臨床上，已將深部腦刺激（DBS）技術成功應用于治療多種腦部疾病。近年的研究推測，DBS 技術使用的電脈沖高頻刺激（HFS）可以改變神經元動作電位的病理性節律發放，這可能是 DBS 治療腦部疾病的重要機制之一，但是這種推測尚需實驗數據的證實。本文在已麻醉的大鼠海馬 CA1 區的輸入軸突束薛氏側支（Schaffer collaterals）施加時長為 1 min、頻率為 100 Hz 的 HFS，并分析刺激下游 CA1 區的錐體神經元和中間神經元的鋒電位，考察兩種神經元的節律性動作電位發放的變化情況。結果顯示，麻醉大鼠 CA1 區的場電位存在明顯的 θ 節律，且在頂樹突層尤其明顯，而神經元鋒電位與 θ 節律存在鎖相關系。與此基線記錄相比較，在 HFS 期間，錐體神經元的鋒電位與頂樹突層 θ 節律的鎖相值從 0.36 ± 0.12 顯著減小至 0.06 ± 0.04（P < 0.001，配對 t 檢驗，N = 8）；中間神經元鋒電位的鎖相值也從 0.27 ± 0.08 減小至 0.09 ± 0.05（P < 0.01，配對 t 檢驗，N = 8）。兩類神經元與胞體層 θ 節律的鎖相關系也有類似改變。此結果表明，對軸突束施加 HFS 可以消除下游神經元動作電位發放與場電位 θ 節律之間的鎖相關系，改變神經元的節律性發放模式。這種現象產生的機制可能是 HFS 誘導的軸突傳導障礙，此發現對于深入研究 DBS 的作用機制具有重要的意義。
引用本文： 馬維健, 封洲燕, 周文杰, 王兆祥, 蔡紫燕. 高頻電刺激改變神經元發放與場電位節律之間的鎖相關系. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(1): 1-7. doi: 10.7507/1001-5515.201706073 復制
引言
深部腦刺激（deep brain stimulation，DBS）技術在臨床上已成功用于治療帕金森氏癥和癲癇等神經系統疾病，近年來，它對于難治性強迫癥和抑郁癥等精神疾病的治療效果也逐漸顯現[1-3]。臨床研究結果表明，DBS 的電脈沖頻率達到 90 Hz 以上時才能取得較好的療效，因此也被稱為高頻電刺激（high frequency stimulation，HFS）[4]。但是，HFS 用于疾病治療的生理機制還沒有完全明確，阻礙了 DBS 臨床應用的快速發展[5-6]。
目前，有關 HFS 機制的假說主要分為抑制作用、興奮作用和調制作用 3 種。作為神經外科損毀手術的替代方法，在早期，HFS 的作用被推測為抑制神經元的活動。持續的 HFS 可能激活抑制性神經回路[7]，或者可能導致興奮性突觸的神經遞質耗竭[8]，從而產生抑制作用。但是許多動物實驗和數學模型仿真等的研究結果都表明，HFS 具有興奮作用，可以提高某些神經元動作電位的發放率[9]。而近來的研究又表明，HFS 具有調制神經元活動的作用，包括對于各種神經元動作電位發放模式的調制、對于局部場電位的調制等[10-13]。這種調制作用可能誘導出新的神經元活動節律，取代病理性活動，從而獲得治療效果。
腦內神經元動作電位的發放與局部場電位（local field potentials，LFP）節律之間往往存在鎖相關系，從而形成神經元的節律性發放。這種節律性發放即有生理性的，在神經信息的編碼和解碼過程中具有重要作用[14]；也有病理性的，是許多腦疾病的特征表現。例如，海馬 CA1 區神經元的發放與 LFP 的 θ 節律之間存在明顯的鎖相關系，這種鎖相關系不僅與記憶的形成有關[15]，也與癲癇的形成有關[16]。此外，帕金森氏癥的特征之一也是神經元產生異常的節律性發放[17]。有研究表明，HFS 除了引起神經元動作電位發放率的變化之外，還可以抑制病理性的節律發放[10, 18-19]。由于神經元的發放節律與 LFP 節律相關；因此我們推測，HFS 可能通過改變兩者之間的鎖相關系來調節神經元的活動。
