支撐脂雙層膜（SLBs）因其結構與功能均類似天然細胞膜而廣泛應用于生物醫學及生物工程研究。本文以玻璃載玻片為基底，以 1, 2-油-錫-磷脂-3-卵磷脂（DOPC）與{亞氨基二乙酸丁二酰（鎳鹽）}（DGS-NTA）為原料，采用熒光漂白恢復技術（FRAP）研究原料配比、制備方法、漂白區域大小及蛋白加載濃度對 SLBs 流動性及擴散系數的影響。結果表明：① 聲波破碎法優于薄膜擠壓法，預處理脂質體得到的小囊泡粒徑更小、更均勻，并且 SLBs 形成過程中須避免接觸空氣；② 膜的熒光恢復速度和擴散系數隨漂白區域的增大而減小，隨著 DOPC 與 DGS-NTA 摩爾質量比由 98∶2 變為 84∶16，SLBs 流動性及熒光恢復率逐漸減小，當兩者配比為 82∶18 時，膜已失去流動性；③ 加載蛋白濃度在 10～40 nmol·L–1范圍時，SLBs 的熒光強度隨蛋白濃度線性增加，蛋白在 SLBs 上具有很好的流動性。該研究為細胞膜分子之間的相互作用及后續信號響應的研究搭建了一個良好的生物膜平臺。
引用本文： 鄒卉, 吳建華, 方穎. 支撐脂雙層膜的制備及其功能化研究. 生物醫學工程學雜志, 2019, 36(1): 85-93. doi: 10.7507/1001-5515.201801028 復制
引言
生物膜維持著細胞內各部分結構的有序性，在細胞和外界環境的物質交換及信息傳遞、蛋白質等大分子的生物合成過程中均發揮著重要作用[1]。細胞膜本身結構復雜難以分離[2-3]，而人工構筑的脂雙層膜因能控制膜組分以及便于觀察和分析，已被廣泛應用于研究細胞與細胞接觸面分子的相互作用[4]、T 細胞與抗原呈遞細胞之間免疫突觸的形成以及血細胞在血管壁的爬行和遷移等[5-6]。人工生物膜模型主要包括 Langmuir-Blodgett（L-B）單層膜[7-8]、支撐脂雙層膜（supported lipid bilayers，SLBs）[3, 9-10]和囊泡[11]等。其中，SLBs 制備過程簡單、重現性好，制得的膜穩定性好且具有與細胞膜相似的流動性，能夠為后續功能化研究提供良好的基礎，因此備受學術界青睞[12-14]。
然而，SLBs 制備過程中仍有很多問題有待解決。首先，脂質體需要采用囊泡融合等預處理以形成小囊泡（small unilamellar vesicles，SUV），再由 SUV 在親水玻璃板上形成膜，因此 SUV 的大小和均勻度對膜的厚度和均一性至關重要。目前常采用薄膜擠壓法[15-16]、聲波破碎法[10, 17]和反復凍融法[18]對脂質體預處理得到 SUV，其中薄膜擠壓法能防止接觸空氣，超聲波破碎法能有效避免交叉污染，因此它們成為 21 世紀重要的人工脂雙層膜制備方法[10]。其次，脂質體成分中大多含有不飽和酰基鏈，制備過程中與空氣接觸易發生氧化反應，從而造成顆粒聚集、流動性降低等后果[2, 19]。再者是原材料及配比問題，SLBs 膜穩定性和流動性受到范德華力、水合力以及脂質與基底間的靜電相互作用等作用力之間的平衡調控，優質 SLBs 的最佳制備條件很大程度上取決于脂質的組成[14]。因此，探索成膜最佳和閾值成分配比及解決 SLBs 制備過程中易氧化問題，對于進一步構建具有生物學功能的細胞膜模型無疑是非常重要的。
最后，蛋白的加載方式也非常關鍵。目前常用生物素-親和素共價結合及鎳脂與多組氨酸重組蛋白螯合的方法將蛋白插入 SLBs，形成有功能的生物膜。然而，前一種方法當親和素濃度高時易發生聚集從而影響蛋白在膜上的流動[20]；后一種方法盡管兩者的螯合可以有效控制蛋白朝向和所需蛋白濃度，但鎳脂的占比以及與多組氨酸重組蛋白的配比不僅會影響膜自身的流動性，也會調控和制約膜上蛋白的運動[12, 21]。這里我們選擇了兩種在炎癥反應及免疫響應過程中的重要蛋白分子——P-選擇素（P-selectin）和細胞間黏附分子（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1），前者介導白細胞的初始黏附，后者在白細胞穩定黏附及免疫突觸的形成中發揮關鍵作用[22]，分別將這兩種蛋白以合理方式加載到 SLBs 上形成有生物學功能的膜，并探討膜承載這兩種蛋白的能力及蛋白加載濃度對其自身擴散系數的影響。本研究不僅可為生物膜的構建和深入研究提供有益參考，還可為后續進一步研究免疫細胞在血管內皮的粘附、爬行及細胞接觸面的免疫反應等建立良好的實驗平臺。
1 材料與方法
1.1 主要材料
1，2-油-錫-磷脂-3-卵磷脂（1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DOPC）與亞氨基二乙酸丁二酰（鎳鹽）{1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-［(N-（5-amino-1-carboxypentyl） iminodiacetic acid)］ succinyl （nickel salt），DGS-NTA}（美國，Avanti Polar Lipids）；Texas Red ?DHPE 染料、小室（chamber）、ALexa Fluor ?488 微量蛋白質標記試劑盒與磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer solution，PBS）（美國，Life Technologies）；P-selectin 與 ICAM-1（北京義翹神州生物技術有限公司）；玻璃載玻片（美國，Warner Instruments）；濃硫酸、過氧化氫等試劑（廣東省廣州市東紅化工廠）。
1.2 玻璃載玻片的預處理
將玻璃載玻片浸入 Piranha 洗液（濃硫酸∶雙氧水=7∶3；V∶V）中，在 100 ℃ 下浸泡 45～60 min，超純水沖洗干凈后氮氣吹干并放入干燥器中備用。
1.3 SUV和SLBs樣品的準備
1.3.1 脂質體預處理
如圖 1 所示，原料 DOPC 和 DGS-NTA 按比例混合于圓底燒瓶內并用氮氣迅速吹干成膜，真空干燥 2.5 h 后加入 2 mL 去離子水將其重新水合。加入去離子水后，脂質體自行從瓶底脫落并迅速組裝形成各種直徑的脂質體，之后采用薄膜擠壓法或聲波破碎法對其進行預處理得到 SUV。
圖1
SUV 和 SLBs 樣品的準備
Figure1.
