三維（3D）打印作為一種新興的快速成型技術，已廣泛應用于生物醫學領域。3D 打印最初在醫學中主要用于可視化模型、模具的構建，但隨著生物醫學領域 3D 打印技術的發展，該技術逐漸應用在復雜組織再生和器官重構等方面，通過生物 3D 打印獲得的人工組織和器官，有望用于器官移植以及進行新藥研發和藥物毒性評價等醫藥學相關的研究。本文重點闡述了 3D 打印技術在肝臟外科中的個體化應用，并重點介紹了生物 3D 打印技術在肝移植、藥物肝臟代謝和肝毒性評價中的研究進展，并進一步對其未來發展趨勢進行了展望。
引用本文： 姚鳳, 林蓉. 三維打印技術在肝臟外科和肝毒性評價中的研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(4): 656-660. doi: 10.7507/1001-5515.201710074 復制
引言
三維（three dimension，3D）打印技術是基于“增材制造”的原理，通過計算機輔助設計模型，在計算機控制下將材料逐層沉積或黏合的方式直接制備具有復雜外形或特殊內部結構實體的快速成型技術[1]。隨著 3D 打印技術的發展，應用此技術打印皮膚、耳朵、鼻子、微型人體腎臟、肝臟等人體器官已經成為可能。生物 3D 打印技術是 3D 打印技術最前沿的領域之一。它是基于 3D 打印的基礎上，以活性材料包括活體細胞、生長因子、生物材料等為主要內容，以獲得所需的人工組織和器官為目標的新型再生醫學工程技術。最早 3D 打印技術是用于構建醫學模型、醫療器械及永久性植入物；隨著技術的發展，在 3D 打印的支架上已可以通過種植細胞獲得組織和進行器官的重構；而最新發展的 3D 打印技術是將細胞和支架同時打印，從而構建所需的人工組織和器官。目前，通過生物 3D 打印技術制造出微型肝臟、心臟、腎臟、血管等組織和器官已應用到生物醫學相關領域。
肝臟作為人體內最大的實質器官以及重要的物質代謝和解毒器官，在維持機體生理功能中起著至關重要的作用[2]。3D 打印技術能通過影像學資料構建出患者的肝臟仿真模型，通過術前模擬，可實現精準化、個性化的手術治療。此外，供體的極度短缺限制了肝移植技術在臨床的廣泛應用，通過生物 3D 打印技術重構出可供人體移植使用的人工肝臟就非常有價值和意義。另一方面，在新藥進入臨床使用前，往往需要進行大量的動物實驗，成本高，且與人體存在較大差異，導致動物實驗難以準確地體現藥物的治療作用和毒性反應，利用生物 3D 打印技術構建活體肝臟組織進行相關研究，可以更準確地模擬人體對藥物的反應，有利于新藥研發和藥物毒性評價研究的開展。因此，本文對 3D 打印技術在肝臟外科中的個體化應用進行了闡述，并介紹了生物 3D 打印技術在肝移植、藥物肝臟代謝和肝毒性評價中的研究進展，為生物 3D 打印技術在肝臟外科、新藥研究以及相關領域的研究和應用提供參考。
1 3D 打印技術在肝切除術中的個體化應用
在臨床進行肝切除術時，對肝臟中血管、膽管和腫瘤等組織進行精確定位以及明確其相互關系十分重要。在 3D 打印技術出現之前，外科醫生只能通過醫學成像技術評估各組織器官的相對位置以及與鄰近血管的關系[3]。然而，對于病灶情況復雜或者一些特殊位置的病灶，往往存在腫瘤與肝動脈、肝靜脈及門脈分支位置不清的情況，而醫學成像技術不能完整顯示其內部真實情況，導致手術過程中肝臟體積切除過大，而殘余肝體積不足以維持肝臟的正常功能，從而引發肝衰竭等并發癥。而 3D 打印技術通過構建個體化肝臟模型，精確評估肝臟的解剖結構，明確病灶及其與周圍血管的關系，可有效應用于精準的個體化肝切除手術中。
