以 α-氰基丙烯酸異丁酯（iBCA）為原料、泊洛沙姆 188 為乳化劑，以捏合法制得的姜黃素（Cur）/羥丙基-β-環糊精（HP-β-CD）包合物（Cur-HP-β-CD）為負載藥物，經一步乳化法制得姜黃素/聚（α-氰基丙烯酸異丁酯）載藥微球（Cur-HP-β-CD-PiBCA）。考察乳化劑、負載藥物的濃度對微球粒徑與分布、微球載藥率及包封率的影響，并對載藥微球的藥物釋放進行了研究。結果表明：隨著乳化劑濃度從 0.01% 增加到 0.07%，載藥微球粒徑下降，粒徑分布變寬，載藥率和包封率均增加，適宜的乳化劑濃度為 0.05%；隨著藥物濃度從 0.03% 增加到 0.07%，微球載藥率升高，包封率下降；載藥微球的載藥率越高，最終的藥物累積釋放百分率越低。姜黃素經包合和負載，不僅可以有效改善其親水性，而且可以提高其溶出度，為提高姜黃素的生物利用度奠定了基礎。
引用本文： 石淑先, 李慶釗, 陳曉農, 夏宇正. 姜黃素/聚(α-氰基丙烯酸異丁酯)載藥微球的制備及其藥物釋放. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(5): 749-753. doi: 10.7507/1001-5515.201701045 復制
引言
姜黃素（curcumin，Cur）為中藥姜黃的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗肝細胞毒性、抗風濕、抗低血壓、抑菌、降低膽固醇等藥理作用[1]，在酸性環境下穩定，但在中性、堿性和光照條件下不穩定[2]，且在水中溶解度極低，限制了其廣泛應用。通過將其制備成脂質體[3]、納米混懸劑[4]或利用聚合物進行負載[5-7]，雖可在一定程度上提高其生物利用度，但又存在脂質體儲存穩定性低[3]、納米混懸劑表面修飾難[4]、聚合物負載后有機溶劑殘留等問題[7]。利用親水性的 β-環糊精空腔對疏水性姜黃素進行包合，可使包合物的潤濕性增加，達到改善藥物溶出和提高生物利用度的目的[8]。聚（α-氰基丙烯酸酯）由于其良好的生物相容性、生物降解性以及較低的毒性，在藥物載體方面具有廣泛的應用前景[9-10]。若能先用 β-環糊精將姜黃素包合，再以聚（α-氰基丙烯酸酯）為載體材料進行負載，則可直接利用乳化法制備姜黃素的緩釋微球，在提高姜黃素生物利用度的同時，解決有機溶劑或未反應單體的殘留，該方法簡單、經濟，目前未見文獻報道。本研究先通過捏合法[8]制備了羥丙基-β-環糊精包合的姜黃素（curcumin-（2-hydroxypropyl）-β-cyclodextrin，Cur-HP-β-CD）以提高姜黃素的水溶性，然后進一步用乳化法制備了姜黃素/聚（α-氰基丙烯酸異丁酯）納米載藥微球（curcumin-（2-hydroxypropyl）-β-cyclodextrin poly（α-isobutyl cyanoacrylate），Cur-HP-β-CD-PiBCA），避免了使用大量有機溶劑，單體反應完全，整個過程綠色環保。
1 實驗部分
1.1 主要原料和試劑
Cur（純度 ≥ 95%），上海源葉生物科技有限公司；Cur 對照品（純度 ≥ 98%），中國藥品生物制品檢定所；HP-β-CD（純度 ≥ 97%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆 188，醫藥級，北京索萊寶科技有限公司；α-氰基丙烯酸異丁酯（α-isobutyl cyanoacrylate，iBCA），醫用級，秦皇島市科峰醫療器械有限公司。
1.2 Cur-HP-β-CD 包合物的制備