The preparation of SUV and SLBs
（1）薄膜擠壓法：將上述脂質體置于 55℃ 的無光環境中，使用擠壓機（美國，Avanti Polar Lipids）對脂質體來回擠壓過濾 10 次得到 SUV，其中濾膜孔徑為 0.1 μm；
（2）聲波破碎法：將上述脂質體置于 4℃ 冰箱過夜，次日使用聲波破碎儀（美國，SONICS & MATERIALS）對脂質體破碎 30～40 s，間隔 10 s，共 10～15 min，直到溶液由渾濁變為澄清得到 SUV；之后將所得樣品 20 000×g 離心 12～15 h 收集上清。
1.3.2 SLBs 膜的形成
取 15 μL 上述 SUV 與等體積的 PBS（pH=7.4）充分混合后滴加到培養皿中心處，迅速蓋上蓋玻片，室溫孵育 5 min 后，分別在下面兩種環境中形成 SLB。
（1）暴露在空氣中：將玻璃片從培養皿中取出置于小室中并擰緊小室，用去離子水充分清洗，去除未結合到玻璃片上的脂質體，清洗干凈后緩慢將水全部置換成 PBS；
（2）未暴露在空氣中：將培養皿置于去離子水液面下（之后所有操作玻璃片均在液面下），在水中將玻璃片從培養皿中取出并充分清洗，清洗干凈后在水下將玻璃片置于小室中并擰緊小室，之后將小室從水中取出并緩慢將水全部置換成 PBS。
1.4 脂雙層膜上蛋白分子的加載
在脂雙層膜上加載蛋白分子時，提前采用 ALexa Fluor ?488 微量蛋白質標記試劑盒對 P-selectin 或 ICAM-1 分子進行熒光標記。采用 1.3 節所述方法制備好脂雙層膜后將熒光標記好的重組蛋白（P-selectin 或 ICAM-1）稀釋到實驗所需濃度（10、20、40 nmol·L–1）并緩慢滴加到小室中，避光孵育 30 min 后用 PBS 充分清洗未結合到脂雙層上的蛋白。
1.5 熒光漂白恢復（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）實驗條件與方法
實驗溫度為 22～25℃，根據熒光染料設置共聚焦顯微鏡（德國，萊卡 TCS-SP8）激發光，選擇直徑為 12 μm[23]類似嗜中性粒細胞大小樣的圓形作為漂白區域，檢測激光強度為 10%，漂白激光強度為 100%，孔徑值為 2.3，掃描速度為 200 Hz，像素為 256 × 256，物鏡為 100 倍油鏡。漂白前掃描 5 幅（0.655 s/幅）獲取脂雙層膜初始熒光強度，恢復過程設置 200～500 幅，以保證漂白區域恢復完全最終達到平衡。
1.6 SUV的粒徑、Zeta電位檢測
為了比較脂質體預處理方法對 SUV 粒徑大小及均勻程度的影響，將上述按 1.3.1 節中兩種方法制備的 SUV 用超純水稀釋。采用納米粒度-Zeta 電位測試儀（英國，Malvern 公司）測量其平均粒徑和 Zeta 電位，檢測條件為氦-氖激光，波長為 632 nm。
1.7 相關物理量的定義和測量
（1）脂雙層膜初始熒光均勻程度：在每組脂雙層膜上選取 9 個直徑為 12 μm 的圓作為觀察區域，由 9 個取樣區域平均熒光強度的標準偏差值體現；（2）脂雙層膜漂白區域的熒光恢復率 = 漂白后恢復至穩定時熒光值/漂白前熒光值（扣除背景衰減后），擴散系數 D ≈ 0.25r02/t1/2，其中 r0 為漂白區域的半徑，t1/2 為達到最大恢復程度一半所需要的時間[5, 24-25]。
1.8 統計學方法
每個實驗條件均進行三組獨立平行實驗，數據采用平均值 ± 標準差表示。兩組間比較采用 t 檢驗分析，P < 0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果與分析
2.1 預處理方法對SUV粒徑分布及脂雙層膜流動性的影響
首先，我們按 1.6 節中的方法對薄膜擠壓法與超聲破碎法預處理所得 SUV 的粒徑分布進行檢測。結果如圖 2 所示：薄膜擠壓法制備的 SUV 粒徑分布較廣［（91.82～255.30）nm］，粒徑為（132.7 ± 7.12）nm，分散指數（polymer dispersity index，PDI）為 0.237；而聲波破碎法制備的 SUV 粒徑分布較窄［（37.84～91.28）nm］，粒徑為（49.4 ± 3.26）nm，PDI 為 0.207；統計學分析表明后者的脂質體顆粒要明顯小于前者（P < 0.01），且顆粒的分散性更好。同時，SUV 電位絕對值的大小反映顆粒物的分散穩定性的強弱，聲波破碎法測得的值為（–32.87 ± 3.82）mV，也略高于薄膜擠壓法（–30.57 ± 1.41）mV。因此，盡管兩種方法制備的 SUV 的粒徑及均勻度都不錯，但聲波破碎法還是優于薄膜擠壓法，不僅 SUV 的粒徑更小，而且顆粒分散更均勻、更穩定。
圖2
薄膜擠壓法與聲波破碎法預處理的SUV粒徑分布（** P < 0.01）
Figure2.