為了驗證此推測，本文在麻醉大鼠海馬 CA1 區的輸入軸突束薛氏側支（Schaffer collaterals，下文統稱為：Schaffer 側支）上施加 HFS，考察下游 CA1 區胞體層細胞外記錄的單細胞動作電位[即鋒電位（spike）]及其與 LFP 的 θ 節律之間的鎖相關系的變化情況，分析 HFS 對鋒電位節律性發放的影響。本文的研究結果或可為今后探究 DBS 的作用機制提供一些新的信息。
1 材料與方法
1.1 動物手術與電極植入
本實驗采用成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠共 8 只（260～400 g），購自中國浙江省醫學科學院實驗動物中心），腹腔注射烏拉坦（urethane），劑量為 1.25 g/kg。麻醉后，固定于腦立體定位儀上。切開大鼠鼻部皮膚，在鼻骨上固定兩顆不銹鋼螺釘，用作參考電極和接地電極。
切開大鼠頭部皮膚，除去部分顱骨后，植入記錄電極和刺激電極。記錄電極采用 16 通道雙列微電極陣列（Poly2，Neuro-Nexus Technologies 公司，美國）植入至海馬 CA1 區，定位是前鹵后 3.5 mm，旁開 2.7 mm，大腦皮層表面向下深度約 2.5 mm。刺激電極采用雙極同芯電極（CBCSG75，FHC 公司，美國），植入至海馬 CA1 區的輸入通路 Schaffer 側支，定位為前鹵后 2.2 mm，旁開 2.0 mm，大腦皮層表面向下深度約 2.8 mm[12]。
在 Schaffer 側支上施加單脈沖刺激可以在下游胞體層和頂樹突層分別誘發群峰電位（population spike，PS）和興奮性突觸后場電位，根據記錄電極陣列上記錄到的波形特征，選擇胞體層和頂樹突層的通道信號（兩層次間距約為 0.4 mm），用于分析鋒電位和 θ 節律[13]。
1.2 記錄與刺激
記錄電極采集到的信號通過 16 通道放大器（3600，A-M System 公司，美國）放大 100 倍，頻率范圍為 0.3～5 000 Hz。然后通過 PowerLab 多通道采集系統（ML880，ADInstruments 公司，澳大利亞）以 20 kHz 的頻率進行采樣（模/數轉換分辨率為 16 位），數據存入硬盤，用于離線分析。本文將此記錄信號稱為原始信號。
脈沖刺激由單通道隔離式刺激器（2100，A-M System 公司，美國）產生，是脈寬為 0.1 ms 的雙相電流型脈沖。脈沖強度為 0.3～0.5 mA，頻率為 100 Hz，HFS 時長為 1 min。
1.3 鋒電位的分析
取記錄電極上位于 CA1 區胞體層的 4 個相鄰通道的記錄信號[20]，用于分析神經元的鋒電位。首先，應用線性插值法去除 HFS 期間的刺激偽跡[13]。然后，利用 PowerLab 配套的數據分析軟件 Labchart 7.0（ADInstruments Inc.，澳大利亞）將去偽跡后的信號進行高通濾波，截止頻率為 500 Hz，去除原始信號中的低頻場電位，得到多單元鋒電位信號（multiple unit activity，MUA）。再利用閾值法檢測 MUA 中的鋒電位，閾值設為信號標準差的 3～5 倍[21]。最后，采用鋒電位波形的主成分和幅值作為特征參數，利用鋒電位分類軟件 SpikeSort3D（Neuralynx Inc.，美國）完成 4 通道鋒電位的分類。并且根據錐體神經元和中間神經元鋒電位的波形特征，確定鋒電位歸屬的神經元類型[20, 22]。本文下面將分類之前的多單元鋒電位簡稱為 MUA。
1.4 鋒電位發放與場電位節律之間關系的分析
為了研究海馬 CA1 區神經元鋒電位發放與 LFP 的 θ 節律之間的鎖相關系，選擇位于胞體層和頂樹突層的各一個通道的記錄信號，將兩通道信號進行帶通濾波（2～5 Hz），提取麻醉狀態下大鼠海馬 CA1 區的 θ 節律信號[14]。
