幅降低、韌性減小，植入體內后難以承受應力作用。同時，單一絲素蛋白成分植入體內再次水化后很難成形，從而失去支架形狀和機械強度。此外，骨細胞在單一絲素制備的支架材料上附著能力不佳，造成誘導成骨的能力有限[2, 8-9]。許多學者嘗試將絲素蛋白與其他高分子材料例如聚乳酸、聚已內酯等共混后制備成復合材料以增強其支架性能。這些高分子材料具備可降解、容易加工以及生物相容性好的特點，但也存在力學強度不足、代謝產物往往呈酸性、易引起無菌性炎癥等缺陷[10]。
為滿足骨缺損部位對修復材料的力學及功能要求，包括良好的強度和韌性，以及抗壓、抗張和抗扭轉等力學指標，通過仿生方法，將絲素蛋白與無機材料復合制備支架材料在近年來受到更多關注[5, 11]。利用仿生礦化原理和方法制備具有模擬天然骨組織結構和功能的復合材料是骨組織工程領域的研究前沿和熱點[11-12]。當前，相關研究多集中于絲素蛋白/羥基磷灰石復合材料，包括絲素蛋白與羥基磷灰石的共混材料或通過仿生礦化制備的復合材料。研究發現，與羥基磷灰石復合可顯著提升絲素蛋白的生物力學性能，同時其誘導成骨的能力也得到較大提高。但天然絲素蛋白礦化能力有限，通過絲素蛋白與羥基磷灰石共混的材料由于兩者之間難以形成共價鍵等緊密的結合，生物力學強度難以滿足實際應用需求[9, 13]。
3 硅基材料的生物學特性
在自然界中，參與生物礦化除了以鈣作為主要成分的無機相之外，另一大類是以硅為主要成分的無機組分。硅基材料在生物體內是通過各種生物分子的調控礦化，并在溫和條件［包括水相、pH 值接近中性和接近室溫（4～40℃）］下形成。此種條件對于有機/無機復合材料的形成特別重要，例如以蛋白作為有機相模板通常無法忍受嚴苛的條件[14]。硅基材料具有優異的生物相容性、骨傳導性和誘導性。植入體內的硅基生物活性玻璃可以和骨整合并且無任何毒性，不會在接觸面產生結締組織或者發生炎癥。此外，在硅基玻璃表面可有效地誘導羥基磷灰石類似物形成。但硅基材料本身質地較脆，難以單獨使用[15]。如將絲素蛋白與硅基材料一起制備成有機/無機復合材料，將綜合二者的優點，為新一代骨生物支架材料提供新的研究方向。
4 絲素蛋白/硅基復合材料在骨組織工程中的應用
4.1 天然絲素蛋白硅化材料
天然絲素蛋白中缺乏與生物硅化相關的特殊序列和基團，因此這方面的研究相對較少。邵正中團隊[16]通過溶膠凝膠法將絲素蛋白溶液和硅溶膠共沉淀制備出了共混薄膜。由于絲素蛋白含有谷氨酸和天冬氨酸等帶羧基的氨基酸，可與硅溶膠發生反應，因此觀察到溶膠水解后形成的二氧化硅顆粒（直徑大約 100 nm）均勻地分布在絲素蛋白連續相之間，但并沒有與絲素蛋白緊密結合。Hou 等[17]同樣采用溶膠凝膠法制備了絲素蛋白/二氧化硅雜化材料，采用正硅酸乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）作為前體溶液，采用 3-氨丙基三乙氧基硅烷（（3-aminopropyl）triethoxysilane，APTES）作為偶聯劑，同時加入了 2,4,6-三［（2-3-環氧丙烷-二烷基銨）丙基］-1,3,5-三嗪氯（2,4,6-tri［（2-epihydrin-3-bimethyl-ammonium）propyl］-1,3,5-triazine chloride，Tri-EBAC）作為交聯劑。絲素蛋白中的氨基與納米級二氧化硅顆粒表面含有的氨基通過 Tri-EBAC 交聯形成共價鍵，傅里葉變換紅外光譜等結果也證實了共價鍵的形成。
4.2 絲素蛋白與硅基共混材料