The particle size distribution of SUV pretreated with thin film extrusion and probe sonication (** P < 0.01)
之后，我們將上述 2 種均勻分散的脂質體按 1.3.2 節中的方法（空氣中制備與水腔中制備）制備 SLBs。在共聚焦顯微鏡下，通過 FRAP 實驗檢測所制備脂雙層膜的流動性，結果如圖 3 所示。實驗表明，SLBs 形成過程是否暴露于空氣對其熒光恢復率起著決定性的影響（P < 0.01），而脂質體的預處理方法則無影響（P > 0.05）。從圖 3b 的熒光恢復時間歷程中可以看出，脂雙層在玻璃平板上的形成過程若暴露于空氣導致熒光無法恢復，反映出制備的 SLBs 基本無流動性；與之相反，脂雙層膜形成過程若未暴露在空氣中，最終熒光均至少可恢復至初始熒光強度的 92.43%。盡管薄膜擠壓法與聲波破碎法制備的 SLBs 的熒光恢復率無顯著差異，但后者的熒光恢復速度要高于前者，經計算得兩者擴散系數分別為（0.74 ± 0.09）μm2·s–1與（1.22 ± 0.13）μm2·s–1。因此，相比于薄膜擠壓法，聲波破碎法制備的脂雙層具有更加優異的流動性。
圖3
薄膜擠壓法與聲波破碎法制備的SLBs流動性
a. SLBs 熒光恢復率隨不同方法變化；b. SLBs 相對熒光強度隨時間變化。**
a. the recovery ratio of SLBs changed with different methods; b. the relative fluorescence intensity of SLBs changed with time. **
基于上述結果，在后續的研究中，我們采用聲波破碎法預處理脂質體，并在不接觸空氣的水環境中制備 SLBs。
2.2 DOPC/DGS-NTA不同配比對SLBs流動性的影響
DOPC 是制備 SLBs 最常用的脂質之一，而原料中 DGS-NTA 占比與最終 SLBs 能承載重組蛋白分子的能力直接相關[2, 14]。因此，探明 DOPC/DGS-NTA 不同配比對 SLBs 流動性的影響對后續 SLBs 的功能化尤其關鍵。這里，我們以 Taxas Red? DHPE 染料做指示，按 1.5 節所述的方法在不同配比的 DOPC/DGS-NTA 中加 0.5% Taxas Red? DHPE，將形成的 SLBs 短時間暴露于高強度脈沖式激光而快速光漂白，漂白區域直徑為 12 μm。由于存在濃度梯度且 SLBs 具有流動性，周圍未漂白的熒光分子會擴散至漂白區域引起熒光恢復，在 10% 檢測激光下，觀察記錄 SLBs 樣品的熒光漂白恢復過程。每個實驗條件下均進行 3 次獨立平行實驗。
當 DOPC/DGS-NTA 的摩爾質量比分別為 98∶2 與 80∶20 時，熒光漂白恢復過程與熒光漂白恢復曲線如圖 4 所示，前者基礎熒光強度高［（204.72 ± 8.97）nm］、熒光恢復速度快、恢復率高（97%）（圖 4a、c），而后者基礎熒光強度低［（59.46 ± 5.09）nm］且熒光基本無恢復（圖 4b、d）。因此，我們斷定在 98∶2 與 80∶20 之間存在一個 DOPC/DGS-NTA 配比的閾值：該閾值前制備的 SLBs 具有較好的流動性，而該閾值后制備的 SLBs 流動性差，已失去作為生物膜模型的可能。為探明該閾值作為將來實驗設計的判據，我們對 98∶2～80∶20 范圍內不同配比的 SLBs 展開了系列實驗，觀察分析其對 SLBs 熒光恢復率、t1/2 和擴散系數的影響，結果如圖 5 所示。當 DGS-NTA 在原料中摩爾質量占比由 2% 增加到 16% 時，SLBs 流動性呈緩慢下降趨勢，表現為最終熒光恢復率由 97.46% 一直降到 82.25%，t1/2 由 7.42 s 增加到 22.27 s，擴散系數由 1.22 μm 2·s–1降到 0.41 μm 2·s–1；當 DGS-NTA 占比進一步增加到 18%，熒光恢復率、擴散系數急劇下降而 t1/2 為急劇上升，脂雙層膜流動性幾乎喪失。對 DGS-NTA 占比為 16% 和 18% 的兩組數據進行 t 檢驗，證實它們之間的熒光恢復率（見圖 5d）、t1/2 和擴散系數的差異有統計學意義（P < 0.01）。由此推斷，原料 DOPC/DGS-NTA 配比的閾值在 82∶18 左右，此時制備的 SLBs 不再具有流動性。
圖4
SLBs 熒光恢復圖與恢復曲線
a. SLBs（98∶2）熒光恢復圖；b. SLBs（80∶20）熒光恢復圖；c. SLBs（98∶2）相對熒光強度隨時間變化；d. SLBs（80∶20）相對熒光強度隨時間變化
Figure4. The fluorescence recovery image and curve of SLBsa. the recovery image of SLBs (98∶2); b. the recovery image of SLBs (80∶20); c. the relative fluorescence intensity of SLBs (98∶2) changed with time; d. the relative fluorescence intensity of SLBs (80∶20) changed with time
圖5
不同原料配比制備的SLBs FRAP
a. SLBs 熒光恢復率隨原料配比變化；b.
a. the recovery ratio of SLBs changed with lipid compositions; b. the
綜上所述，我們發現：當原料中 DGS-NTA 摩爾質量占比 < 18% 時，占比越小，制備的 SLBs 流動性越好；當 DGS-NTA 占比 ≥ 18%，制備的 SLBs 已失去流動性，因此 DOPC/DGS-NTA 摩爾質量比 82∶18 是制備具有生物學功能 SLBs 的臨界比例。然而，加載蛋白和細胞后一般會大大減弱膜的運動能力[10]，綜合考量反映膜流動能力的熒光恢復率、t1/2 和擴散系數等 3 個物理指標，在后續 SLBs 功能化研究中 DGS-NTA 摩爾質量占比均定為 2%。
2.3 漂白區域大小對SLBs熒光恢復的影響
漂白區域的大小通過調節暗熒光分子與亮熒光分子的相對量和交換速度影響熒光漂白后恢復過程，因此探明漂白區域大小與熒光恢復速度及程度的關系，為后續實驗選定合適參數無疑是非常重要的。這里，我們針對直徑為 3、6、12、24、48 μm 五個不同大小的圓形區域進行 FRAP 實驗，結果如圖 6 所示。圖 6a 為淬滅后熒光強度隨時間的恢復過程，盡管 250 s 后各漂白區域的熒光均可恢復至初始熒光 90% 以上，但恢復速度則呈現明顯的規律性差異：隨漂白區域直徑從 3 μm 增加到 48 μm，熒光恢復速度依次減慢，體現在 t1/2 隨漂白區域直徑的增加而單調增加（見圖 6b），而擴散系數則呈現相反的趨勢（見圖 6c）且每兩組間差異均具有統計學意義（P < 0.05）。其中，直徑為 3 μm 時，t1/2 與擴散系數分別為 2.838 s 與 3.206 μm 2·s–1；而直徑為 48 μm 時，t1/2 增至 44.103 s，擴散系數則減小到 0.206 μm 2·s–1。
圖6
不同大小漂白區域FRAP
a. 相對熒光強度隨時間變化；b.
a. the relative fluorescence intensity of SLBs changed with time; b.