按照 HP-β-CD 與 Cur 物質的量之比為 1∶1，分別稱取一定量 HP-β-CD 與 Cur 加入到研缽中，加入少量的無水乙醇，然后在研磨的情況下間歇加入少量去離子水，在懸浮液狀態下研磨 1 h ，然后將漿體在 45℃ 真空干燥箱中干燥至恒重后，收集過 80 目篩，保存備用。
1.3 Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球的制備
在含有 50 mL 去離子水的三口瓶中加入一定量泊洛沙姆 188，室溫攪拌溶解。用 0.1 mol/L HCl 調節體系 pH 至 2.0 后，加入一定量的 Cur-HP-β-CD 包合物，攪拌 15 min 后緩慢逐滴加入一定量 iBCA，750 r/min 攪拌 3 h；然后用 0.1 mol/L NaOH 溶液調節體系 pH 至 6.5 ± 0.5，繼續攪拌 0.5 h 后結束反應。將反應得到的懸浮液用 1.0 μm 微孔濾膜過濾，濾液高速冷凍離心 1 h（4℃，15 000 r/min，下同）后用去離子水洗滌 3 次，真空冷凍干燥得 Cur-HP-β-CD-PiBCA 凍干微球。同理，不加 Cur-HP-β-CD 制備的微球為 PiBCA 空白微球。
1.4 Cur 檢測波長的測定
取一定量經 1.0 μm 微孔濾膜過濾后的空白微球懸浮液至離心管中，高速冷凍離心 1 h 后，取其上清液用生理鹽水/無水乙醇混合溶劑（6∶4，v/v，下同）稀釋 10 倍，然后以之為溶劑配置濃度為 10.0 μg/mL 的姜黃素溶液，利用紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司，UV-6100 S，下同），在波長 300～800 nm 之間對配置的姜黃素溶液進行掃描，確定 Cur 在該波長范圍內的最大吸收峰。
1.5 Cur 標準曲線的繪制
以生理鹽水/無水乙醇混合溶劑配制質量濃度分別為 0.3、0.5、1.0、1.5、2.5、5.0、10.0 μg/mL 的一系列 Cur 對照品溶液，用紫外可見分光光度計在 Cur 的最大吸收峰處的波長下測定吸光度 A，以吸光度 A 對 Cur 的質量濃度做回歸曲線，即得 Cur 標準曲線。
1.6 Cur-HP-β-CD 包合物溶解度測定
稱取 25 mg Cur-HP-β-CD 包合物于 25 mL 蒸餾水中，25℃ 振蕩 48 h 后形成 Cur-HP-β-CD 包合物過飽和溶液，經 1 μm 微孔濾膜過濾后，濾液用生理鹽水/無水乙醇混合溶劑稀釋 10 倍，然后用紫外可見分光光度計在 Cur 的紫外最大吸收波長處測定吸光度 A，代入 Cur 標準曲線回歸方程，以此計算 Cur 的溶解度，并根據包合物中兩種物質的量之比推算包合物的溶解度，為載藥微球制備中包合物的溶解提供數據支撐。
1.7 載藥微球包封率和載藥率的測定
取經過 1 μm 微孔濾膜過濾、濾液高速冷凍離心 1 h 后的空白微球懸浮液的上清液，并用生理鹽水/無水乙醇混合溶劑稀釋 10 倍后做參照液。同理，Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球的上清液用生理鹽水/無水乙醇混合溶劑稀釋 10 倍后，常溫超聲（40 kHz，200 W）5 min，將負載的 Cur 溶出；4 000 r/min 下離心 15 min，將超聲后的空白微球沉淀到底部；測定其上清液的吸光度 A。代入 Cur 標準曲線回歸方程，以此計算未被負載的 Cur 濃度，從而得到未被負載的 Cur 質量，從而計算包封率（entrapment efficiency，EE） = （m1–m2）/m1 × 100% 和載藥率（drug loading，DL） = （m1–m2）/m3 × 100%，其中 m1 是添加的 Cur 有效質量，m2 為載藥后未被負載的 Cur 質量，m3 為最終得到的微球總質量。
