側向層析技術以其簡單、快速、靈敏、經濟等優勢廣泛應用于即時檢驗、現場檢驗以及家庭自檢中。合適的標記物的選擇對整個實驗的靈敏度起著重要作用。傳統的標記物有膠體金、納米硒以及納米碳等，尤以膠體金最為常用。近年來新型標記物的出現，如量子點、納米酶等，使得側向層析有了進一步的發展，實現了從定性檢測逐步向定量檢測的轉變。本文旨在介紹目前已有的側向層析標記物，為側向層析工作者篩選合適的標記物提供一定的研究依據。
引用本文： 靖靜, 王志增. 側向層析技術標記物研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(4): 661-664. doi: 10.7507/1001-5515.201703005 復制
引言
側向層析技術（lateral flow assay，LFA）近年來發展迅速，在食品安全[1]、疾病診斷[2]、毒品檢測[3]、環境監測[4]等方面都有廣泛的應用。側向層析試紙條與酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）等檢測技術相比，具有簡單、快速、不依賴大型儀器設備、價格低廉等優勢，被廣泛應用于即時檢驗、現場檢驗以及家庭自檢[5-6]。隨著現實需求的不斷增加，側向層析的標記物也在不斷的探索研究中。理想的標記物應該具備性能穩定、制備簡單、靈敏度高、重復生產性高、假陽性低等特性，除此之外還應具備制備成本經濟的特點[7]。本文旨在通過總結 LFA 的原理與其標記物的研究進展，分析各類標記物的特點，希望能為以后側向層析實驗的研究提供一定的理論研究依據。
1 側向層析試紙條的原理
側向層析試紙條的核心部分如圖 1 所示，主要由支撐墊、樣品墊、結合墊、反應墊和吸水墊五部分組成。標記物通過靜電吸引、疏水作用、配位結合等非共價鍵作用與蛋白/核酸結合，形成蛋白/核酸—標記物復合體，將其固化在玻璃纖維膜上，形成結合墊[8]。將樣品加到試紙條的樣品墊，液體基質會層析到結合墊上，使固定于結合墊的蛋白/核酸—標記物復合體復溶，隨著毛細管作用，蛋白/核酸—標記物復合體會跟液體基質一起經反應墊朝吸水墊方向層析，當復合體層析到反應墊時，蛋白/核酸會與檢測帶和控制帶包被的蛋白/核酸發生反應，最終根據檢測線和質控線的反應情況對樣本中有無目標物質做出初步判斷[9]。
圖1
側向層析試紙條反應模板
Figure1.
Reaction template of lateral flow test strip
2 側向層析標記物的種類
根據納米粒子的特性，可以大致將側向層析標記物分為三類。一類為有色型的標記物，例如膠體金、納米硒、納米碳等，可通過肉眼觀察到顯色情況，直接辨別結果，通常用于定性或半定量檢測；另一類為熒光性標記物，通過一些簡單的機器捕捉熒光信號，實現對目標物質的定量分析；還有一些其他類型的標記物，例如免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMB）、納米酶等，通過捕捉試驗過程中的磁信號或酶學活性，實現對目標物質的檢測。
2.1 有色型側向層析標記物
2.1.1 膠體金
膠體金是由氯金酸在還原劑的作用下，形成的一種具有表面雙電層結構的納米粒子。膠體金制備簡單、性能穩定，具有良好的生物相容性，可以與蛋白質、核酸等通過非共價鍵結合；并且標記過程簡單、方便、快速，使其在快速檢測領域得到了廣泛的關注與應用[10-11]。雖然膠體金作為 LFA 的標記物具有很多優點，但是對于低濃度樣品的檢測，其靈敏度仍較低。盡管通過銀增強和核酸適配體等新方法提高了膠體金側向層析實驗的靈敏度，但這些方法使整個 LFA 變得復雜，背離了 LFA 操作簡便的初衷。另外，膠體金制備原料成本相對較高，所以還需尋找新的價格低廉、靈敏度高的標記物。