一般認為 SLBs 的擴散系數不小于 1 μm 2·s–1、t1/2 不大于 10 s 是優良性能 SLBs 模型的合理參數[5, 26-27]。我們的實驗結果表明：漂白區域 12 μm 是一個臨界值，小于該值的都有較大的擴散系數，而大于該值因擴散系數過小而不宜于實驗研究，同時考慮到 12 μm 最接近嗜中性粒細胞的直徑，故在后續 SLBs 功能化研究中均選用直徑為 12 μm 的圓作為漂白區域。
2.4 SLBs承載不同蛋白分子的能力
盡管我們已經構建了均勻、穩定且流動性好的 SLBs，但只有加載或插入蛋白后才是真正能執行分子輸運及信號應答等生物過程的有價值的人工膜，才能在研究中作為細胞膜的替代品。這里，我們采用 2 種在炎癥反應和腫瘤轉移過程中重要的分子——P-selectin 和 ICAM-1，對 DOPC/DGS-NTA 摩爾質量配比為 98∶2 構成的 SLBs 承載蛋白的能力及蛋白在膜上的運動性能進行檢測。
由于在 P-selectin 和 ICAM-1 的近胞質區插入了 10 個組氨酸，通過它們與 DGS-NTA 上鎳離子的螯合作用從而將蛋白分子錨定在 SLBs，并且保證了配體識別區域向外的正確朝向。以 10、20、40 nmol·L–1三個濃度，2 種蛋白各自按 1.4 節中所述的方法加載到已制作好的 SLBs，在共聚焦顯微鏡下觀測 SLBs 的熒光強度，實驗結果如圖 7a 所示。由于 P-selectin 和 ICAM-1 結合熒光的能力不同，所以同樣濃度呈現的熒光強度不同，而熒光強度均隨濃度的增加呈現線性提高的趨勢，意味著蛋白的位點密度與濃度是線性正相關的，該配比形成的 SLBs 完全有能力承載 10～40 nmol·L–1濃度范圍的 P-selectin 和 ICAM-1。
圖7
加載不同濃度P-選擇素或ICAM-1對SLBs功能的影響
a. 平均熒光強度隨蛋白濃度變化；b.熒光恢復率隨蛋白濃度變化；c.
a. the average fluorescence intensity of SLBs changed with protein concentration; b. the recovery ratio of SLBs changed with protein concentration; c.
接著選定直徑為 12 μm 的圓形區域進行 FRAP 實驗，測試蛋白分子在膜上的運動性能，其熒光恢復率、t1/2 和擴散系數隨蛋白濃度的變化如圖 7b、7c 和 7d 所示。2 種蛋白的熒光恢復率非常接近，均隨濃度的增加有輕微下降的趨勢，但整體都在 78% 以上。另外，同樣濃度下 2 種蛋白的 t1/2 與擴散系數差異無統計學意義（P > 0.05），但 t1/2 都隨蛋白濃度的增加有延長的趨勢，P-selectin 從 17.69 s 增至 28.66 s，ICAM-1 從 15.88 s 增至 25.05 s；而擴散系數則隨蛋白濃度的增加而減小，P-selectin 從 0.527 μm 2·s–1減小到 0.312 μm 2·s–1，ICAM-1 則從 0.575 μm 2·s–1減小到 0.374 μm 2·s–1。已有研究表明，膜上受體因受分子量差異以及是否聚簇及與細胞骨架相連等因素影響，其在細胞膜上的擴散系數數量級一般在 10–9～10–11 cm2·s–1[4, 28-29]，因此在我們的實驗條件下，加載在 SLBs 上 3 種濃度的 P-selectin 和 ICAM-1 的運動性能良好，可以替代細胞膜進行后續的系列研究。
3 討論
SLBs 由脂質小泡在親水表面自發融合形成，因具有與細胞膜類似的結構及良好的穩定性，30 多年來一直是實驗室細胞膜表面模型研究的重要一員[1, 5-6]。因為研究目標不同，各實驗室在脂質成分的選擇、制備方法及加載蛋白濃度等方面都有很大的差異[14, 23, 30]。
本文以 DOPC 與 DGS-NTA 為原料制備 SLBs，通過納米粒徑-Zeta 電位測試儀和 FRAP 實驗技術對構成膜的 SUV 粒徑和膜性能進行檢測。比較分析了不同預處理方法（薄膜擠壓法與聲波破碎法）、制備環境（暴露于空氣和置于水腔隔絕空氣）及 DOPC 與 DGS-NTA 成分配比（98∶2～80∶20）制備的 SLBs 性能差異。相比于以往的研究結果，我們的實驗數據首次證明采用聲波破碎法處理脂質體獲得的小囊泡更細更均勻，為在玻璃底板上形成均勻的 SLBs 提供更好的物質基礎。另外，SLBs 的形成均需在不接觸空氣的水環境中，否則會失去流動性，這或許是由于 DOPC 尾部有雙鍵，在制備過程中易發生氧化[2, 15, 21]。同時，從實驗數據推斷出 DGS-NTA 與 DOPC 制備 SLBs 的配比閾值為 18∶82，只有原料中 DGS-NTA 占比小于 18% 才能制備出表面均勻且流動性好的 SLBs，此推論受到 Nye 等[12]實驗數據的部分支持，他們采用 Egg phosphatidylcholine（EggPC）與 DGS-NTA 制備 SLBs，發現在 DGS-NTA 占比 ≤ 10% 時制備的 SLBs 均具有良好的流動性。