1.8 載藥微球的藥物釋放
Cur-HP-β-CD-PiBCA 微球的體外藥物釋放研究采用透析袋（8～14 kD）法[11]。將 5 mL Cur-HP-β-CD-PiBCA 懸浮液置于透析袋中，50 mL 生理鹽水/無水乙醇混合溶劑作為介質加入到燒杯中，37℃ 下 150 r/min 磁力攪拌下進行透析。每隔一定時間取 3 mL 溶解介質用紫外可見分光光度計測試吸光度 A，同時往燒杯中添加 3 mL 生理鹽水/無水乙醇混合溶劑。以生理鹽水/無水乙醇混合溶劑為空白參照，根據 Cur 標準曲線回歸方程，計算溶出的 Cur 濃度，并計算 Cur 在不同時間的累積釋放百分率（cumulative release percentage，記為 Q）。
1.9 微球粒徑及其分布測定
將空白 PiBCA 微球或 Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球經過 1 μm 微孔濾膜過濾后的懸浮液用去離子水稀釋 5 倍后，用激光散射粒度分析儀（Zeta PALS/BIC 90 PALS，美國布魯克海文儀器公司）測試微球粒徑（diameter，d）及粒徑分布（particle size distribution index，PDI）。
2 結果與討論
2.1 Cur 的標準曲線
繪制 Cur 的標準曲線之前，先需知其在生理鹽水/無水乙醇混合溶劑（6∶4，v/v）中的最大紫外吸收波長。圖 1 是在 300～800 nm 波長之間對配置的 Cur 溶液進行掃描的結果。從圖 1 可知，僅在 426 nm 處出現最大吸收峰，且生理鹽水和無水乙醇在此位置無吸收，表明 Cur 在生理鹽水/無水乙醇混合溶劑中的最大吸收峰的波長為 426 nm，因此后續實驗將選擇在 426 nm 處檢測溶液中的 Cur。
圖1
Cur 的紫外掃描圖譜
Figure1.
Ultraviolet scanning spectrum of Cur
在確定了 Cur 的最大紫外吸收波長后，通過配制一系列濃度梯度的 Cur 的生理鹽水/無水乙醇混合溶液，在 426 nm 處測定其吸光度 A，以溶液的吸光度對 Cur 溶液的質量濃度做回歸，得到標準曲線回歸方程為 A = 0.167 7 C + 0.013 8（見圖 2），其相關系數 R2 = 0.999 7，其中 C 為質量濃度。
圖2
Cur 吸光度與濃度標準曲線
Figure2.
Standard curve of Cur absorbance and concentration
此外，通過標準曲線，計算出了 Cur-HP-β-CD 包合物過飽和溶液中溶解的 Cur 含量為 134.6 μg/mL。由于 Cur 和 HP-β-CD 包合物的物質的量之比為 1∶1[8]，進一步推算出 Cur-HP-β-CD 包合物的溶解度為 697.6 μg/mL。
2.2 乳化劑的影響
由于 Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球是以泊洛沙姆 188 為乳化劑經乳化法制得[12]，因此乳化劑的用量將對微球的粒徑及粒徑分布和 DL、EE 有極大的影響。圖 3 是在 Cur-HP-β-CD 藥物濃度為 0.07%（w/v）的條件下，考察了泊洛沙姆 188 濃度對載藥微球粒徑/粒徑分布、DL 和 EE 的影響。
圖3
泊洛沙姆 188 濃度對微球粒徑及其粒徑分布、DL 和 EE 的影響
Figure3.