2.1.2 納米硒
納米硒是在一些大分子物質做穩定劑的前提下，通過使用抗壞血酸等還原劑還原亞硒酸，得到的橘黃色的納米硒粒子。與膠體金相比，納米硒制備過程簡單，制備原料經濟易得，納米粒子性能更加穩定[12]。1990 年，Oskiowicz 等最先將納米硒應用到側向層析試紙條的制備中，用來檢測人尿液中人絨毛膜促性腺激素的含量。多年來，納米硒在側向層析中的應用并不廣泛，直到 2014 年，本團隊[1]利用納米硒研制出了三聚氰胺快速檢測試紙條，才將納米硒重新帶入到了側向層析領域的研究。目前，僅有雅培公司研制的人類免疫缺陷病毒納米硒快速檢測試紙條投入市場使用。納米硒還有巨大的發展空間可待人們挖掘，隨著納米技術以及免疫診斷技術的發展，相信納米硒在該領域將會具有更廣闊的應用前景。
2.1.3 納米碳
1993 年 Degussa AG 公司從煙塵中提取的 SB4 型碳納米粒子首次作為標記物用于分析物的檢測[13]。納米碳制備簡單、成本低廉，制成的膠體性能穩定，可以與蛋白、核酸、多肽等多種探針結合，用于不同類型的樣品檢測。與膠體金和納米硒相比，黑色的納米粒子與白色的硝酸纖維素膜會形成更大的顏色反差，使得檢測結果更易辨別，提高了檢測靈敏度[14]。但是，由于納米碳在生產過程中易產生污染以及標記時間較長等缺點，導致納米碳的應用并不廣泛。
2.1.4 金磁納米顆粒
金磁納米顆粒通常由兩部分構成：具有磁學特性的核心以及由聚合物或貴金屬附著其表面構成[15]。其中金磁納米顆粒是 2001 年由崔亞麗團隊首次報道合成。通過 Fe3O4 與 HAuCl4·4H2O 混勻，在羥胺作用下將吸附在 Fe3O4 表面的 Au3+ 還原為 Au，然后用鹽酸清洗至 pH6-7。金磁顆粒因其良好的光學、磁學以及生物學特性，在側向層析中具有一定的應用。目前已有針對 C 反應蛋白以及心血管等疾病檢測的金磁顆粒的報道[16-17]。但是金磁納米粒子制備過程復雜、成本造價高，導致其在側向層析中的應用并不廣泛。隨著制備工藝的改善，金磁納米顆粒以其獨特的優勢，將會受到更多側向層析研究者的青睞。
2.2 熒光性側向層析標記物
有色型的膠體金、納米硒、納米碳等因其自身特點限制，大多用于定性檢測。即使通過改變標記的探針，借助一些儀器設備逐漸有定量檢測的報道出現，但是其靈敏度仍舊較低，并且使整個試驗變得復雜，也增加了試驗的成本，與側向層析試紙條使用簡單、檢測快速、價格低廉的優勢相背離。因此，熒光微球、量子點（quantum dots，QDs）、上轉發光（up-converting phosphor，UCP）等熒光性標記物應運而生。
2.2.1 熒光微球
熒光微球是一類負載熒光物質的球形納米粒子，受外界能量刺激能激發出特定的熒光。熒光微球的載體多為有機或聚合物材料，具有穩定的形態結構以及高效的發光效率，作為一種新的示蹤標記物已經被廣泛應用于側向層析實驗、流式細胞術、高通量藥物篩選等生物醫學領域[18-19]。Liu 等[20]以熒光微球為標記物研制出來的用于檢測黃曲霉素 B1 的試紙條，靈敏度為 2.5 μg/mL，與高效液相色譜法的檢測結果具有高度一致性。Xie 等[21]分別以熒光微球和膠體金為標記物制備檢測大腸桿菌 O157：H7 的側向層析試紙條，并對二者進行比較。發現熒光微球用作標記物比膠體金具有更高的靈敏度和抗體結合率，其穩定性也優于膠體金。熒光微球作為一種新興的標記物，因其獨特的優點，受到人們的廣泛關注。目前已經有以熒光微球為標記物的熒光定量快速檢測試紙條在市場上使用，隨著檢測方法的進步，熒光微球作為 LFA 標記物將會占據更多的市場份額。