Igami 等[4]報道了 2 例結腸癌發生肝轉移的病例，他們通過增強計算機斷層掃描發現了化療后縮小的肝臟轉移灶，進一步應用 3D 打印技術構建出肝臟轉移灶的仿真模型，從而獲得了肝臟轉移灶的精確定位，提高了肝切除術的成功率。2015 年 Xiang 等[5]報道了一個罕見的門靜脈變異病例，他們在手術前通過 3D 打印技術獲得了患者的肝臟模型，通過在肝臟模型上進行個性化分割、體積計算和虛擬操作發現，患者起源于門靜脈右前支的 S4 段門靜脈缺失，如果忽略了這一變異而進行右半肝切除術，則殘余肝體積僅剩余 21.37%，但保留門靜脈右前支而進行右肝部分切除術，則殘余肝體積有 57.25%，大大降低了發生肝衰竭等并發癥的風險。越來越多的研究也提示，通過 3D 打印技術可以獲得患者肝臟個體化模型，外科醫生更易了解患者復雜解剖結構的詳細信息，以便實現對病灶的精確定位，從而有利于確定手術路線，達到個體化和精準治療的目的[6-8]。
此外，3D 打印技術已經成為人體解剖教學中一種新型的輔助教學方法，在醫學教育中發揮著重要的作用[9-10]。Jones 等[11]發現，將 3D 打印技術用于人體解剖教學中，通過從立體角度向學生展示人體器官、結構和位置，能有效地幫助學生提高對復雜器官的認識，從而提高教學質量及學生滿意度。總之，基于影像學數據，通過 3D 打印技術構建出肝臟仿真模型，可以讓外科醫生、醫學生及患者等從立體角度上充分認識肝臟，有助于教學互動及醫患溝通。
2 3D 打印技術在肝移植中的個體化應用
迄今為止，對于終末期肝病、腎衰竭等醫學難題，臨床上行之有效的治療方式仍為器官移植手術，然而器官移植一直以來都存在著捐獻的器官往往供不應求，異體器官移植易出現排斥現象等問題。近年來，隨著 3D 打印技術在生物醫學領域的發展，器官移植所面臨的難題有了解決的可能。
相比其他的組織工程技術，3D 打印技術具有復雜外形與可控內部微結構一體化制造的優勢，能將生物材料加工成具有良好生物相容性的器官支架，通過在器官支架上種植細胞，有望構建具有生物學功能的活體組織或器官。Huang 等[12]采用激光燒結技術構建了 3D 通道支架，結果發現，3D 通道支架上肝細胞的葡萄糖消耗和白蛋白分泌均隨著時間增加而增加，循環灌流增加了 3D 通道內肝細胞的葡萄糖消耗和白蛋白分泌，且與靜態條件比較差異具有統計學意義，提示 3D 打印技術構建的 3D 通道支架能維持肝細胞良好的代謝能力。Zhong 等[13]應用肝損傷并伴有三分之二肝切除的小鼠進行研究，結果發現，腹腔植入了不帶肝細胞生物支架的小鼠最多可存活 17 d，而植入帶有肝細胞生物支架的小鼠存活時間更長，最多可存活 26 d，進一步說明通過在 3D 支架上種植細胞的方式有再造體外肝臟的潛力。然而由于該方法存在一定的局限性，如種植的細胞在生物支架上無法均勻分布以及種植的細胞類型單一等，因此，再生醫學科學家進一步利用含有活體細胞的“生物墨水”為材料，打印出具有生物活性的立體細胞組織架構。Wang 等[14]通過低溫沉積制造技術構建了多層肝細胞結構，結果發現，多層肝細胞結構中肝細胞仍可大量存活，并維持白蛋白、尿素和甘油三酯的合成長達 45 d 以上，說明生物 3D 打印技術構建的多層肝細胞結構具有較久維持肝細胞合成功能的能力，有望構建具有良好功能的體外肝臟組織。最近，Kang 等[15]以肝樣細胞和水凝膠作為“生物墨水”，應用生物 3D 打印技術完成肝臟組織的構建，該研究發現，移植進小鼠腹腔的肝臟組織中的肝樣細胞數量增多、白蛋白表達增強，且與體外的肝臟組織相比差異具有統計學意義，進一步說明生物 3D 打印技術構建的肝臟組織在體內也具有良好的生物活性，有望用于肝移植。以上研究表明，通過在 3D 支架上種植細胞獲得組織或器官，或者通過生物 3D 打印技術直接打印組織或器官這兩種方式，均能重構具有良好功能的體外肝臟組織，且有望用于肝移植，從而延長人類壽命。