Effect of poloxamer 188 concentration on size and its distribution, drug loading and encapsulation efficiency of microspheres
從圖 3 左圖可以看出，隨著泊洛沙姆 188 濃度從 0.01% 增加到 0.07%，Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球粒徑隨之下降（從 194.9 nm 下降到 109.7 nm），微球粒徑分布隨之變大（從 0.05 增加到 0.30）；但是當泊洛沙姆 188 濃度超過 0.05% 后，載藥微球粒徑變化不大，但微球粒徑分布急劇變寬。實驗過程中還發現，泊洛沙姆 188 濃度較小（< 0.04%）時，體系存在微球沉淀現象；而泊洛沙姆 188 濃度較高（> 0.06%）時，體系起泡現象比較嚴重，增加了后續分離和洗滌的難度。出現上述實驗結果的原因可能是：泊洛沙姆 188 的臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）[13]為 1.25 × 10–3 mol/L，即相對含量為 1.14%。本研究中所用的泊洛沙姆 188 的用量最大為 0.07%，此時尚未達到其 CMC，在體系中形成新膠束或新乳膠粒的概率較低，因此理論上在 CMC 以下微球粒徑分布較窄。但是 iBCA 乳化成粒過程不同于傳統的乳液聚合成粒過程，因為 iBCA 聚合后聚合物的鏈末端為羥基，其本身具有自乳化成粒傾向，且生成的粒狀聚合物的親水性比單體本身大，故水中的泊洛沙姆 188 以及原來吸附在單體 iBCA 液滴上的泊洛沙姆 188 將重新分配，即單體液滴上的乳化劑泊洛沙姆 188 會向水中遷移，加之單體引發聚合后可形成新的乳膠粒，因此整個體系乳化劑一直處于動態分布過程，最終導致生成的微球粒徑變小，但粒徑分布變寬。隨著泊洛沙姆 188 用量增加，起泡現象嚴重，也是由于形成的聚合物粒子親水性增加，導致對乳化劑吸附力下降，進而乳化劑泊洛沙姆 188 向水相擴散，在水相的濃度增加，導致起泡現象加重。
從圖 3 右圖中可知，泊洛沙姆 188 濃度從 0.01% 增加到 0.03%（w/v），微球的 DL 和 EE 急劇增加，微球 DL 從 7.69% 增加到 9.88%，EE 從 45.5% 增加到 58.5%；但是當泊洛沙姆 188 濃度從 0.03% 增加到 0.07%（w/v），微球的 DL 和 EE 變化不大，趨于平衡。這可能是在較低的乳化劑濃度下，微球的表面不能被乳化劑分子完全覆蓋，iBCA 接觸到水相的 HO–隨即發生快速陰離子聚合，造成微球表面呈現多孔結構，負載的藥物也比較容易從微球表面擴散出來到介質中，從而導致 EE 和 DL 較低；隨著乳化劑濃度的增加，微球表面被乳化劑分子覆蓋，易形成較致密的結構[14]，負載的藥物損失量較小，DL 和 EE 增加。但是進一步增加乳化劑的用量，微球 DL 和 EE 卻并未持續增加，而是保持在一個相對恒定的水平。這可能是因為隨著乳化劑濃度增加，微球表面變得光滑，因此在合成的時候藥物的損失量逐漸減小；與此同時，隨著乳化劑濃度增加，粒徑減小，從而導致總顆粒表面積的增加，藥物損失總量增加。這兩種對立的因素相互抵消，微球 DL 與 EE 則相應地趨于穩定。
綜合微球粒徑及其分布、微球 DL 和 EE 的變化規律，本研究中泊洛沙姆 188 的濃度選擇以 0.05% 較為適宜。
2.3 藥物濃度的影響
在泊洛沙姆 188 濃度為 0.05%（w/v）的條件下，制備了 Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球，考察了 Cur-HP-β-CD 藥物的濃度對 Cur-HP-β-CD-PiBCA 微球的 DL 與 EE 的影響，結果如圖 4 所示。
圖4
Cur-HP-β-CD 藥物濃度對微球 DL 與 EE 的影響
Figure4.