2.2.2 量子點
QDs 是一種由Ⅱ－Ⅵ族或Ⅲ－Ⅴ族元素如 CdSe、ZnSe、InP、InAs 等組成的具有特殊電子性質與光學性質的半導體納米粒子，在最近 10 年中得到廣泛的研究與應用[22-23]。QDs 可以和不同的生物分子結合，例如蛋白、抗體、適配體、寡核苷酸適配子等，然后形成一個兼具電化學特性和生物學特性的結合物在 LFA 模板中進行檢測[24-25]。Bruno[26]把大腸桿菌寡核苷酸適配子與 QDs 結合，研究出的側向層析試紙條靈敏度比同等條件下膠體金試紙條高出 10 倍之多。QDs 的這些獨特優勢，使其成為 LFA 的新寵，目前市場上已經出現了很多以 QDs 為標記物的產品，相信在不久的將來，QDs 在 LFA 上會有更多更廣泛的應用。
2.2.3 上轉發光
20 世紀 70 年代，科學家們合成了一類反斯托克斯規則的發光材料——UCP，由稀土元素摻雜某些晶體晶格構成。UCP 在紅外光區（波長 > 780 nm）被激發，發射出不同波長的光，且發射光的波長短于激發波長 [27-28]。UCP 作為熒光標記物，與傳統的熒光標記物相比具有以下優勢：① 獨有的上轉換發光現象，降低了實驗中的背景干擾，靈敏度較高[29]；②UCP 由惰性材料合成，不易褪色，使 LFA 試紙條可以長期儲存；③ 因其強大的反斯托克斯位移效應，不同顏色的 UCP 粒子可以被同一紅外光激發，可用于同一樣品的多元化分析[30-31]。但是 UCP 顆粒需要經過一系列的處理才能作為穩定的標記物，制備復雜，市場上的成品顆粒又價格高昂，成為制約 UCP 發展的主要因素。
2.3 其他側向層析標記物
除了有色型和熒光性 LFA 標記物外，還有 IMB[32]、脂質體[33]以及新興的納米酶[34]等作為標記物應用于 LFA 中。
IMB 是一種表面包裹某種化學基團的球形磁性納米微粒，穩定性好、靈敏度高，可以作為多元檢測的標記物[35]。Wang 等[36]用 300 nm 的 IMB 作為標記物，研究出的檢測炭疽桿菌的側向層析試紙條最低檢出限為 5 × 103 CFU/mL。脂質體是由磷脂分子組成的雙親性膜性微球，內含水相空間，可以封裝和固定標記探針，例如酶、染料、熒光物質等。Shukla 等[33]研制的檢測沙門氏菌的側向層析試紙條，最低檢出限為 102 CFU/L，其靈敏度提高了 2～3 倍。然而，由于 IMB 和脂質體制備工藝復雜、成本較高，目前并沒有廣泛應用于側向層析實驗中。
納米酶由閻錫蘊課題組發明合成，具有納米尺寸效應的同時具有酶學活性，在納米科學以及生物學領域都有廣泛的應用[37]。納米酶埃博拉檢測試紙條的靈敏度可達 1 ng/mL，比膠體金埃博拉檢測試紙條高 100 倍，可達到 ELISA 的靈敏度，同時準確性比 ELISA 高[34]。所以納米酶在側向層析中同樣具有良好的科研價值以及開發應用價值。
3 結論與展望
不論是應用在臨床診斷、食品安全控制還是法醫學鑒定中的技術，都應該滿足現場生物檢測的高通量性、高準確性、客觀定量和操作簡便的特性。而 LFA 滿足這些特性，是最適用于即時檢驗與現場檢驗的一種檢測手段。目前，市場應用最廣泛的就是以膠體金作為標記物的試紙條，但是它只能實現簡單的定性檢測，不能實現定量檢測，也不適用于多元化檢測。隨著標記技術的發展，利用 QDs、IMB、脂質體等新型標記物，可以發展多元化的定性、定量檢測，提高了側向層析試紙條的靈敏度，使側向層析試紙條在快速檢測領域得到極大發展。相信在不久的以后，不論是疾病的診斷還是食品安全的監測都可以像現在的早孕試紙條與血糖檢測那樣，進入家庭，實現疾病的自我監控與預防和食品安全的檢測與監督，真正把預防與治療結合起來，提高人們的生活健康質量。