雖然通過生物 3D 打印技術構建可供移植的組織或器官目前還存在一些問題亟待解決，但臨床上已成功應用 3D 打印的肝臟仿真模型用于肝移植的術前規劃和術中指導。Zein 等[16]通過 3D 打印的肝臟模型可成功評估血管及膽管的解剖結構，從而減少了肝移植手術中的冷缺血時間，增加了肝移植手術的成功率。3D 打印技術不僅在成人肝移植中有重要作用，在兒童肝移植中也有突破性進展。Soejima 等[17]應用噴墨打印技術，打印了患有先天性膽道閉鎖患兒的腹腔仿真模型和患兒父親的肝臟仿真模型，通過腹腔仿真模型對患兒腹腔容積進行了精確測定，再根據患兒腹腔容積對肝臟仿真模型進行術前模擬修整，最終成功將患兒父親提供的適當大小的肝臟組織移植給了患兒，且避免了由于供肝體積過大而導致的并發癥。因此，3D 打印技術通過構建肝臟仿真模型，能精確地提供供肝的體積信息和可視化的內部結構，有效避免對肝臟周圍組織造成人為損傷以及避免產生不必要的并發癥。總之，3D 打印技術的使用不僅有助于實現精準化、個性化的移植手術，并且有望實現體外培養發育形成可供移植的組織或器官，而且如果使用患者自身的細胞，不僅不會產生免疫排斥現象，還能有效地解決器官供不應求的問題，促進人造人體器官的發展。
3 生物 3D 打印技術在藥物肝臟代謝中的應用
肝臟是藥物代謝的主要器官，具有多種參與藥物代謝相關的酶和轉運體。雖然傳統二維（two dimension，2D）細胞培養模型在藥物代謝研究中已經顯示出了巨大潛力，但是 2D 培養的細胞是平面生長的，缺乏細胞與細胞外基質以及細胞與細胞間的接觸，細胞容易去極化，而且低表達肝藥酶和轉運體，導致藥物代謝研究存在一定的局限性。因此，科學家開始關注細胞的 3D 培養，因為 3D 培養的細胞模型具有更貼近組織器官的立體結構和更好的生物學功能[18]。其中，生物 3D 打印技術可以構建復雜的肝臟微結構和動態的肝臟微環境，能為藥物代謝研究提供更好的方法。Jeon 等[19]以人肝癌細胞株 HepG2 和海藻酸鹽為材料，通過生物 3D 打印技術構建了體外 3D 肝細胞培養模型，研究發現，3D 培養的 HepG2 細胞中脫唾液酸糖蛋白受體 1、酪氨酸氨基轉移酶表達水平較高，且與 2D 培養的 HepG2 細胞相比差異具有統計學意義，提示生物 3D 打印技術構建的 3D 細胞培養使肝細胞擁有更強的肝臟基因表達，可用來研究基因表達的變化。Bhise 等[20]通過生物 3D 打印技術構建了體外微小肝臟，通過流動培養與靜態培養兩種不同方式的比較，結果發現流動培養的微小肝臟中 HepG2 白蛋白分泌增大、尿素合成增多，提示流動培養條件比靜態培養條件更有利于研究肝臟代謝功能。此外，Kim 等[21]通過生物 3D 打印技術構建了間充質干細胞和肝細胞共存的肝臟組織，結果發現，肝臟組織中間充質干細胞和肝細胞存活 7 d 且無形態學的改變；同時，間充質干細胞和肝細胞共存的肝臟組織白蛋白分泌和尿素合成增加，脫唾液酸糖蛋白受體 1 表達水平提高，且與只含肝細胞的肝臟組織比較差異具有統計學意義，說明間充質干細胞作為輔助細胞，其分泌的細胞因子可為肝細胞的生長提供支持，而采用生物 3D 打印技術進行多細胞打印有利于構建更接近于人體的肝臟組織。這些研究表明，生物 3D 打印技術構建的肝臟組織能更好地維持肝臟功能，同時流動培養有利于模擬體內肝臟微環境。
此外，Kizawa 等[22]以原代肝細胞和大鼠成纖維細胞為材料，通過生物 3D 打印技術構建了肝臟組織，結果發現，體外肝臟組織能維持細胞色素 P450（cytochrome P450，CYP450）的亞型 CYP3A4 的活性高達 50 d。Ma 等[23]研究也發現，與 2D 細胞培養模型相比，通過生物 3D 打印技術構建的肝臟組織中 CYP3A4 表達水平顯著升高，而肝藥酶誘導劑利福平使 CYP3A4、CYP2C9 和 CYP2C19 表達水平進一步升高，但有趣的是，在 2D 細胞培養模型中，利福平并沒有誘導 CYP3A4、CYP2C9 和 CYP2C19 表達水平的升高，表明生物 3D 打印技術構建的肝臟組織中肝藥酶活性更好。