Effect of Cur-HP-β-CD concentration on drug loading and encapsulation efficiency of microspheres
從圖 4 可知，當 Cur-HP-β-CD 藥物濃度從 0.03% 增加到 0.07% 時，微球 DL 逐漸升高（從 5.50% 上升至 9.96%），而 EE 下降（從 76.1% 下降至 59.4%）。出現這種現象的原因，可能與藥物負載方式有關，藥物除了在微球表面的吸附之外，還有一部分藥物隨著 iBCA 聚合的進行被包裹進微球內部。增加藥物濃度，微球內部包裹的藥物雖然有所增加，但是由于微球上藥物的吸附逐漸趨于飽和，藥物的吸附和脫附最終達到平衡狀態[15]。藥物濃度越大，負載到微球上的藥物量越多，但是相應地未負載的藥物也越多，并且占投入藥物的比例增大，故出現了這種現象。
2.4 載藥微球的體外釋放
本文以生理鹽水/無水乙醇混合溶劑作為空白參照液，用紫外可見分光光度計對 Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球的體外藥物釋放進行了研究。圖 5 是載藥率分別為 5.50%、7.84%、9.96% 的 3 種 Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球，在 37℃ 下的生理鹽水/無水乙醇混合溶劑中的體外釋放曲線。
圖5
載藥微球的體外釋放曲線
Figure5.
In vitro cumulative drug release of microspheres
從圖 5 中可以看出，3 種不同 DL 微球的藥物釋放曲線相似，都是在前 20 h 的藥物釋放較快，DL 分別為 5.50%、7.84%、9.96% 的 3 種 Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球的藥物累積釋放百分率 Q 值，在 20 h 時分別達到 91.1%、83.5%、76.3%，在 20 h 后藥物釋放減緩；DL 為 5.50% 的微球在 32 h 后趨于平衡，DL 為 7.84% 和 9.96% 的微球在 48 h 后趨于平衡；在整個藥物釋放周期內，上述載藥微球最高累積釋放百分率分別維持在 92.9%、89.9%、86.0%，即 DL 越高的微球，累積釋放百分率越低。這是由于微球負載的藥物，不僅有一部分包裹在微球內部，還有一部分吸附在微球表面。快速釋放階段，大部分是吸附在微球表面的藥物進行釋放以及包裹在微球表層的藥物通過多孔通道進行釋放；緩慢釋放階段主要是粒子內部的藥物逐漸釋放出來。另外由于部分藥物深埋在微球內部，往往需要在載體材料降解后進行釋放，而載體材料的降解需要一定的時間[14]。
3 結論
本文以 iBCA 為原料，泊洛沙姆 188 為乳化劑，HP-β-CD 與 Cur 經捏合法制備的 Cur-HP-β-CD 包合物為負載藥物，通過一步乳化法成功制備了 Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球，不僅有效改善了 Cur 的親水性，而且提高了其溶出度，為提高其生物利用度奠定了基礎。研究發現：
（1）乳化劑用量增加，載藥微球粒徑下降，粒徑分布變寬，DL 和 EE 均增加。
（2）藥物濃度增加，微球 DL 升高，EE 下降。
（3）載藥微球 DL 越高，累積釋放百分率越低，前 20 h 的藥物釋放較快，從而為姜黃素等脂溶性的藥物的負載與釋放提供了技術基礎。
引言