引言
側向層析技術（lateral flow assay，LFA）近年來發展迅速，在食品安全[1]、疾病診斷[2]、毒品檢測[3]、環境監測[4]等方面都有廣泛的應用。側向層析試紙條與酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）等檢測技術相比，具有簡單、快速、不依賴大型儀器設備、價格低廉等優勢，被廣泛應用于即時檢驗、現場檢驗以及家庭自檢[5-6]。隨著現實需求的不斷增加，側向層析的標記物也在不斷的探索研究中。理想的標記物應該具備性能穩定、制備簡單、靈敏度高、重復生產性高、假陽性低等特性，除此之外還應具備制備成本經濟的特點[7]。本文旨在通過總結 LFA 的原理與其標記物的研究進展，分析各類標記物的特點，希望能為以后側向層析實驗的研究提供一定的理論研究依據。
1 側向層析試紙條的原理
側向層析試紙條的核心部分如圖 1 所示，主要由支撐墊、樣品墊、結合墊、反應墊和吸水墊五部分組成。標記物通過靜電吸引、疏水作用、配位結合等非共價鍵作用與蛋白/核酸結合，形成蛋白/核酸—標記物復合體，將其固化在玻璃纖維膜上，形成結合墊[8]。將樣品加到試紙條的樣品墊，液體基質會層析到結合墊上，使固定于結合墊的蛋白/核酸—標記物復合體復溶，隨著毛細管作用，蛋白/核酸—標記物復合體會跟液體基質一起經反應墊朝吸水墊方向層析，當復合體層析到反應墊時，蛋白/核酸會與檢測帶和控制帶包被的蛋白/核酸發生反應，最終根據檢測線和質控線的反應情況對樣本中有無目標物質做出初步判斷[9]。
圖1
側向層析試紙條反應模板
Figure1.
Reaction template of lateral flow test strip
2 側向層析標記物的種類
根據納米粒子的特性，可以大致將側向層析標記物分為三類。一類為有色型的標記物，例如膠體金、納米硒、納米碳等，可通過肉眼觀察到顯色情況，直接辨別結果，通常用于定性或半定量檢測；另一類為熒光性標記物，通過一些簡單的機器捕捉熒光信號，實現對目標物質的定量分析；還有一些其他類型的標記物，例如免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMB）、納米酶等，通過捕捉試驗過程中的磁信號或酶學活性，實現對目標物質的檢測。
2.1 有色型側向層析標記物
2.1.1 膠體金
膠體金是由氯金酸在還原劑的作用下，形成的一種具有表面雙電層結構的納米粒子。膠體金制備簡單、性能穩定，具有良好的生物相容性，可以與蛋白質、核酸等通過非共價鍵結合；并且標記過程簡單、方便、快速，使其在快速檢測領域得到了廣泛的關注與應用[10-11]。雖然膠體金作為 LFA 的標記物具有很多優點，但是對于低濃度樣品的檢測，其靈敏度仍較低。盡管通過銀增強和核酸適配體等新方法提高了膠體金側向層析實驗的靈敏度，但這些方法使整個 LFA 變得復雜，背離了 LFA 操作簡便的初衷。另外，膠體金制備原料成本相對較高，所以還需尋找新的價格低廉、靈敏度高的標記物。
2.1.2 納米硒