然后，采用區間統計法分析鋒電位與 θ 節律之間的鎖相關系[23]：將每個 θ 節律的周期 T 對應至 0°～360° 圓周上（設 θ 節律的峰點為 0°），并計算各周期 T 內每個鋒電位發放時刻所對應的相位角 αi（1 ≤ i ≤ n，n 為鋒電位個數），采用圓分布統計法計算鋒電位相位角的均值和標準差[24]。
鋒電位與 θ 節律之間鎖相關系的強弱用鎖相值（phase-locking value）來評估，設為 r。r 的計算公式為[25]：
 |
r 取值為 0～1。r 值越接近于 1，表示鋒電位與 θ 節律之間的鎖相關系越強；反之，r 值越接近 0，則鎖相關系越弱。
利用瑞利檢驗（Rayleigh test）判斷鋒電位與 θ 節律之間是否鎖相。也就是，對于單峰分布，計算概率值：
 |
當 P < 0.01 時，認為相位角 αi 的分布不均勻，即神經元的鋒電位與 θ 節律之間存在明顯的鎖相關系。
實驗數據均以均值 ± 標準差表示，采用配對 t 檢驗來判斷 HFS 期間與 HFS 前基線記錄數據之間的差別是否具有統計學意義。
2 結果
2.1 神經元鋒電位發放與場電位 θ 節律之間的鎖相關系
如圖 1 左圖所示，海馬 CA1 區的胞體層和頂樹突層都存在 θ 節律，且頂樹突層 LFP 的 θ 節律較明顯。胞體層的 MUA 與兩層次上的 θ 節律之間都存在鎖相關系。由于胞體層和頂樹突層的 θ 節律之間存在約 150° 的相位差，如圖 1 右圖所示，因此圖中示例的中間神經元 MUA 的發放分別集中于胞體層 θ 節律的下降相和頂樹突層 θ 節律的上升相。對于胞體層的 θ 節律（若峰點設為 0°），鋒電位的相位平均角為 123° ± 70°（n = 939），鎖相值 r = 0.26；對于頂樹突層的 θ 節律（若峰點設為 0°），鋒電位的相位平均角為 274° ± 60°（n = 939），鎖相值 r = 0.35。為了清楚地顯示鋒電位與 θ 節律之間的相位關系，圖 1 右圖重復顯示了 2 個 θ 周期的數據。
圖1
海馬 CA1 區神經元鋒電位與 θ 節律之間的鎖相關系
Figure1.
Phase-locking relationship between the neuronal spikes and the θ rhythms in the hippocampal CA1 region
8 只大鼠的實驗數據統計結果顯示，錐體神經元在胞體層 θ 節律上的平均發放相位角為 197° ± 55°，鎖相值 r = 0.32 ± 0.14；在頂樹突層上的平均發放相位角為 341° ± 75°，鎖相值 r = 0.36 ± 0.12。中間神經元的鋒電位在胞體層 θ 節律上的平均發放相位角為 116° ± 58°，鎖相值 r = 0.24 ± 0.14，在頂樹突層上的平均發放相位角為 278° ± 49°，鎖相值 r = 0.27 ± 0.08。兩類神經元的鋒電位發放與 θ 節律之間都存在明顯的鎖相關系（P < 0.001）。
這些結果表明，在烏拉坦麻醉狀態下的基線記錄中，海馬 CA1 區胞體層和頂樹突層上均存在明顯的 θ 節律，且它們之間存在一定的相移。神經元鋒電位的發放與兩層次的 θ 節律均存在明顯的鎖相關系。接下來我們研究 HFS 是否會改變這種鎖相關系。
2.2 HFS 對于神經元鋒電位發放鎖相關系的影響
如圖 2 所示，在 Schaffer 側支上施加時長為 1 min 、頻率為 100 Hz 的 HFS（圖中用陰影表示），期間 MUA 增加，頂樹突層的 θ 節律明顯減弱，而胞體層的 θ 節律變化不明顯。在分析 HFS 期間鋒電位與 θ 節律之間的鎖相關系時，為了避免 HFS 起始處誘發的群峰電位的干擾[12, 20]，取 HFS 后期的 45 s 信號用于刺激期間的鋒電位分析。相應地，取 HFS 之前 45 s 基線信號作為對照。同時為了避開緊隨 HFS 結束后的鋒電位消失的靜息期[20]，取 HFS 結束 2 min 之后的 45 s 的信號來考察恢復狀態。
圖2
HFS 對于場電位 θ 節律和神經元鋒電位發放的影響
Figure2.