此外，我們檢測了激光漂白區域大小及 P-selectin 與 ICAM-1 蛋白加載濃度對 SLBs 自身流動性、承載蛋白的能力及膜蛋白擴散系數等的影響。實驗數據表明我們所構筑的生物膜具有良好的物理性能，承載 10～40 nmol·L–1的蛋白后擴散系數維持在 0.5 μm2·s–1左右，與 Liu 等[31]實驗數據（擴散系數為 0～0.5 μm2·s–1）及 Tanaka 等[23]實驗數據（擴散系數為 0.5～1 μm2·s–1）較為接近，可用于后續生物學研究。因此，本文不僅為細胞膜分子之間的相互作用及后續信號響應的研究搭建了一個良好的生物膜平臺，也為研究細胞膜表面受體與配體的相互作用及細胞接觸面上黏附分子的擴散提供了新的思路。
引言
生物膜維持著細胞內各部分結構的有序性，在細胞和外界環境的物質交換及信息傳遞、蛋白質等大分子的生物合成過程中均發揮著重要作用[1]。細胞膜本身結構復雜難以分離[2-3]，而人工構筑的脂雙層膜因能控制膜組分以及便于觀察和分析，已被廣泛應用于研究細胞與細胞接觸面分子的相互作用[4]、T 細胞與抗原呈遞細胞之間免疫突觸的形成以及血細胞在血管壁的爬行和遷移等[5-6]。人工生物膜模型主要包括 Langmuir-Blodgett（L-B）單層膜[7-8]、支撐脂雙層膜（supported lipid bilayers，SLBs）[3, 9-10]和囊泡[11]等。其中，SLBs 制備過程簡單、重現性好，制得的膜穩定性好且具有與細胞膜相似的流動性，能夠為后續功能化研究提供良好的基礎，因此備受學術界青睞[12-14]。
然而，SLBs 制備過程中仍有很多問題有待解決。首先，脂質體需要采用囊泡融合等預處理以形成小囊泡（small unilamellar vesicles，SUV），再由 SUV 在親水玻璃板上形成膜，因此 SUV 的大小和均勻度對膜的厚度和均一性至關重要。目前常采用薄膜擠壓法[15-16]、聲波破碎法[10, 17]和反復凍融法[18]對脂質體預處理得到 SUV，其中薄膜擠壓法能防止接觸空氣，超聲波破碎法能有效避免交叉污染，因此它們成為 21 世紀重要的人工脂雙層膜制備方法[10]。其次，脂質體成分中大多含有不飽和酰基鏈，制備過程中與空氣接觸易發生氧化反應，從而造成顆粒聚集、流動性降低等后果[2, 19]。再者是原材料及配比問題，SLBs 膜穩定性和流動性受到范德華力、水合力以及脂質與基底間的靜電相互作用等作用力之間的平衡調控，優質 SLBs 的最佳制備條件很大程度上取決于脂質的組成[14]。因此，探索成膜最佳和閾值成分配比及解決 SLBs 制備過程中易氧化問題，對于進一步構建具有生物學功能的細胞膜模型無疑是非常重要的。
最后，蛋白的加載方式也非常關鍵。目前常用生物素-親和素共價結合及鎳脂與多組氨酸重組蛋白螯合的方法將蛋白插入 SLBs，形成有功能的生物膜。然而，前一種方法當親和素濃度高時易發生聚集從而影響蛋白在膜上的流動[20]；后一種方法盡管兩者的螯合可以有效控制蛋白朝向和所需蛋白濃度，但鎳脂的占比以及與多組氨酸重組蛋白的配比不僅會影響膜自身的流動性，也會調控和制約膜上蛋白的運動[12, 21]。這里我們選擇了兩種在炎癥反應及免疫響應過程中的重要蛋白分子——P-選擇素（P-selectin）和細胞間黏附分子（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1），前者介導白細胞的初始黏附，后者在白細胞穩定黏附及免疫突觸的形成中發揮關鍵作用[22]，分別將這兩種蛋白以合理方式加載到 SLBs 上形成有生物學功能的膜，并探討膜承載這兩種蛋白的能力及蛋白加載濃度對其自身擴散系數的影響。本研究不僅可為生物膜的構建和深入研究提供有益參考，還可為后續進一步研究免疫細胞在血管內皮的粘附、爬行及細胞接觸面的免疫反應等建立良好的實驗平臺。
1 材料與方法
1.1 主要材料
1，2-油-錫-磷脂-3-卵磷脂（1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DOPC）與亞氨基二乙酸丁二酰（鎳鹽）{1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-［(N-（5-amino-1-carboxypentyl） iminodiacetic acid)］ succinyl （nickel salt），DGS-NTA}（美國，Avanti Polar Lipids）；Texas Red ?DHPE 染料、小室（chamber）、ALexa Fluor ?488 微量蛋白質標記試劑盒與磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer solution，PBS）（美國，Life Technologies）；P-selectin 與 ICAM-1（北京義翹神州生物技術有限公司）；玻璃載玻片（美國，Warner Instruments）；濃硫酸、過氧化氫等試劑（廣東省廣州市東紅化工廠）。
1.2 玻璃載玻片的預處理
將玻璃載玻片浸入 Piranha 洗液（濃硫酸∶雙氧水=7∶3；V∶V）中，在 100 ℃ 下浸泡 45～60 min，超純水沖洗干凈后氮氣吹干并放入干燥器中備用。
1.3 SUV和SLBs樣品的準備
1.3.1 脂質體預處理
如圖 1 所示，原料 DOPC 和 DGS-NTA 按比例混合于圓底燒瓶內并用氮氣迅速吹干成膜，真空干燥 2.5 h 后加入 2 mL 去離子水將其重新水合。加入去離子水后，脂質體自行從瓶底脫落并迅速組裝形成各種直徑的脂質體，之后采用薄膜擠壓法或聲波破碎法對其進行預處理得到 SUV。
圖1
SUV 和 SLBs 樣品的準備
Figure1.