Organovo 公司以肝細胞、肝竇內皮細胞和肝形狀細胞為材料，應用自動化的生物打印方法構建了體外肝臟組織，結果發現，利福平的誘導使 CYP3A4 介導的咪達唑侖的代謝顯著增加[24]，提示生物 3D 打印技術構建的肝臟組織能進行藥物代謝研究。此外，Snyder 等[25]以人肝癌細胞株 HepG2 和人乳腺上皮細胞株 M10 為材料，通過生物 3D 打印技術構建了肝臟組織，研究發現，加入了前藥氨磷汀的肝臟組織中輻射損傷的細胞百分比下降，且與對照組肝臟組織比較差異具有統計學意義，證實了氨磷汀對肝臟的輻射防護作用，表明生物 3D 打印技術構建的肝臟組織可用來進行藥物生物轉化、作用效果的研究。總之，通過生物 3D 打印技術構建的肝臟組織，不僅能用于研究肝藥酶活性，而且能為藥物代謝研究提供一個很好的方法。
4 生物 3D 打印技術在藥物肝毒性評價中的應用
藥物性肝損傷是造成藥物研發失敗、藥物被限制使用甚至撤出市場的主要原因之一，也是引發肝臟疾病的重要原因之一，因此如果能夠準確預測由于藥物對人體肝臟的損傷而導致的毒性作用就顯得尤為重要。生物 3D 打印技術能構建一種形態和功能上更接近于人類真實肝臟的三維組織結構，因而能更好地模擬人體肝臟對藥物的反應，利用生物 3D 打印技術構建的活性肝臟組織進行新藥肝毒性評價，不僅可以節省研發時間和費用，還能大大減少動物實驗的開展。
為了評價藥物對肝臟的損傷程度，Organovo 公司應用自動化的生物打印平臺構建了肝臟組織，使用 100 μmol/L 的曲格列酮和吡格列酮處理肝臟組織 7 d，結果發現，具有嚴重肝毒性的曲格列酮使肝臟組織三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水平顯著降低了 93%，而吡格列酮使肝組織 ATP 水平僅降低了 24%，表明生物 3D 打印技術構建的肝臟組織能敏感地檢測藥物引起的線粒體功能變化，進而反映藥物對肝功能損傷的程度[24]。Bhise 等[20]使用 15 mmol/L 對乙酰氨基酚處理生物 3D 打印技術構建的肝臟組織 6 d，結果顯示對乙酰氨基酚處理組肝臟組織中白蛋白、轉鐵蛋白和銅藍蛋白等水平顯著降低，多藥耐藥相關蛋白 2 的表達和成核密度也顯著降低，提示通過生物 3D 打印技術構建的肝臟組織能用于檢測對乙酰氨基酚等藥物引起的肝臟損傷。此外，Nguyen 等[18]用曲伐沙星或左氧氟沙星處理通過生物 3D 打印技術構建的肝臟組織，結果發現，4 μmol/L 的曲伐沙星就能顯著降低肝臟組織的白蛋白和 ATP 水平，且通過蘇木精–伊紅染色從形態學上觀察到曲伐沙星導致肝細胞壞死；而左氧氟沙星高達 100 μmol/L 時才導致肝臟組織白蛋白水平的降低，且對肝臟組織 ATP 水平無影響，這些進一步表明了生物 3D 打印技術構建的肝臟組織能敏感地反映藥物對肝臟的損傷。此外，他們進一步發現，在 2D 培養的肝細胞上，曲伐沙星只有在 100 μmol/L 劑量時，才能顯著降低白蛋白和 ATP 水平，而在 3D 打印技術構建的肝臟組織中 4 μmol/L 就顯著降低了肝細胞的白蛋白和 ATP 水平，說明通過生物 3D 打印技術構建的肝臟組織對藥物肝毒性具有更高的敏感性。因為肝臟特異性標志分子和肝功能變化能反映肝臟的損傷程度，因此，應用生物 3D 打印技術構建的肝臟組織可研究藥物對肝臟毒性的差異，將是理想的評價藥物肝毒性的模型。
5 發展趨勢