姜黃素（curcumin，Cur）為中藥姜黃的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗肝細胞毒性、抗風濕、抗低血壓、抑菌、降低膽固醇等藥理作用[1]，在酸性環境下穩定，但在中性、堿性和光照條件下不穩定[2]，且在水中溶解度極低，限制了其廣泛應用。通過將其制備成脂質體[3]、納米混懸劑[4]或利用聚合物進行負載[5-7]，雖可在一定程度上提高其生物利用度，但又存在脂質體儲存穩定性低[3]、納米混懸劑表面修飾難[4]、聚合物負載后有機溶劑殘留等問題[7]。利用親水性的 β-環糊精空腔對疏水性姜黃素進行包合，可使包合物的潤濕性增加，達到改善藥物溶出和提高生物利用度的目的[8]。聚（α-氰基丙烯酸酯）由于其良好的生物相容性、生物降解性以及較低的毒性，在藥物載體方面具有廣泛的應用前景[9-10]。若能先用 β-環糊精將姜黃素包合，再以聚（α-氰基丙烯酸酯）為載體材料進行負載，則可直接利用乳化法制備姜黃素的緩釋微球，在提高姜黃素生物利用度的同時，解決有機溶劑或未反應單體的殘留，該方法簡單、經濟，目前未見文獻報道。本研究先通過捏合法[8]制備了羥丙基-β-環糊精包合的姜黃素（curcumin-（2-hydroxypropyl）-β-cyclodextrin，Cur-HP-β-CD）以提高姜黃素的水溶性，然后進一步用乳化法制備了姜黃素/聚（α-氰基丙烯酸異丁酯）納米載藥微球（curcumin-（2-hydroxypropyl）-β-cyclodextrin poly（α-isobutyl cyanoacrylate），Cur-HP-β-CD-PiBCA），避免了使用大量有機溶劑，單體反應完全，整個過程綠色環保。
1 實驗部分
1.1 主要原料和試劑
Cur（純度 ≥ 95%），上海源葉生物科技有限公司；Cur 對照品（純度 ≥ 98%），中國藥品生物制品檢定所；HP-β-CD（純度 ≥ 97%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆 188，醫藥級，北京索萊寶科技有限公司；α-氰基丙烯酸異丁酯（α-isobutyl cyanoacrylate，iBCA），醫用級，秦皇島市科峰醫療器械有限公司。
1.2 Cur-HP-β-CD 包合物的制備
按照 HP-β-CD 與 Cur 物質的量之比為 1∶1，分別稱取一定量 HP-β-CD 與 Cur 加入到研缽中，加入少量的無水乙醇，然后在研磨的情況下間歇加入少量去離子水，在懸浮液狀態下研磨 1 h ，然后將漿體在 45℃ 真空干燥箱中干燥至恒重后，收集過 80 目篩，保存備用。
1.3 Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球的制備
在含有 50 mL 去離子水的三口瓶中加入一定量泊洛沙姆 188，室溫攪拌溶解。用 0.1 mol/L HCl 調節體系 pH 至 2.0 后，加入一定量的 Cur-HP-β-CD 包合物，攪拌 15 min 后緩慢逐滴加入一定量 iBCA，750 r/min 攪拌 3 h；然后用 0.1 mol/L NaOH 溶液調節體系 pH 至 6.5 ± 0.5，繼續攪拌 0.5 h 后結束反應。將反應得到的懸浮液用 1.0 μm 微孔濾膜過濾，濾液高速冷凍離心 1 h（4℃，15 000 r/min，下同）后用去離子水洗滌 3 次，真空冷凍干燥得 Cur-HP-β-CD-PiBCA 凍干微球。同理，不加 Cur-HP-β-CD 制備的微球為 PiBCA 空白微球。
1.4 Cur 檢測波長的測定
取一定量經 1.0 μm 微孔濾膜過濾后的空白微球懸浮液至離心管中，高速冷凍離心 1 h 后，取其上清液用生理鹽水/無水乙醇混合溶劑（6∶4，v/v，下同）稀釋 10 倍，然后以之為溶劑配置濃度為 10.0 μg/mL 的姜黃素溶液，利用紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司，UV-6100 S，下同），在波長 300～800 nm 之間對配置的姜黃素溶液進行掃描，確定 Cur 在該波長范圍內的最大吸收峰。
1.5 Cur 標準曲線的繪制
以生理鹽水/無水乙醇混合溶劑配制質量濃度分別為 0.3、0.5、1.0、1.5、2.5、5.0、10.0 μg/mL 的一系列 Cur 對照品溶液，用紫外可見分光光度計在 Cur 的最大吸收峰處的波長下測定吸光度 A，以吸光度 A 對 Cur 的質量濃度做回歸曲線，即得 Cur 標準曲線。