許多學者也嘗試將絲素蛋白與二氧化硅等硅基材料共混制備復合材料。朱勇團隊[18]將二氧化硅顆粒與絲素蛋白共混，同時加入了硅烷偶聯劑 KH-550，紅外結果顯示絲素蛋白與納米二氧化硅之間產生了一定的共價結合。陳建勇團隊[19-20]分別采用冷凍干燥法和靜電紡絲法制備了絲素蛋白與硅酸鈣納米顆粒復合材料。此復合材料可在模擬體液中有效地誘導羥基磷灰石進行礦化，體外細胞培養也表明其具有較好的生物相容性。將絲素蛋白、硅酸鈣納米粒子以及交聯劑共混后制備的納米薄膜相對于絲素蛋白自身，共混材料的生物力學性能得到較大提高，但硅酸鈣只是分散在絲素蛋白形成的空隙內，通過機械或者超聲的混合方式也無法將硅酸鈣納米粒子分散均勻。隨著共混材料中硅酸鈣含量的進一步提高，其力學性能不升反降[21]。絲素蛋白與硅酸鈣混合制備的復合材料也可在模擬體液中有效誘導磷灰石沉積，使其親水性和生物活性增強[20]。將不同粒徑大小的二氧化硅顆粒（24 nm～2 μm）與絲素蛋白溶液混合干燥，可制備出生物相容性優良的復合材料。體外干細胞培養表明，絲素蛋白/二氧化硅復合材料可有效地誘導干細胞向成骨方向分化，并形成礦化位點。由于采用了納米級別的顆粒，其生物降解性較好，為骨組織工程提供了一種新選擇[22]。將絲素蛋白與另外一種生物相容性較好的三元無機材料（CaO-MgO-SiO2）-透輝石納米顆粒混合后，力學性能增強，潤濕度增加[23]。絲素蛋白與鋰皂石（Na+0.7［（Si8Mg5.5Li0.3）O20（OH）4］?0.7）納米片混合可制備出生物活性較好的水凝膠，有效地促進成骨細胞增殖，并增強成骨方向的分化[24]。
4.3 基因工程化絲素蛋白生物硅化材料
為了提高絲素蛋白或者與其序列和結構非常相似的蛛絲蛋白生物硅化的能力，可將蛛絲蛋白工程化并在溫和條件下進行生物硅化，這一方法在 2006 年被首次報道[25]。將蛛絲蛋白末端融合一段與二氧化硅生物礦化相關的片段 R5 后，其生物硅化能力大大增強。對比實驗表明，R5 序列本身誘導大的二氧化硅顆粒（直徑 0.5～10 μm）形成，融合蛋白誘導形成納米級別的二氧化硅顆粒（直徑 0.5～2 μm）。但不含 R5 序列的蛋白，無法誘導二氧化硅顆粒在其膜表面沉積。此外，只有 R5 在其 C 端融合才會誘導二氧化硅沉積[25]。R5 與分子量更大的蛛絲蛋白片段融合也同樣證明了它在任何一端都不會影響蛋白的潤濕性以及表面能，但在 C 端可更好地誘導生物硅化，這表明蛋白的不同折疊方式可能影響了蛋白表面電荷暴露的程度[26]。和生物硅化相關的另外一個 Pep1 片段也具有類似作用，可誘導約 100 nm 大小的二氧化硅顆粒形成。通過將 Pep1 和絲素蛋白片段制備的融合蛋白與 Pep1 和絲素蛋白化學偶聯對比研究發現，即便一個絲素蛋白可以化學偶聯更多的 Pep1 片段，但融合蛋白仍可誘導更大粒徑的二氧化硅顆粒形成。這可能是由于化學偶聯的分子是以單體形式存在，但融合蛋白是幾個或者多個分子聚集的結果[27]。以上研究也都證明了，這些與生物硅化相關的片段蛋白并沒有起到加速和催化二氧化硅沉積的作用，只是形成了特異的礦化位點并起到模板的作用[25, 27]。二氧化硅形成的機制可能是通過靜電相互作用，在 R5 等具有正電荷的蛋白表面沉積。將不同的二氧化硅結合多肽（silica-binding peptide，SiBPs）A1、A3 和 R5 與蛛絲來源的骨架片段融合后，分別比較了它們在液相-液相以及液相-固相界面上沉積二氧化硅能力的差異。含有 A3 片段的融合蛋白在液相-液相界面沉積效率最高，但在液相-固相界面最低。隨著融合蛋白 β 折疊結構的增加，其生物礦化能力反而下降。