Effects of HFS on LFP θ rhythms and neuronal spikes
如圖 3 所示，HFS 前 MUA 的發放在 LFP 的 θ 周期中鎖相關系明顯。但是，在 HFS 期間，雖然神經元發放率增加，MUA 與 θ 節律之間的鎖相關系卻不再明顯。HFS 結束后又恢復鎖相關系。8 只大鼠的實驗數據統計結果顯示，HFS 期間錐體和中間兩類神經元的鋒電位與 θ 節律的鎖相值 r 顯著減小。如圖 4 所示，錐體神經元的鋒電位與胞體層 θ 節律之間的鎖相值 r = 0.06 ± 0.03，明顯小于 HFS 前的 r = 0.32 ± 0.14（P < 0.001）；與頂樹突層 θ 節律之間的鎖相值 r = 0.06 ± 0.04，也明顯小于 HFS 前的 r = 0.36 ± 0.12（P < 0.001）。類似地，對于中間神經元的鋒電位，HFS 期間它們與胞體層 θ 節律之間的鎖相值 r = 0.07 ± 0.04 小于 HFS 前的 r = 0.24 ± 0.14（P < 0.01）；與頂樹突層的 θ 節律之間的鎖相值 r = 0.09 ± 0.05 也小于 HFS 前的 r = 0.27 ± 0.08（P < 0.01）。HFS 結束 2 min 后，兩類神經元鋒電位與 θ 節律之間的鎖相關系都恢復，如 圖 4 所示。
由于胞體層的 θ 節律與頂樹突層的 θ 節律之間存在較為固定的相位差，如圖 1 所示，因此鋒電位與兩 θ 節律的鎖相值比較接近。
圖3
HFS 對 MUA、θ 節律以及兩者鎖相關系的影響
Figure3.
Effects of HFS on MUA，θ rhythms as well as the phase-locking relationship between them
圖4
HFS 改變兩種神經元鋒電位與 θ 節律之間的鎖相關系
*
*
此結果表明，HFS 期間錐體神經元和中間神經元鋒電位的發放與 θ 節律之間的鎖相關系都有所減弱，神經元的 θ 節律發放消失。
3 討論
本文的研究結果表明，海馬 CA1 區輸入軸突束 Schaffer 側支上的 HFS 可以消除神經元動作電位發放與場電位 θ 節律之間的鎖相關系，改變下游神經元的節律性發放，其中的可能機制分析如下文所述。
首先，HFS 導致的 CA1 區 θ 節律的減弱可能是原因之一。HFS 期間場電位的 θ 節律（特別是頂樹突層的 θ 節律）被明顯抑制，如圖 2、圖 3 所示。這種抑制可能由 HFS 阻斷了上游與下游之間信息傳播引起的。有研究表明，海馬 CA1 區場電位的 θ 節律是多種機制作用的結果，包括來自上游 CA3 區神經元群體的節律性活動和來自嗅皮層的輸入，也包括錐體神經元頂樹突的電壓依賴性鈣離子流的作用等[14, 26-28]。而且，如圖 1 所示，基線記錄信號的頂樹突層 θ 節律的幅值明顯大于胞體層，表明上游 CA3 區對于頂樹突層的輸入可能有較大貢獻。本文 HFS 的作用位點（Schaffer 側支）就是 CA3 區錐體神經元至 CA1 區頂樹突的傳輸通路，而 HFS 可以導致軸突的傳導阻滯現象，阻止上游信息傳導至下游。這種傳導阻滯的可能原因是 HFS 產生軸突細胞膜外鉀離子濃度的升高。由于軸突束的膜外空間狹小，軸突興奮時外流的鉀離子積累起來，膜外過高的鉀離子濃度使得軸突產生去極化阻滯[29-30]。由此可見，Schaffer 側支上的 HFS 可能隔離了上游 CA3 區的 θ 節律振蕩，使得 CA1 區頂樹突層的 θ 節律明顯減弱[13]，進而減弱場電位節律對于神經元發放的調制作用，引起鋒電位節律性發放的消失。
其次，HFS 期間刺激脈沖的調制作用可能是神經元鋒電位發放模式改變的另一個原因。軸突上的 HFS 在阻斷上游與下游之間的信息傳導的同時，其中的脈沖仍然可以引起軸突產生某種興奮，并沿著軸突傳播至下游，引起下游 CA1 區神經元的發放增加，如圖 2 所示，并且改變下游神經元的發放模式[12, 20]。因此，如圖 3、圖 4 所示，當鋒電位的發放受到頻率為 100 Hz 的 HFS 的調制時，可以產生均勻分布的時間序列，消除低頻的 θ 節律發放。