本文介紹了 3D 打印技術在肝切除術和肝移植術中的個體化應用，還重點闡述了生物 3D 打印技術在肝移植、藥物肝臟代謝和肝毒性評價中的研究進展。目前，生物 3D 打印技術發展迅速，但大部分研究還停留在單細胞打印上，多細胞打印仍存在較多的技術瓶頸，其中如何將不同種類和功能的細胞排列在一個特定的 3D 結構中，從而構建出具有復雜結構的組織或器官并實現其基本的功能是目前最主要的問題。3D 打印技術在肝臟構建方面已取得了一些成績，相信在不久的將來，隨著影像學和材料科學的發展，通過 3D 打印技術構建的肝臟模型的精確度和仿真程度將會不斷提高，而通過生物 3D 打印技術重構的個體化肝臟組織有望應用到肝臟疾病的臨床治療中。
引言
三維（three dimension，3D）打印技術是基于“增材制造”的原理，通過計算機輔助設計模型，在計算機控制下將材料逐層沉積或黏合的方式直接制備具有復雜外形或特殊內部結構實體的快速成型技術[1]。隨著 3D 打印技術的發展，應用此技術打印皮膚、耳朵、鼻子、微型人體腎臟、肝臟等人體器官已經成為可能。生物 3D 打印技術是 3D 打印技術最前沿的領域之一。它是基于 3D 打印的基礎上，以活性材料包括活體細胞、生長因子、生物材料等為主要內容，以獲得所需的人工組織和器官為目標的新型再生醫學工程技術。最早 3D 打印技術是用于構建醫學模型、醫療器械及永久性植入物；隨著技術的發展，在 3D 打印的支架上已可以通過種植細胞獲得組織和進行器官的重構；而最新發展的 3D 打印技術是將細胞和支架同時打印，從而構建所需的人工組織和器官。目前，通過生物 3D 打印技術制造出微型肝臟、心臟、腎臟、血管等組織和器官已應用到生物醫學相關領域。
肝臟作為人體內最大的實質器官以及重要的物質代謝和解毒器官，在維持機體生理功能中起著至關重要的作用[2]。3D 打印技術能通過影像學資料構建出患者的肝臟仿真模型，通過術前模擬，可實現精準化、個性化的手術治療。此外，供體的極度短缺限制了肝移植技術在臨床的廣泛應用，通過生物 3D 打印技術重構出可供人體移植使用的人工肝臟就非常有價值和意義。另一方面，在新藥進入臨床使用前，往往需要進行大量的動物實驗，成本高，且與人體存在較大差異，導致動物實驗難以準確地體現藥物的治療作用和毒性反應，利用生物 3D 打印技術構建活體肝臟組織進行相關研究，可以更準確地模擬人體對藥物的反應，有利于新藥研發和藥物毒性評價研究的開展。因此，本文對 3D 打印技術在肝臟外科中的個體化應用進行了闡述，并介紹了生物 3D 打印技術在肝移植、藥物肝臟代謝和肝毒性評價中的研究進展，為生物 3D 打印技術在肝臟外科、新藥研究以及相關領域的研究和應用提供參考。
1 3D 打印技術在肝切除術中的個體化應用
在臨床進行肝切除術時，對肝臟中血管、膽管和腫瘤等組織進行精確定位以及明確其相互關系十分重要。在 3D 打印技術出現之前，外科醫生只能通過醫學成像技術評估各組織器官的相對位置以及與鄰近血管的關系[3]。然而，對于病灶情況復雜或者一些特殊位置的病灶，往往存在腫瘤與肝動脈、肝靜脈及門脈分支位置不清的情況，而醫學成像技術不能完整顯示其內部真實情況，導致手術過程中肝臟體積切除過大，而殘余肝體積不足以維持肝臟的正常功能，從而引發肝衰竭等并發癥。而 3D 打印技術通過構建個體化肝臟模型，精確評估肝臟的解剖結構，明確病灶及其與周圍血管的關系，可有效應用于精準的個體化肝切除手術中。
Igami 等[4]報道了 2 例結腸癌發生肝轉移的病例，他們通過增強計算機斷層掃描發現了化療后縮小的肝臟轉移灶，進一步應用 3D 打印技術構建出肝臟轉移灶的仿真模型，從而獲得了肝臟轉移灶的精確定位，提高了肝切除術的成功率。2015 年 Xiang 等[5]報道了一個罕見的門靜脈變異病例，他們在手術前通過 3D 打印技術獲得了患者的肝臟模型，通過在肝臟模型上進行個性化分割、體積計算和虛擬操作發現，患者起源于門靜脈右前支的 S4 段門靜脈缺失，如果忽略了這一變異而進行右半肝切除術，則殘余肝體積僅剩余 21.37%，但保留門靜脈右前支而進行右肝部分切除術，則殘余肝體積有 57.25%，大大降低了發生肝衰竭等并發癥的風險。越來越多的研究也提示，通過 3D 打印技術可以獲得患者肝臟個體化模型，外科醫生更易了解患者復雜解剖結構的詳細信息，以便實現對病灶的精確定位，從而有利于確定手術路線，達到個體化和精準治療的目的[6-8]。