分子量較大的融合蛋白礦化形成的二氧化硅顆粒較大，說明蛋白分子量變化與二氧化硅顆粒大小密切相關[28]。通過在絲素蛋白或者蛛絲蛋白片段末端融合與生物硅化相關的不同片段以及調整礦化前體溶液的 pH 值，可起到調節和優化蛋白表面電荷密度和疏水區的作用，從而對礦化二氧化硅形貌、大小以及分布起到控制作用[29]。此外，通過加入甘油，可以控制二氧化硅納米顆粒在融合蛋白內的分布程度。由于通過生物礦化所獲得的二氧化硅顆粒孔隙率大，表面富含羥基基團，可有效地進一步誘導羥基磷灰石的沉積。這些生物硅化后的融合蛋白具備良好的生物相容性和骨誘導、骨傳導能力，可促進干細胞向成骨方向的分化[26, 30]。
5 總結與展望
在臨床骨組織修復和骨組織工程應用中，骨生物材料需要具備優異的生物相容性，包括無細胞毒性、較低的炎癥反應和免疫原性并能提供細胞附著、增殖和分化的微環境。材料還需要具有良好的骨傳導性和骨誘導性，有利于細胞的遷移、增殖、分化和組織再生并與自體骨形成緊密的骨性愈合材料。同時還必須具備一定的機械強度、韌性和彈性，其力學性能必須與天然骨接近或者相匹配，可生物降解并與修復部位適應，其降解產物無毒副作用，最終能被逐步吸收。為了滿足產業化的需要，原材料最好相對容易獲得、加工簡便且價格低廉。絲素蛋白具有優異的生物力學性能、良好的可降解性和生物相容性、易于加工以及取材方便、價格低廉等特性，無疑是骨組織工程最佳候選者之一。通過將絲素蛋白與硅基材料復合，不但力學性能大大加強，而且骨誘導和骨傳導能力也得到大幅提高。
通過生物礦化得到的絲素蛋白/硅基復合材料不但表面富含可提高生物活性的羥基，而且孔隙率大，可通過摻入其他活性分子例如骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、藥物或者生物活性載體等進一步提高復合材料的生物活性。生物礦化的方式不同于化學方法，一般不會引入對細胞有毒性的其他物質，同時由于是在溫和條件下進行，蛋白等有機成分得到有效保護，不易發生變性。
與此同時，我們也應當認識到，生物體內有機/無機復合物的形成是一個多重的復雜過程，包括：細胞外基質的組裝；選擇性地轉運無機離子到特定部分；隨后礦物進行成核和礦化，使有機、無機相之間形成密切的結合。最終形成的礦化材料具有精妙的組裝方式和復雜的多級結構，從而表現出優異的生物力學性能和其他特性，目前通過人工方法是難以企及的。通過基因工程的方法，將絲素蛋白片段與具備礦化能力的多肽融合，可大大增強材料本身的生物礦化能力，但同時也存在諸多缺陷。由于融合蛋白中只有末端的相關片段具有礦化能力，最終形成的復合材料難以均一，與天然骨組織中膠原纖維的全區域礦化相比差異較大。當前絲素/礦化相關片段融合蛋白通過生物硅化所形成的二氧化硅大多還是以納米顆粒的形式存在，所形成復合材料的有機和無機相之間結合并不緊密，其力學性能也有待進一步驗證。最后，由于是通過基因工程方法制備融合蛋白，當前高昂的成本也將成為其產業化的巨大制約因素。
絲素蛋白由氨基酸所組成，可進一步探索通過化學修飾某些氨基酸或者偶聯其他分子提高其生物硅化能力，或者通過化學手段控制硅基材料在其表面的共價交聯和沉積，都可能提高復合材料的力學性能并優化其生物學特性。由于絲素蛋白可組裝成為不同形貌的納米級材料，在不同組裝方式下通過生物硅化所形成的復合材料的生物力學性能也需要進一步評估和優化。隨著骨組織工程技術的飛速發展，除了物理和化學手段控制下的不同組裝，通過三維打印方法將納米級別的絲素蛋白/二氧化硅復合材料作為最小單元制備骨修復材料，可能成為一個新的研究方向。