The preparation of SUV and SLBs
（1）薄膜擠壓法：將上述脂質體置于 55℃ 的無光環境中，使用擠壓機（美國，Avanti Polar Lipids）對脂質體來回擠壓過濾 10 次得到 SUV，其中濾膜孔徑為 0.1 μm；
（2）聲波破碎法：將上述脂質體置于 4℃ 冰箱過夜，次日使用聲波破碎儀（美國，SONICS & MATERIALS）對脂質體破碎 30～40 s，間隔 10 s，共 10～15 min，直到溶液由渾濁變為澄清得到 SUV；之后將所得樣品 20 000×g 離心 12～15 h 收集上清。
1.3.2 SLBs 膜的形成
取 15 μL 上述 SUV 與等體積的 PBS（pH=7.4）充分混合后滴加到培養皿中心處，迅速蓋上蓋玻片，室溫孵育 5 min 后，分別在下面兩種環境中形成 SLB。
（1）暴露在空氣中：將玻璃片從培養皿中取出置于小室中并擰緊小室，用去離子水充分清洗，去除未結合到玻璃片上的脂質體，清洗干凈后緩慢將水全部置換成 PBS；
（2）未暴露在空氣中：將培養皿置于去離子水液面下（之后所有操作玻璃片均在液面下），在水中將玻璃片從培養皿中取出并充分清洗，清洗干凈后在水下將玻璃片置于小室中并擰緊小室，之后將小室從水中取出并緩慢將水全部置換成 PBS。
1.4 脂雙層膜上蛋白分子的加載
在脂雙層膜上加載蛋白分子時，提前采用 ALexa Fluor ?488 微量蛋白質標記試劑盒對 P-selectin 或 ICAM-1 分子進行熒光標記。采用 1.3 節所述方法制備好脂雙層膜后將熒光標記好的重組蛋白（P-selectin 或 ICAM-1）稀釋到實驗所需濃度（10、20、40 nmol·L–1）并緩慢滴加到小室中，避光孵育 30 min 后用 PBS 充分清洗未結合到脂雙層上的蛋白。
1.5 熒光漂白恢復（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）實驗條件與方法
實驗溫度為 22～25℃，根據熒光染料設置共聚焦顯微鏡（德國，萊卡 TCS-SP8）激發光，選擇直徑為 12 μm[23]類似嗜中性粒細胞大小樣的圓形作為漂白區域，檢測激光強度為 10%，漂白激光強度為 100%，孔徑值為 2.3，掃描速度為 200 Hz，像素為 256 × 256，物鏡為 100 倍油鏡。漂白前掃描 5 幅（0.655 s/幅）獲取脂雙層膜初始熒光強度，恢復過程設置 200～500 幅，以保證漂白區域恢復完全最終達到平衡。
1.6 SUV的粒徑、Zeta電位檢測
為了比較脂質體預處理方法對 SUV 粒徑大小及均勻程度的影響，將上述按 1.3.1 節中兩種方法制備的 SUV 用超純水稀釋。采用納米粒度-Zeta 電位測試儀（英國，Malvern 公司）測量其平均粒徑和 Zeta 電位，檢測條件為氦-氖激光，波長為 632 nm。
1.7 相關物理量的定義和測量
（1）脂雙層膜初始熒光均勻程度：在每組脂雙層膜上選取 9 個直徑為 12 μm 的圓作為觀察區域，由 9 個取樣區域平均熒光強度的標準偏差值體現；（2）脂雙層膜漂白區域的熒光恢復率 = 漂白后恢復至穩定時熒光值/漂白前熒光值（扣除背景衰減后），擴散系數 D ≈ 0.25r02/t1/2，其中 r0 為漂白區域的半徑，t1/2 為達到最大恢復程度一半所需要的時間[5, 24-25]。
1.8 統計學方法
每個實驗條件均進行三組獨立平行實驗，數據采用平均值 ± 標準差表示。兩組間比較采用 t 檢驗分析，P < 0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果與分析
2.1 預處理方法對SUV粒徑分布及脂雙層膜流動性的影響
首先，我們按 1.6 節中的方法對薄膜擠壓法與超聲破碎法預處理所得 SUV 的粒徑分布進行檢測。結果如圖 2 所示：薄膜擠壓法制備的 SUV 粒徑分布較廣［（91.82～255.30）nm］，粒徑為（132.7 ± 7.12）nm，分散指數（polymer dispersity index，PDI）為 0.237；而聲波破碎法制備的 SUV 粒徑分布較窄［（37.84～91.28）nm］，粒徑為（49.4 ± 3.26）nm，PDI 為 0.207；統計學分析表明后者的脂質體顆粒要明顯小于前者（P < 0.01），且顆粒的分散性更好。同時，SUV 電位絕對值的大小反映顆粒物的分散穩定性的強弱，聲波破碎法測得的值為（–32.87 ± 3.82）mV，也略高于薄膜擠壓法（–30.57 ± 1.41）mV。因此，盡管兩種方法制備的 SUV 的粒徑及均勻度都不錯，但聲波破碎法還是優于薄膜擠壓法，不僅 SUV 的粒徑更小，而且顆粒分散更均勻、更穩定。
圖2
薄膜擠壓法與聲波破碎法預處理的SUV粒徑分布（** P < 0.01）
Figure2.