此外，3D 打印技術已經成為人體解剖教學中一種新型的輔助教學方法，在醫學教育中發揮著重要的作用[9-10]。Jones 等[11]發現，將 3D 打印技術用于人體解剖教學中，通過從立體角度向學生展示人體器官、結構和位置，能有效地幫助學生提高對復雜器官的認識，從而提高教學質量及學生滿意度。總之，基于影像學數據，通過 3D 打印技術構建出肝臟仿真模型，可以讓外科醫生、醫學生及患者等從立體角度上充分認識肝臟，有助于教學互動及醫患溝通。
2 3D 打印技術在肝移植中的個體化應用
迄今為止，對于終末期肝病、腎衰竭等醫學難題，臨床上行之有效的治療方式仍為器官移植手術，然而器官移植一直以來都存在著捐獻的器官往往供不應求，異體器官移植易出現排斥現象等問題。近年來，隨著 3D 打印技術在生物醫學領域的發展，器官移植所面臨的難題有了解決的可能。
相比其他的組織工程技術，3D 打印技術具有復雜外形與可控內部微結構一體化制造的優勢，能將生物材料加工成具有良好生物相容性的器官支架，通過在器官支架上種植細胞，有望構建具有生物學功能的活體組織或器官。Huang 等[12]采用激光燒結技術構建了 3D 通道支架，結果發現，3D 通道支架上肝細胞的葡萄糖消耗和白蛋白分泌均隨著時間增加而增加，循環灌流增加了 3D 通道內肝細胞的葡萄糖消耗和白蛋白分泌，且與靜態條件比較差異具有統計學意義，提示 3D 打印技術構建的 3D 通道支架能維持肝細胞良好的代謝能力。Zhong 等[13]應用肝損傷并伴有三分之二肝切除的小鼠進行研究，結果發現，腹腔植入了不帶肝細胞生物支架的小鼠最多可存活 17 d，而植入帶有肝細胞生物支架的小鼠存活時間更長，最多可存活 26 d，進一步說明通過在 3D 支架上種植細胞的方式有再造體外肝臟的潛力。然而由于該方法存在一定的局限性，如種植的細胞在生物支架上無法均勻分布以及種植的細胞類型單一等，因此，再生醫學科學家進一步利用含有活體細胞的“生物墨水”為材料，打印出具有生物活性的立體細胞組織架構。Wang 等[14]通過低溫沉積制造技術構建了多層肝細胞結構，結果發現，多層肝細胞結構中肝細胞仍可大量存活，并維持白蛋白、尿素和甘油三酯的合成長達 45 d 以上，說明生物 3D 打印技術構建的多層肝細胞結構具有較久維持肝細胞合成功能的能力，有望構建具有良好功能的體外肝臟組織。最近，Kang 等[15]以肝樣細胞和水凝膠作為“生物墨水”，應用生物 3D 打印技術完成肝臟組織的構建，該研究發現，移植進小鼠腹腔的肝臟組織中的肝樣細胞數量增多、白蛋白表達增強，且與體外的肝臟組織相比差異具有統計學意義，進一步說明生物 3D 打印技術構建的肝臟組織在體內也具有良好的生物活性，有望用于肝移植。以上研究表明，通過在 3D 支架上種植細胞獲得組織或器官，或者通過生物 3D 打印技術直接打印組織或器官這兩種方式，均能重構具有良好功能的體外肝臟組織，且有望用于肝移植，從而延長人類壽命。
雖然通過生物 3D 打印技術構建可供移植的組織或器官目前還存在一些問題亟待解決，但臨床上已成功應用 3D 打印的肝臟仿真模型用于肝移植的術前規劃和術中指導。Zein 等[16]通過 3D 打印的肝臟模型可成功評估血管及膽管的解剖結構，從而減少了肝移植手術中的冷缺血時間，增加了肝移植手術的成功率。3D 打印技術不僅在成人肝移植中有重要作用，在兒童肝移植中也有突破性進展。