1.6 Cur-HP-β-CD 包合物溶解度測定
稱取 25 mg Cur-HP-β-CD 包合物于 25 mL 蒸餾水中，25℃ 振蕩 48 h 后形成 Cur-HP-β-CD 包合物過飽和溶液，經 1 μm 微孔濾膜過濾后，濾液用生理鹽水/無水乙醇混合溶劑稀釋 10 倍，然后用紫外可見分光光度計在 Cur 的紫外最大吸收波長處測定吸光度 A，代入 Cur 標準曲線回歸方程，以此計算 Cur 的溶解度，并根據包合物中兩種物質的量之比推算包合物的溶解度，為載藥微球制備中包合物的溶解提供數據支撐。
1.7 載藥微球包封率和載藥率的測定
取經過 1 μm 微孔濾膜過濾、濾液高速冷凍離心 1 h 后的空白微球懸浮液的上清液，并用生理鹽水/無水乙醇混合溶劑稀釋 10 倍后做參照液。同理，Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球的上清液用生理鹽水/無水乙醇混合溶劑稀釋 10 倍后，常溫超聲（40 kHz，200 W）5 min，將負載的 Cur 溶出；4 000 r/min 下離心 15 min，將超聲后的空白微球沉淀到底部；測定其上清液的吸光度 A。代入 Cur 標準曲線回歸方程，以此計算未被負載的 Cur 濃度，從而得到未被負載的 Cur 質量，從而計算包封率（entrapment efficiency，EE） = （m1–m2）/m1 × 100% 和載藥率（drug loading，DL） = （m1–m2）/m3 × 100%，其中 m1 是添加的 Cur 有效質量，m2 為載藥后未被負載的 Cur 質量，m3 為最終得到的微球總質量。
1.8 載藥微球的藥物釋放
Cur-HP-β-CD-PiBCA 微球的體外藥物釋放研究采用透析袋（8～14 kD）法[11]。將 5 mL Cur-HP-β-CD-PiBCA 懸浮液置于透析袋中，50 mL 生理鹽水/無水乙醇混合溶劑作為介質加入到燒杯中，37℃ 下 150 r/min 磁力攪拌下進行透析。每隔一定時間取 3 mL 溶解介質用紫外可見分光光度計測試吸光度 A，同時往燒杯中添加 3 mL 生理鹽水/無水乙醇混合溶劑。以生理鹽水/無水乙醇混合溶劑為空白參照，根據 Cur 標準曲線回歸方程，計算溶出的 Cur 濃度，并計算 Cur 在不同時間的累積釋放百分率（cumulative release percentage，記為 Q）。
1.9 微球粒徑及其分布測定
將空白 PiBCA 微球或 Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球經過 1 μm 微孔濾膜過濾后的懸浮液用去離子水稀釋 5 倍后，用激光散射粒度分析儀（Zeta PALS/BIC 90 PALS，美國布魯克海文儀器公司）測試微球粒徑（diameter，d）及粒徑分布（particle size distribution index，PDI）。
2 結果與討論
2.1 Cur 的標準曲線
繪制 Cur 的標準曲線之前，先需知其在生理鹽水/無水乙醇混合溶劑（6∶4，v/v）中的最大紫外吸收波長。圖 1 是在 300～800 nm 波長之間對配置的 Cur 溶液進行掃描的結果。從圖 1 可知，僅在 426 nm 處出現最大吸收峰，且生理鹽水和無水乙醇在此位置無吸收，表明 Cur 在生理鹽水/無水乙醇混合溶劑中的最大吸收峰的波長為 426 nm，因此后續實驗將選擇在 426 nm 處檢測溶液中的 Cur。
圖1
Cur 的紫外掃描圖譜
Figure1.
Ultraviolet scanning spectrum of Cur
在確定了 Cur 的最大紫外吸收波長后，通過配制一系列濃度梯度的 Cur 的生理鹽水/無水乙醇混合溶液，在 426 nm 處測定其吸光度 A，以溶液的吸光度對 Cur 溶液的質量濃度做回歸，得到標準曲線回歸方程為 A = 0.167 7 C + 0.013 8（見圖 2），其相關系數 R2 = 0.999 7，其中 C 為質量濃度。
圖2
Cur 吸光度與濃度標準曲線
Figure2.