綜上所述，軸突上的 HFS 對于下游神經元的調節可能由雙重作用引起。一方面，HFS 引起的軸突傳導阻滯切斷了上游原有節律性信息的傳播；另一方面，HFS 中包含的刺激脈沖對于下游神經元產生了新的調制作用。在這種雙重作用下，CA1 區神經元的 θ 節律發放消失。由于軸突相比神經元其他結構的興奮閾值要低，更容易被脈沖刺激激活[31]；因此，本文有關軸突 HFS 的研究結果可能對于不同刺激位點的 DBS 都具有普遍意義。而且，鑒于帕金森氏癥和癲癇等疾病都與神經元群體同步的節律性發放增強有關[32-33]，因此本文的發現對于促進 DBS 的臨床應用可能具有重要意義。
引言
深部腦刺激（deep brain stimulation，DBS）技術在臨床上已成功用于治療帕金森氏癥和癲癇等神經系統疾病，近年來，它對于難治性強迫癥和抑郁癥等精神疾病的治療效果也逐漸顯現[1-3]。臨床研究結果表明，DBS 的電脈沖頻率達到 90 Hz 以上時才能取得較好的療效，因此也被稱為高頻電刺激（high frequency stimulation，HFS）[4]。但是，HFS 用于疾病治療的生理機制還沒有完全明確，阻礙了 DBS 臨床應用的快速發展[5-6]。
目前，有關 HFS 機制的假說主要分為抑制作用、興奮作用和調制作用 3 種。作為神經外科損毀手術的替代方法，在早期，HFS 的作用被推測為抑制神經元的活動。持續的 HFS 可能激活抑制性神經回路[7]，或者可能導致興奮性突觸的神經遞質耗竭[8]，從而產生抑制作用。但是許多動物實驗和數學模型仿真等的研究結果都表明，HFS 具有興奮作用，可以提高某些神經元動作電位的發放率[9]。而近來的研究又表明，HFS 具有調制神經元活動的作用，包括對于各種神經元動作電位發放模式的調制、對于局部場電位的調制等[10-13]。這種調制作用可能誘導出新的神經元活動節律，取代病理性活動，從而獲得治療效果。
腦內神經元動作電位的發放與局部場電位（local field potentials，LFP）節律之間往往存在鎖相關系，從而形成神經元的節律性發放。這種節律性發放即有生理性的，在神經信息的編碼和解碼過程中具有重要作用[14]；也有病理性的，是許多腦疾病的特征表現。例如，海馬 CA1 區神經元的發放與 LFP 的 θ 節律之間存在明顯的鎖相關系，這種鎖相關系不僅與記憶的形成有關[15]，也與癲癇的形成有關[16]。此外，帕金森氏癥的特征之一也是神經元產生異常的節律性發放[17]。有研究表明，HFS 除了引起神經元動作電位發放率的變化之外，還可以抑制病理性的節律發放[10, 18-19]。由于神經元的發放節律與 LFP 節律相關；因此我們推測，HFS 可能通過改變兩者之間的鎖相關系來調節神經元的活動。
為了驗證此推測，本文在麻醉大鼠海馬 CA1 區的輸入軸突束薛氏側支（Schaffer collaterals，下文統稱為：Schaffer 側支）上施加 HFS，考察下游 CA1 區胞體層細胞外記錄的單細胞動作電位[即鋒電位（spike）]及其與 LFP 的 θ 節律之間的鎖相關系的變化情況，分析 HFS 對鋒電位節律性發放的影響。本文的研究結果或可為今后探究 DBS 的作用機制提供一些新的信息。
1 材料與方法
1.1 動物手術與電極植入
本實驗采用成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠共 8 只（260～400 g），購自中國浙江省醫學科學院實驗動物中心），腹腔注射烏拉坦（urethane），劑量為 1.25 g/kg。麻醉后，固定于腦立體定位儀上。切開大鼠鼻部皮膚，在鼻骨上固定兩顆不銹鋼螺釘，用作參考電極和接地電極。
切開大鼠頭部皮膚，除去部分顱骨后，植入記錄電極和刺激電極。記錄電極采用 16 通道雙列微電極陣列（Poly2，Neuro-Nexus Technologies 公司，美國）植入至海馬 CA1 區，定位是前鹵后 3.5 mm，旁開 2.7 mm，大腦皮層表面向下深度約 2.5 mm。刺激電極采用雙極同芯電極（CBCSG75，FHC 公司，美國），植入至海馬 CA1 區的輸入通路 Schaffer 側支，定位為前鹵后 2.2 mm，旁開 2.0 mm，大腦皮層表面向下深度約 2.8 mm[12]。
在 Schaffer 側支上施加單脈沖刺激可以在下游胞體層和頂樹突層分別誘發群峰電位（population spike，PS）和興奮性突觸后場電位，根據記錄電極陣列上記錄到的波形特征，選擇胞體層和頂樹突層的通道信號（兩層次間距約為 0.4 mm），用于分析鋒電位和 θ 節律[13]。