Soejima 等[17]應用噴墨打印技術，打印了患有先天性膽道閉鎖患兒的腹腔仿真模型和患兒父親的肝臟仿真模型，通過腹腔仿真模型對患兒腹腔容積進行了精確測定，再根據患兒腹腔容積對肝臟仿真模型進行術前模擬修整，最終成功將患兒父親提供的適當大小的肝臟組織移植給了患兒，且避免了由于供肝體積過大而導致的并發癥。因此，3D 打印技術通過構建肝臟仿真模型，能精確地提供供肝的體積信息和可視化的內部結構，有效避免對肝臟周圍組織造成人為損傷以及避免產生不必要的并發癥。總之，3D 打印技術的使用不僅有助于實現精準化、個性化的移植手術，并且有望實現體外培養發育形成可供移植的組織或器官，而且如果使用患者自身的細胞，不僅不會產生免疫排斥現象，還能有效地解決器官供不應求的問題，促進人造人體器官的發展。
3 生物 3D 打印技術在藥物肝臟代謝中的應用
肝臟是藥物代謝的主要器官，具有多種參與藥物代謝相關的酶和轉運體。雖然傳統二維（two dimension，2D）細胞培養模型在藥物代謝研究中已經顯示出了巨大潛力，但是 2D 培養的細胞是平面生長的，缺乏細胞與細胞外基質以及細胞與細胞間的接觸，細胞容易去極化，而且低表達肝藥酶和轉運體，導致藥物代謝研究存在一定的局限性。因此，科學家開始關注細胞的 3D 培養，因為 3D 培養的細胞模型具有更貼近組織器官的立體結構和更好的生物學功能[18]。其中，生物 3D 打印技術可以構建復雜的肝臟微結構和動態的肝臟微環境，能為藥物代謝研究提供更好的方法。Jeon 等[19]以人肝癌細胞株 HepG2 和海藻酸鹽為材料，通過生物 3D 打印技術構建了體外 3D 肝細胞培養模型，研究發現，3D 培養的 HepG2 細胞中脫唾液酸糖蛋白受體 1、酪氨酸氨基轉移酶表達水平較高，且與 2D 培養的 HepG2 細胞相比差異具有統計學意義，提示生物 3D 打印技術構建的 3D 細胞培養使肝細胞擁有更強的肝臟基因表達，可用來研究基因表達的變化。Bhise 等[20]通過生物 3D 打印技術構建了體外微小肝臟，通過流動培養與靜態培養兩種不同方式的比較，結果發現流動培養的微小肝臟中 HepG2 白蛋白分泌增大、尿素合成增多，提示流動培養條件比靜態培養條件更有利于研究肝臟代謝功能。此外，Kim 等[21]通過生物 3D 打印技術構建了間充質干細胞和肝細胞共存的肝臟組織，結果發現，肝臟組織中間充質干細胞和肝細胞存活 7 d 且無形態學的改變；同時，間充質干細胞和肝細胞共存的肝臟組織白蛋白分泌和尿素合成增加，脫唾液酸糖蛋白受體 1 表達水平提高，且與只含肝細胞的肝臟組織比較差異具有統計學意義，說明間充質干細胞作為輔助細胞，其分泌的細胞因子可為肝細胞的生長提供支持，而采用生物 3D 打印技術進行多細胞打印有利于構建更接近于人體的肝臟組織。這些研究表明，生物 3D 打印技術構建的肝臟組織能更好地維持肝臟功能，同時流動培養有利于模擬體內肝臟微環境。
此外，Kizawa 等[22]以原代肝細胞和大鼠成纖維細胞為材料，通過生物 3D 打印技術構建了肝臟組織，結果發現，體外肝臟組織能維持細胞色素 P450（cytochrome P450，CYP450）的亞型 CYP3A4 的活性高達 50 d。Ma 等[23]研究也發現，與 2D 細胞培養模型相比，通過生物 3D 打印技術構建的肝臟組織中 CYP3A4 表達水平顯著升高，而肝藥酶誘導劑利福平使 CYP3A4、CYP2C9 和 CYP2C19 表達水平進一步升高，但有趣的是，在 2D 細胞培養模型中，利福平并沒有誘導 CYP3A4、CYP2C9 和 CYP2C19 表達水平的升高，表明生物 3D 打印技術構建的肝臟組織中肝藥酶活性更好。Organovo 公司以肝細胞、肝竇內皮細胞和肝形狀細胞為材料，應用自動化的生物打印方法構建了體外肝臟組織，結果發現，利福平的誘導使 CYP3A4 介導的咪達唑侖的代謝顯著增加[24]，提示生物 3D 打印技術構建的肝臟組織能進行藥物代謝研究。此外，Snyder 等[25]以人肝癌細胞株 HepG2 和人乳腺上皮細胞株 M10 為材料，通過生物 3D 打印技術構建了肝臟組織，研究發現，加入了前藥氨磷汀的肝臟組織中輻射損傷的細胞百分比下降，且與對照組肝臟組織比較差異具有統計學意義，證實了氨磷汀對肝臟的輻射防護作用，表明生物 3D 打印技術構建的肝臟組織可用來進行藥物生物轉化、作用效果的研究。總之，通過生物 3D 打印技術構建的肝臟組織，不僅能用于研究肝藥酶活性，而且能為藥物代謝研究提供一個很好的方法。