納米硒是在一些大分子物質做穩定劑的前提下，通過使用抗壞血酸等還原劑還原亞硒酸，得到的橘黃色的納米硒粒子。與膠體金相比，納米硒制備過程簡單，制備原料經濟易得，納米粒子性能更加穩定[12]。1990 年，Oskiowicz 等最先將納米硒應用到側向層析試紙條的制備中，用來檢測人尿液中人絨毛膜促性腺激素的含量。多年來，納米硒在側向層析中的應用并不廣泛，直到 2014 年，本團隊[1]利用納米硒研制出了三聚氰胺快速檢測試紙條，才將納米硒重新帶入到了側向層析領域的研究。目前，僅有雅培公司研制的人類免疫缺陷病毒納米硒快速檢測試紙條投入市場使用。納米硒還有巨大的發展空間可待人們挖掘，隨著納米技術以及免疫診斷技術的發展，相信納米硒在該領域將會具有更廣闊的應用前景。
2.1.3 納米碳
1993 年 Degussa AG 公司從煙塵中提取的 SB4 型碳納米粒子首次作為標記物用于分析物的檢測[13]。納米碳制備簡單、成本低廉，制成的膠體性能穩定，可以與蛋白、核酸、多肽等多種探針結合，用于不同類型的樣品檢測。與膠體金和納米硒相比，黑色的納米粒子與白色的硝酸纖維素膜會形成更大的顏色反差，使得檢測結果更易辨別，提高了檢測靈敏度[14]。但是，由于納米碳在生產過程中易產生污染以及標記時間較長等缺點，導致納米碳的應用并不廣泛。
2.1.4 金磁納米顆粒
金磁納米顆粒通常由兩部分構成：具有磁學特性的核心以及由聚合物或貴金屬附著其表面構成[15]。其中金磁納米顆粒是 2001 年由崔亞麗團隊首次報道合成。通過 Fe3O4 與 HAuCl4·4H2O 混勻，在羥胺作用下將吸附在 Fe3O4 表面的 Au3+ 還原為 Au，然后用鹽酸清洗至 pH6-7。金磁顆粒因其良好的光學、磁學以及生物學特性，在側向層析中具有一定的應用。目前已有針對 C 反應蛋白以及心血管等疾病檢測的金磁顆粒的報道[16-17]。但是金磁納米粒子制備過程復雜、成本造價高，導致其在側向層析中的應用并不廣泛。隨著制備工藝的改善，金磁納米顆粒以其獨特的優勢，將會受到更多側向層析研究者的青睞。
2.2 熒光性側向層析標記物
有色型的膠體金、納米硒、納米碳等因其自身特點限制，大多用于定性檢測。即使通過改變標記的探針，借助一些儀器設備逐漸有定量檢測的報道出現，但是其靈敏度仍舊較低，并且使整個試驗變得復雜，也增加了試驗的成本，與側向層析試紙條使用簡單、檢測快速、價格低廉的優勢相背離。因此，熒光微球、量子點（quantum dots，QDs）、上轉發光（up-converting phosphor，UCP）等熒光性標記物應運而生。
2.2.1 熒光微球
熒光微球是一類負載熒光物質的球形納米粒子，受外界能量刺激能激發出特定的熒光。熒光微球的載體多為有機或聚合物材料，具有穩定的形態結構以及高效的發光效率，作為一種新的示蹤標記物已經被廣泛應用于側向層析實驗、流式細胞術、高通量藥物篩選等生物醫學領域[18-19]。Liu 等[20]以熒光微球為標記物研制出來的用于檢測黃曲霉素 B1 的試紙條，靈敏度為 2.5 μg/mL，與高效液相色譜法的檢測結果具有高度一致性。Xie 等[21]分別以熒光微球和膠體金為標記物制備檢測大腸桿菌 O157：H7 的側向層析試紙條，并對二者進行比較。發現熒光微球用作標記物比膠體金具有更高的靈敏度和抗體結合率，其穩定性也優于膠體金。熒光微球作為一種新興的標記物，因其獨特的優點，受到人們的廣泛關注。目前已經有以熒光微球為標記物的熒光定量快速檢測試紙條在市場上使用，隨著檢測方法的進步，熒光微球作為 LFA 標記物將會占據更多的市場份額。
2.2.2 量子點