1.2 記錄與刺激
記錄電極采集到的信號通過 16 通道放大器（3600，A-M System 公司，美國）放大 100 倍，頻率范圍為 0.3～5 000 Hz。然后通過 PowerLab 多通道采集系統（ML880，ADInstruments 公司，澳大利亞）以 20 kHz 的頻率進行采樣（模/數轉換分辨率為 16 位），數據存入硬盤，用于離線分析。本文將此記錄信號稱為原始信號。
脈沖刺激由單通道隔離式刺激器（2100，A-M System 公司，美國）產生，是脈寬為 0.1 ms 的雙相電流型脈沖。脈沖強度為 0.3～0.5 mA，頻率為 100 Hz，HFS 時長為 1 min。
1.3 鋒電位的分析
取記錄電極上位于 CA1 區胞體層的 4 個相鄰通道的記錄信號[20]，用于分析神經元的鋒電位。首先，應用線性插值法去除 HFS 期間的刺激偽跡[13]。然后，利用 PowerLab 配套的數據分析軟件 Labchart 7.0（ADInstruments Inc.，澳大利亞）將去偽跡后的信號進行高通濾波，截止頻率為 500 Hz，去除原始信號中的低頻場電位，得到多單元鋒電位信號（multiple unit activity，MUA）。再利用閾值法檢測 MUA 中的鋒電位，閾值設為信號標準差的 3～5 倍[21]。最后，采用鋒電位波形的主成分和幅值作為特征參數，利用鋒電位分類軟件 SpikeSort3D（Neuralynx Inc.，美國）完成 4 通道鋒電位的分類。并且根據錐體神經元和中間神經元鋒電位的波形特征，確定鋒電位歸屬的神經元類型[20, 22]。本文下面將分類之前的多單元鋒電位簡稱為 MUA。
1.4 鋒電位發放與場電位節律之間關系的分析
為了研究海馬 CA1 區神經元鋒電位發放與 LFP 的 θ 節律之間的鎖相關系，選擇位于胞體層和頂樹突層的各一個通道的記錄信號，將兩通道信號進行帶通濾波（2～5 Hz），提取麻醉狀態下大鼠海馬 CA1 區的 θ 節律信號[14]。
然后，采用區間統計法分析鋒電位與 θ 節律之間的鎖相關系[23]：將每個 θ 節律的周期 T 對應至 0°～360° 圓周上（設 θ 節律的峰點為 0°），并計算各周期 T 內每個鋒電位發放時刻所對應的相位角 αi（1 ≤ i ≤ n，n 為鋒電位個數），采用圓分布統計法計算鋒電位相位角的均值和標準差[24]。
鋒電位與 θ 節律之間鎖相關系的強弱用鎖相值（phase-locking value）來評估，設為 r。r 的計算公式為[25]：
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r 取值為 0～1。r 值越接近于 1，表示鋒電位與 θ 節律之間的鎖相關系越強；反之，r 值越接近 0，則鎖相關系越弱。
利用瑞利檢驗（Rayleigh test）判斷鋒電位與 θ 節律之間是否鎖相。也就是，對于單峰分布，計算概率值：
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當 P < 0.01 時，認為相位角 αi 的分布不均勻，即神經元的鋒電位與 θ 節律之間存在明顯的鎖相關系。
實驗數據均以均值 ± 標準差表示，采用配對 t 檢驗來判斷 HFS 期間與 HFS 前基線記錄數據之間的差別是否具有統計學意義。
2 結果
2.1 神經元鋒電位發放與場電位 θ 節律之間的鎖相關系
如圖 1 左圖所示，海馬 CA1 區的胞體層和頂樹突層都存在 θ 節律，且頂樹突層 LFP 的 θ 節律較明顯。胞體層的 MUA 與兩層次上的 θ 節律之間都存在鎖相關系。由于胞體層和頂樹突層的 θ 節律之間存在約 150° 的相位差，如圖 1 右圖所示，因此圖中示例的中間神經元 MUA 的發放分別集中于胞體層 θ 節律的下降相和頂樹突層 θ 節律的上升相。對于胞體層的 θ 節律（若峰點設為 0°），鋒電位的相位平均角為 123° ± 70°（n = 939），鎖相值 r = 0.26；對于頂樹突層的 θ 節律（若峰點設為 0°），鋒電位的相位平均角為 274° ± 60°（n = 939），鎖相值 r = 0.35。為了清楚地顯示鋒電位與 θ 節律之間的相位關系，圖 1 右圖重復顯示了 2 個 θ 周期的數據。
圖1
海馬 CA1 區神經元鋒電位與 θ 節律之間的鎖相關系
Figure1.