4 生物 3D 打印技術在藥物肝毒性評價中的應用
藥物性肝損傷是造成藥物研發失敗、藥物被限制使用甚至撤出市場的主要原因之一，也是引發肝臟疾病的重要原因之一，因此如果能夠準確預測由于藥物對人體肝臟的損傷而導致的毒性作用就顯得尤為重要。生物 3D 打印技術能構建一種形態和功能上更接近于人類真實肝臟的三維組織結構，因而能更好地模擬人體肝臟對藥物的反應，利用生物 3D 打印技術構建的活性肝臟組織進行新藥肝毒性評價，不僅可以節省研發時間和費用，還能大大減少動物實驗的開展。
為了評價藥物對肝臟的損傷程度，Organovo 公司應用自動化的生物打印平臺構建了肝臟組織，使用 100 μmol/L 的曲格列酮和吡格列酮處理肝臟組織 7 d，結果發現，具有嚴重肝毒性的曲格列酮使肝臟組織三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水平顯著降低了 93%，而吡格列酮使肝組織 ATP 水平僅降低了 24%，表明生物 3D 打印技術構建的肝臟組織能敏感地檢測藥物引起的線粒體功能變化，進而反映藥物對肝功能損傷的程度[24]。Bhise 等[20]使用 15 mmol/L 對乙酰氨基酚處理生物 3D 打印技術構建的肝臟組織 6 d，結果顯示對乙酰氨基酚處理組肝臟組織中白蛋白、轉鐵蛋白和銅藍蛋白等水平顯著降低，多藥耐藥相關蛋白 2 的表達和成核密度也顯著降低，提示通過生物 3D 打印技術構建的肝臟組織能用于檢測對乙酰氨基酚等藥物引起的肝臟損傷。此外，Nguyen 等[18]用曲伐沙星或左氧氟沙星處理通過生物 3D 打印技術構建的肝臟組織，結果發現，4 μmol/L 的曲伐沙星就能顯著降低肝臟組織的白蛋白和 ATP 水平，且通過蘇木精–伊紅染色從形態學上觀察到曲伐沙星導致肝細胞壞死；而左氧氟沙星高達 100 μmol/L 時才導致肝臟組織白蛋白水平的降低，且對肝臟組織 ATP 水平無影響，這些進一步表明了生物 3D 打印技術構建的肝臟組織能敏感地反映藥物對肝臟的損傷。此外，他們進一步發現，在 2D 培養的肝細胞上，曲伐沙星只有在 100 μmol/L 劑量時，才能顯著降低白蛋白和 ATP 水平，而在 3D 打印技術構建的肝臟組織中 4 μmol/L 就顯著降低了肝細胞的白蛋白和 ATP 水平，說明通過生物 3D 打印技術構建的肝臟組織對藥物肝毒性具有更高的敏感性。因為肝臟特異性標志分子和肝功能變化能反映肝臟的損傷程度，因此，應用生物 3D 打印技術構建的肝臟組織可研究藥物對肝臟毒性的差異，將是理想的評價藥物肝毒性的模型。
5 發展趨勢
本文介紹了 3D 打印技術在肝切除術和肝移植術中的個體化應用，還重點闡述了生物 3D 打印技術在肝移植、藥物肝臟代謝和肝毒性評價中的研究進展。目前，生物 3D 打印技術發展迅速，但大部分研究還停留在單細胞打印上，多細胞打印仍存在較多的技術瓶頸，其中如何將不同種類和功能的細胞排列在一個特定的 3D 結構中，從而構建出具有復雜結構的組織或器官并實現其基本的功能是目前最主要的問題。3D 打印技術在肝臟構建方面已取得了一些成績，相信在不久的將來，隨著影像學和材料科學的發展，通過 3D 打印技術構建的肝臟模型的精確度和仿真程度將會不斷提高，而通過生物 3D 打印技術重構的個體化肝臟組織有望應用到肝臟疾病的臨床治療中。