QDs 是一種由Ⅱ－Ⅵ族或Ⅲ－Ⅴ族元素如 CdSe、ZnSe、InP、InAs 等組成的具有特殊電子性質與光學性質的半導體納米粒子，在最近 10 年中得到廣泛的研究與應用[22-23]。QDs 可以和不同的生物分子結合，例如蛋白、抗體、適配體、寡核苷酸適配子等，然后形成一個兼具電化學特性和生物學特性的結合物在 LFA 模板中進行檢測[24-25]。Bruno[26]把大腸桿菌寡核苷酸適配子與 QDs 結合，研究出的側向層析試紙條靈敏度比同等條件下膠體金試紙條高出 10 倍之多。QDs 的這些獨特優勢，使其成為 LFA 的新寵，目前市場上已經出現了很多以 QDs 為標記物的產品，相信在不久的將來，QDs 在 LFA 上會有更多更廣泛的應用。
2.2.3 上轉發光
20 世紀 70 年代，科學家們合成了一類反斯托克斯規則的發光材料——UCP，由稀土元素摻雜某些晶體晶格構成。UCP 在紅外光區（波長 > 780 nm）被激發，發射出不同波長的光，且發射光的波長短于激發波長 [27-28]。UCP 作為熒光標記物，與傳統的熒光標記物相比具有以下優勢：① 獨有的上轉換發光現象，降低了實驗中的背景干擾，靈敏度較高[29]；②UCP 由惰性材料合成，不易褪色，使 LFA 試紙條可以長期儲存；③ 因其強大的反斯托克斯位移效應，不同顏色的 UCP 粒子可以被同一紅外光激發，可用于同一樣品的多元化分析[30-31]。但是 UCP 顆粒需要經過一系列的處理才能作為穩定的標記物，制備復雜，市場上的成品顆粒又價格高昂，成為制約 UCP 發展的主要因素。
2.3 其他側向層析標記物
除了有色型和熒光性 LFA 標記物外，還有 IMB[32]、脂質體[33]以及新興的納米酶[34]等作為標記物應用于 LFA 中。
IMB 是一種表面包裹某種化學基團的球形磁性納米微粒，穩定性好、靈敏度高，可以作為多元檢測的標記物[35]。Wang 等[36]用 300 nm 的 IMB 作為標記物，研究出的檢測炭疽桿菌的側向層析試紙條最低檢出限為 5 × 103 CFU/mL。脂質體是由磷脂分子組成的雙親性膜性微球，內含水相空間，可以封裝和固定標記探針，例如酶、染料、熒光物質等。Shukla 等[33]研制的檢測沙門氏菌的側向層析試紙條，最低檢出限為 102 CFU/L，其靈敏度提高了 2～3 倍。然而，由于 IMB 和脂質體制備工藝復雜、成本較高，目前并沒有廣泛應用于側向層析實驗中。
納米酶由閻錫蘊課題組發明合成，具有納米尺寸效應的同時具有酶學活性，在納米科學以及生物學領域都有廣泛的應用[37]。納米酶埃博拉檢測試紙條的靈敏度可達 1 ng/mL，比膠體金埃博拉檢測試紙條高 100 倍，可達到 ELISA 的靈敏度，同時準確性比 ELISA 高[34]。所以納米酶在側向層析中同樣具有良好的科研價值以及開發應用價值。
3 結論與展望
不論是應用在臨床診斷、食品安全控制還是法醫學鑒定中的技術，都應該滿足現場生物檢測的高通量性、高準確性、客觀定量和操作簡便的特性。而 LFA 滿足這些特性，是最適用于即時檢驗與現場檢驗的一種檢測手段。目前，市場應用最廣泛的就是以膠體金作為標記物的試紙條，但是它只能實現簡單的定性檢測，不能實現定量檢測，也不適用于多元化檢測。隨著標記技術的發展，利用 QDs、IMB、脂質體等新型標記物，可以發展多元化的定性、定量檢測，提高了側向層析試紙條的靈敏度，使側向層析試紙條在快速檢測領域得到極大發展。相信在不久的以后，不論是疾病的診斷還是食品安全的監測都可以像現在的早孕試紙條與血糖檢測那樣，進入家庭，實現疾病的自我監控與預防和食品安全的檢測與監督，真正把預防與治療結合起來，提高人們的生活健康質量。