Phase-locking relationship between the neuronal spikes and the θ rhythms in the hippocampal CA1 region
8 只大鼠的實驗數據統計結果顯示，錐體神經元在胞體層 θ 節律上的平均發放相位角為 197° ± 55°，鎖相值 r = 0.32 ± 0.14；在頂樹突層上的平均發放相位角為 341° ± 75°，鎖相值 r = 0.36 ± 0.12。中間神經元的鋒電位在胞體層 θ 節律上的平均發放相位角為 116° ± 58°，鎖相值 r = 0.24 ± 0.14，在頂樹突層上的平均發放相位角為 278° ± 49°，鎖相值 r = 0.27 ± 0.08。兩類神經元的鋒電位發放與 θ 節律之間都存在明顯的鎖相關系（P < 0.001）。
這些結果表明，在烏拉坦麻醉狀態下的基線記錄中，海馬 CA1 區胞體層和頂樹突層上均存在明顯的 θ 節律，且它們之間存在一定的相移。神經元鋒電位的發放與兩層次的 θ 節律均存在明顯的鎖相關系。接下來我們研究 HFS 是否會改變這種鎖相關系。
2.2 HFS 對于神經元鋒電位發放鎖相關系的影響
如圖 2 所示，在 Schaffer 側支上施加時長為 1 min 、頻率為 100 Hz 的 HFS（圖中用陰影表示），期間 MUA 增加，頂樹突層的 θ 節律明顯減弱，而胞體層的 θ 節律變化不明顯。在分析 HFS 期間鋒電位與 θ 節律之間的鎖相關系時，為了避免 HFS 起始處誘發的群峰電位的干擾[12, 20]，取 HFS 后期的 45 s 信號用于刺激期間的鋒電位分析。相應地，取 HFS 之前 45 s 基線信號作為對照。同時為了避開緊隨 HFS 結束后的鋒電位消失的靜息期[20]，取 HFS 結束 2 min 之后的 45 s 的信號來考察恢復狀態。
圖2
HFS 對于場電位 θ 節律和神經元鋒電位發放的影響
Figure2.
Effects of HFS on LFP θ rhythms and neuronal spikes
如圖 3 所示，HFS 前 MUA 的發放在 LFP 的 θ 周期中鎖相關系明顯。但是，在 HFS 期間，雖然神經元發放率增加，MUA 與 θ 節律之間的鎖相關系卻不再明顯。HFS 結束后又恢復鎖相關系。8 只大鼠的實驗數據統計結果顯示，HFS 期間錐體和中間兩類神經元的鋒電位與 θ 節律的鎖相值 r 顯著減小。如圖 4 所示，錐體神經元的鋒電位與胞體層 θ 節律之間的鎖相值 r = 0.06 ± 0.03，明顯小于 HFS 前的 r = 0.32 ± 0.14（P < 0.001）；與頂樹突層 θ 節律之間的鎖相值 r = 0.06 ± 0.04，也明顯小于 HFS 前的 r = 0.36 ± 0.12（P < 0.001）。類似地，對于中間神經元的鋒電位，HFS 期間它們與胞體層 θ 節律之間的鎖相值 r = 0.07 ± 0.04 小于 HFS 前的 r = 0.24 ± 0.14（P < 0.01）；與頂樹突層的 θ 節律之間的鎖相值 r = 0.09 ± 0.05 也小于 HFS 前的 r = 0.27 ± 0.08（P < 0.01）。HFS 結束 2 min 后，兩類神經元鋒電位與 θ 節律之間的鎖相關系都恢復，如 圖 4 所示。
由于胞體層的 θ 節律與頂樹突層的 θ 節律之間存在較為固定的相位差，如圖 1 所示，因此鋒電位與兩 θ 節律的鎖相值比較接近。
圖3
HFS 對 MUA、θ 節律以及兩者鎖相關系的影響
Figure3.