The particle size distribution of SUV pretreated with thin film extrusion and probe sonication (** P < 0.01)
之后，我們將上述 2 種均勻分散的脂質體按 1.3.2 節中的方法（空氣中制備與水腔中制備）制備 SLBs。在共聚焦顯微鏡下，通過 FRAP 實驗檢測所制備脂雙層膜的流動性，結果如圖 3 所示。實驗表明，SLBs 形成過程是否暴露于空氣對其熒光恢復率起著決定性的影響（P < 0.01），而脂質體的預處理方法則無影響（P > 0.05）。從圖 3b 的熒光恢復時間歷程中可以看出，脂雙層在玻璃平板上的形成過程若暴露于空氣導致熒光無法恢復，反映出制備的 SLBs 基本無流動性；與之相反，脂雙層膜形成過程若未暴露在空氣中，最終熒光均至少可恢復至初始熒光強度的 92.43%。盡管薄膜擠壓法與聲波破碎法制備的 SLBs 的熒光恢復率無顯著差異，但后者的熒光恢復速度要高于前者，經計算得兩者擴散系數分別為（0.74 ± 0.09）μm2·s–1與（1.22 ± 0.13）μm2·s–1。因此，相比于薄膜擠壓法，聲波破碎法制備的脂雙層具有更加優異的流動性。
圖3
薄膜擠壓法與聲波破碎法制備的SLBs流動性
a. SLBs 熒光恢復率隨不同方法變化；b. SLBs 相對熒光強度隨時間變化。**
a. the recovery ratio of SLBs changed with different methods; b. the relative fluorescence intensity of SLBs changed with time. **
基于上述結果，在后續的研究中，我們采用聲波破碎法預處理脂質體，并在不接觸空氣的水環境中制備 SLBs。
2.2 DOPC/DGS-NTA不同配比對SLBs流動性的影響
DOPC 是制備 SLBs 最常用的脂質之一，而原料中 DGS-NTA 占比與最終 SLBs 能承載重組蛋白分子的能力直接相關[2, 14]。因此，探明 DOPC/DGS-NTA 不同配比對 SLBs 流動性的影響對后續 SLBs 的功能化尤其關鍵。這里，我們以 Taxas Red? DHPE 染料做指示，按 1.5 節所述的方法在不同配比的 DOPC/DGS-NTA 中加 0.5% Taxas Red? DHPE，將形成的 SLBs 短時間暴露于高強度脈沖式激光而快速光漂白，漂白區域直徑為 12 μm。由于存在濃度梯度且 SLBs 具有流動性，周圍未漂白的熒光分子會擴散至漂白區域引起熒光恢復，在 10% 檢測激光下，觀察記錄 SLBs 樣品的熒光漂白恢復過程。每個實驗條件下均進行 3 次獨立平行實驗。
當 DOPC/DGS-NTA 的摩爾質量比分別為 98∶2 與 80∶20 時，熒光漂白恢復過程與熒光漂白恢復曲線如圖 4 所示，前者基礎熒光強度高［（204.72 ± 8.97）nm］、熒光恢復速度快、恢復率高（97%）（圖 4a、c），而后者基礎熒光強度低［（59.46 ± 5.09）nm］且熒光基本無恢復（圖 4b、d）。因此，我們斷定在 98∶2 與 80∶20 之間存在一個 DOPC/DGS-NTA 配比的閾值：該閾值前制備的 SLBs 具有較好的流動性，而該閾值后制備的 SLBs 流動性差，已失去作為生物膜模型的可能。為探明該閾值作為將來實驗設計的判據，我們對 98∶2～80∶20 范圍內不同配比的 SLBs 展開了系列實驗，觀察分析其對 SLBs 熒光恢復率、t1/2 和擴散系數的影響，結果如圖 5 所示。當 DGS-NTA 在原料中摩爾質量占比由 2% 增加到 16% 時，SLBs 流動性呈緩慢下降趨勢，表現為最終熒光恢復率由 97.46% 一直降到 82.25%，t1/2 由 7.42 s 增加到 22.27 s，擴散系數由 1.22 μm 2·s–1降到 0.41 μm 2·s–1；當 DGS-NTA 占比進一步增加到 18%，熒光恢復率、擴散系數急劇下降而 t1/2 為急劇上升，脂雙層膜流動性幾乎喪失。對 DGS-NTA 占比為 16% 和 18% 的兩組數據進行 t 檢驗，證實它們之間的熒光恢復率（見圖 5d）、t1/2 和擴散系數的差異有統計學意義（P < 0.01）。由此推斷，原料 DOPC/DGS-NTA 配比的閾值在 82∶18 左右，此時制備的 SLBs 不再具有流動性。
圖4
SLBs 熒光恢復圖與恢復曲線
a. SLBs（98∶2）熒光恢復圖；b. SLBs（80∶20）熒光恢復圖；c. SLBs（98∶2）相對熒光強度隨時間變化；d. SLBs（80∶20）相對熒光強度隨時間變化
Figure4. The fluorescence recovery image and curve of SLBsa. the recovery image of SLBs (98∶2); b. the recovery image of SLBs (80∶20); c. the relative fluorescence intensity of SLBs (98∶2) changed with time; d. the relative fluorescence intensity of SLBs (80∶20) changed with time
圖5
不同原料配比制備的SLBs FRAP
a. SLBs 熒光恢復率隨原料配比變化；b.
a. the recovery ratio of SLBs changed with lipid compositions; b. the
綜上所述，我們發現：當原料中 DGS-NTA 摩爾質量占比 < 18% 時，占比越小，制備的 SLBs 流動性越好；當 DGS-NTA 占比 ≥ 18%，制備的 SLBs 已失去流動性，因此 DOPC/DGS-NTA 摩爾質量比 82∶18 是制備具有生物學功能 SLBs 的臨界比例。然而，加載蛋白和細胞后一般會大大減弱膜的運動能力[10]，綜合考量反映膜流動能力的熒光恢復率、t1/2 和擴散系數等 3 個物理指標，在后續 SLBs 功能化研究中 DGS-NTA 摩爾質量占比均定為 2%。
2.3 漂白區域大小對SLBs熒光恢復的影響
漂白區域的大小通過調節暗熒光分子與亮熒光分子的相對量和交換速度影響熒光漂白后恢復過程，因此探明漂白區域大小與熒光恢復速度及程度的關系，為后續實驗選定合適參數無疑是非常重要的。這里，我們針對直徑為 3、6、12、24、48 μm 五個不同大小的圓形區域進行 FRAP 實驗，結果如圖 6 所示。圖 6a 為淬滅后熒光強度隨時間的恢復過程，盡管 250 s 后各漂白區域的熒光均可恢復至初始熒光 90% 以上，但恢復速度則呈現明顯的規律性差異：隨漂白區域直徑從 3 μm 增加到 48 μm，熒光恢復速度依次減慢，體現在 t1/2 隨漂白區域直徑的增加而單調增加（見圖 6b），而擴散系數則呈現相反的趨勢（見圖 6c）且每兩組間差異均具有統計學意義（P < 0.05）。其中，直徑為 3 μm 時，t1/2 與擴散系數分別為 2.838 s 與 3.206 μm 2·s–1；而直徑為 48 μm 時，t1/2 增至 44.103 s，擴散系數則減小到 0.206 μm 2·s–1。
圖6
不同大小漂白區域FRAP
a. 相對熒光強度隨時間變化；b.
a. the relative fluorescence intensity of SLBs changed with time; b.