Effects of HFS on MUA，θ rhythms as well as the phase-locking relationship between them
圖4
HFS 改變兩種神經元鋒電位與 θ 節律之間的鎖相關系
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此結果表明，HFS 期間錐體神經元和中間神經元鋒電位的發放與 θ 節律之間的鎖相關系都有所減弱，神經元的 θ 節律發放消失。
3 討論
本文的研究結果表明，海馬 CA1 區輸入軸突束 Schaffer 側支上的 HFS 可以消除神經元動作電位發放與場電位 θ 節律之間的鎖相關系，改變下游神經元的節律性發放，其中的可能機制分析如下文所述。
首先，HFS 導致的 CA1 區 θ 節律的減弱可能是原因之一。HFS 期間場電位的 θ 節律（特別是頂樹突層的 θ 節律）被明顯抑制，如圖 2、圖 3 所示。這種抑制可能由 HFS 阻斷了上游與下游之間信息傳播引起的。有研究表明，海馬 CA1 區場電位的 θ 節律是多種機制作用的結果，包括來自上游 CA3 區神經元群體的節律性活動和來自嗅皮層的輸入，也包括錐體神經元頂樹突的電壓依賴性鈣離子流的作用等[14, 26-28]。而且，如圖 1 所示，基線記錄信號的頂樹突層 θ 節律的幅值明顯大于胞體層，表明上游 CA3 區對于頂樹突層的輸入可能有較大貢獻。本文 HFS 的作用位點（Schaffer 側支）就是 CA3 區錐體神經元至 CA1 區頂樹突的傳輸通路，而 HFS 可以導致軸突的傳導阻滯現象，阻止上游信息傳導至下游。這種傳導阻滯的可能原因是 HFS 產生軸突細胞膜外鉀離子濃度的升高。由于軸突束的膜外空間狹小，軸突興奮時外流的鉀離子積累起來，膜外過高的鉀離子濃度使得軸突產生去極化阻滯[29-30]。由此可見，Schaffer 側支上的 HFS 可能隔離了上游 CA3 區的 θ 節律振蕩，使得 CA1 區頂樹突層的 θ 節律明顯減弱[13]，進而減弱場電位節律對于神經元發放的調制作用，引起鋒電位節律性發放的消失。
其次，HFS 期間刺激脈沖的調制作用可能是神經元鋒電位發放模式改變的另一個原因。軸突上的 HFS 在阻斷上游與下游之間的信息傳導的同時，其中的脈沖仍然可以引起軸突產生某種興奮，并沿著軸突傳播至下游，引起下游 CA1 區神經元的發放增加，如圖 2 所示，并且改變下游神經元的發放模式[12, 20]。因此，如圖 3、圖 4 所示，當鋒電位的發放受到頻率為 100 Hz 的 HFS 的調制時，可以產生均勻分布的時間序列，消除低頻的 θ 節律發放。
綜上所述，軸突上的 HFS 對于下游神經元的調節可能由雙重作用引起。一方面，HFS 引起的軸突傳導阻滯切斷了上游原有節律性信息的傳播；另一方面，HFS 中包含的刺激脈沖對于下游神經元產生了新的調制作用。在這種雙重作用下，CA1 區神經元的 θ 節律發放消失。由于軸突相比神經元其他結構的興奮閾值要低，更容易被脈沖刺激激活[31]；因此，本文有關軸突 HFS 的研究結果可能對于不同刺激位點的 DBS 都具有普遍意義。而且，鑒于帕金森氏癥和癲癇等疾病都與神經元群體同步的節律性發放增強有關[32-33]，因此本文的發現對于促進 DBS 的臨床應用可能具有重要意義。