一般認為 SLBs 的擴散系數不小于 1 μm 2·s–1、t1/2 不大于 10 s 是優良性能 SLBs 模型的合理參數[5, 26-27]。我們的實驗結果表明：漂白區域 12 μm 是一個臨界值，小于該值的都有較大的擴散系數，而大于該值因擴散系數過小而不宜于實驗研究，同時考慮到 12 μm 最接近嗜中性粒細胞的直徑，故在后續 SLBs 功能化研究中均選用直徑為 12 μm 的圓作為漂白區域。
2.4 SLBs承載不同蛋白分子的能力
盡管我們已經構建了均勻、穩定且流動性好的 SLBs，但只有加載或插入蛋白后才是真正能執行分子輸運及信號應答等生物過程的有價值的人工膜，才能在研究中作為細胞膜的替代品。這里，我們采用 2 種在炎癥反應和腫瘤轉移過程中重要的分子——P-selectin 和 ICAM-1，對 DOPC/DGS-NTA 摩爾質量配比為 98∶2 構成的 SLBs 承載蛋白的能力及蛋白在膜上的運動性能進行檢測。
由于在 P-selectin 和 ICAM-1 的近胞質區插入了 10 個組氨酸，通過它們與 DGS-NTA 上鎳離子的螯合作用從而將蛋白分子錨定在 SLBs，并且保證了配體識別區域向外的正確朝向。以 10、20、40 nmol·L–1三個濃度，2 種蛋白各自按 1.4 節中所述的方法加載到已制作好的 SLBs，在共聚焦顯微鏡下觀測 SLBs 的熒光強度，實驗結果如圖 7a 所示。由于 P-selectin 和 ICAM-1 結合熒光的能力不同，所以同樣濃度呈現的熒光強度不同，而熒光強度均隨濃度的增加呈現線性提高的趨勢，意味著蛋白的位點密度與濃度是線性正相關的，該配比形成的 SLBs 完全有能力承載 10～40 nmol·L–1濃度范圍的 P-selectin 和 ICAM-1。
圖7
加載不同濃度P-選擇素或ICAM-1對SLBs功能的影響
a. 平均熒光強度隨蛋白濃度變化；b.熒光恢復率隨蛋白濃度變化；c.
a. the average fluorescence intensity of SLBs changed with protein concentration; b. the recovery ratio of SLBs changed with protein concentration; c.
接著選定直徑為 12 μm 的圓形區域進行 FRAP 實驗，測試蛋白分子在膜上的運動性能，其熒光恢復率、t1/2 和擴散系數隨蛋白濃度的變化如圖 7b、7c 和 7d 所示。2 種蛋白的熒光恢復率非常接近，均隨濃度的增加有輕微下降的趨勢，但整體都在 78% 以上。另外，同樣濃度下 2 種蛋白的 t1/2 與擴散系數差異無統計學意義（P > 0.05），但 t1/2 都隨蛋白濃度的增加有延長的趨勢，P-selectin 從 17.69 s 增至 28.66 s，ICAM-1 從 15.88 s 增至 25.05 s；而擴散系數則隨蛋白濃度的增加而減小，P-selectin 從 0.527 μm 2·s–1減小到 0.312 μm 2·s–1，ICAM-1 則從 0.575 μm 2·s–1減小到 0.374 μm 2·s–1。已有研究表明，膜上受體因受分子量差異以及是否聚簇及與細胞骨架相連等因素影響，其在細胞膜上的擴散系數數量級一般在 10–9～10–11 cm2·s–1[4, 28-29]，因此在我們的實驗條件下，加載在 SLBs 上 3 種濃度的 P-selectin 和 ICAM-1 的運動性能良好，可以替代細胞膜進行后續的系列研究。
3 討論
SLBs 由脂質小泡在親水表面自發融合形成，因具有與細胞膜類似的結構及良好的穩定性，30 多年來一直是實驗室細胞膜表面模型研究的重要一員[1, 5-6]。因為研究目標不同，各實驗室在脂質成分的選擇、制備方法及加載蛋白濃度等方面都有很大的差異[14, 23, 30]。
本文以 DOPC 與 DGS-NTA 為原料制備 SLBs，通過納米粒徑-Zeta 電位測試儀和 FRAP 實驗技術對構成膜的 SUV 粒徑和膜性能進行檢測。比較分析了不同預處理方法（薄膜擠壓法與聲波破碎法）、制備環境（暴露于空氣和置于水腔隔絕空氣）及 DOPC 與 DGS-NTA 成分配比（98∶2～80∶20）制備的 SLBs 性能差異。相比于以往的研究結果，我們的實驗數據首次證明采用聲波破碎法處理脂質體獲得的小囊泡更細更均勻，為在玻璃底板上形成均勻的 SLBs 提供更好的物質基礎。另外，SLBs 的形成均需在不接觸空氣的水環境中，否則會失去流動性，這或許是由于 DOPC 尾部有雙鍵，在制備過程中易發生氧化[2, 15, 21]。同時，從實驗數據推斷出 DGS-NTA 與 DOPC 制備 SLBs 的配比閾值為 18∶82，只有原料中 DGS-NTA 占比小于 18% 才能制備出表面均勻且流動性好的 SLBs，此推論受到 Nye 等[12]實驗數據的部分支持，他們采用 Egg phosphatidylcholine（EggPC）與 DGS-NTA 制備 SLBs，發現在 DGS-NTA 占比 ≤ 10% 時制備的 SLBs 均具有良好的流動性。
此外，我們檢測了激光漂白區域大小及 P-selectin 與 ICAM-1 蛋白加載濃度對 SLBs 自身流動性、承載蛋白的能力及膜蛋白擴散系數等的影響。實驗數據表明我們所構筑的生物膜具有良好的物理性能，承載 10～40 nmol·L–1的蛋白后擴散系數維持在 0.5 μm2·s–1左右，與 Liu 等[31]實驗數據（擴散系數為 0～0.5 μm2·s–1）及 Tanaka 等[23]實驗數據（擴散系數為 0.5～1 μm2·s–1）較為接近，可用于后續生物學研究。因此，本文不僅為細胞膜分子之間的相互作用及后續信號響應的研究搭建了一個良好的生物膜平臺，也為研究細胞膜表面受體與配體的相互作用及細胞接觸面上黏附分子的擴散提供了新的思路。