Standard curve of Cur absorbance and concentration
此外，通過標準曲線，計算出了 Cur-HP-β-CD 包合物過飽和溶液中溶解的 Cur 含量為 134.6 μg/mL。由于 Cur 和 HP-β-CD 包合物的物質的量之比為 1∶1[8]，進一步推算出 Cur-HP-β-CD 包合物的溶解度為 697.6 μg/mL。
2.2 乳化劑的影響
由于 Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球是以泊洛沙姆 188 為乳化劑經乳化法制得[12]，因此乳化劑的用量將對微球的粒徑及粒徑分布和 DL、EE 有極大的影響。圖 3 是在 Cur-HP-β-CD 藥物濃度為 0.07%（w/v）的條件下，考察了泊洛沙姆 188 濃度對載藥微球粒徑/粒徑分布、DL 和 EE 的影響。
圖3
泊洛沙姆 188 濃度對微球粒徑及其粒徑分布、DL 和 EE 的影響
Figure3.
Effect of poloxamer 188 concentration on size and its distribution, drug loading and encapsulation efficiency of microspheres
從圖 3 左圖可以看出，隨著泊洛沙姆 188 濃度從 0.01% 增加到 0.07%，Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球粒徑隨之下降（從 194.9 nm 下降到 109.7 nm），微球粒徑分布隨之變大（從 0.05 增加到 0.30）；但是當泊洛沙姆 188 濃度超過 0.05% 后，載藥微球粒徑變化不大，但微球粒徑分布急劇變寬。實驗過程中還發現，泊洛沙姆 188 濃度較小（< 0.04%）時，體系存在微球沉淀現象；而泊洛沙姆 188 濃度較高（> 0.06%）時，體系起泡現象比較嚴重，增加了后續分離和洗滌的難度。出現上述實驗結果的原因可能是：泊洛沙姆 188 的臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）[13]為 1.25 × 10–3 mol/L，即相對含量為 1.14%。本研究中所用的泊洛沙姆 188 的用量最大為 0.07%，此時尚未達到其 CMC，在體系中形成新膠束或新乳膠粒的概率較低，因此理論上在 CMC 以下微球粒徑分布較窄。但是 iBCA 乳化成粒過程不同于傳統的乳液聚合成粒過程，因為 iBCA 聚合后聚合物的鏈末端為羥基，其本身具有自乳化成粒傾向，且生成的粒狀聚合物的親水性比單體本身大，故水中的泊洛沙姆 188 以及原來吸附在單體 iBCA 液滴上的泊洛沙姆 188 將重新分配，即單體液滴上的乳化劑泊洛沙姆 188 會向水中遷移，加之單體引發聚合后可形成新的乳膠粒，因此整個體系乳化劑一直處于動態分布過程，最終導致生成的微球粒徑變小，但粒徑分布變寬。隨著泊洛沙姆 188 用量增加，起泡現象嚴重，也是由于形成的聚合物粒子親水性增加，導致對乳化劑吸附力下降，進而乳化劑泊洛沙姆 188 向水相擴散，在水相的濃度增加，導致起泡現象加重。
從圖 3 右圖中可知，泊洛沙姆 188 濃度從 0.01% 增加到 0.03%（w/v），微球的 DL 和 EE 急劇增加，微球 DL 從 7.69% 增加到 9.88%，EE 從 45.5% 增加到 58.5%；但是當泊洛沙姆 188 濃度從 0.03% 增加到 0.07%（w/v），微球的 DL 和 EE 變化不大，趨于平衡。這可能是在較低的乳化劑濃度下，微球的表面不能被乳化劑分子完全覆蓋，iBCA 接觸到水相的 HO–隨即發生快速陰離子聚合，造成微球表面呈現多孔結構，負載的藥物也比較容易從微球表面擴散出來到介質中，從而導致 EE 和 DL 較低；隨著乳化劑濃度的增加，微球表面被乳化劑分子覆蓋，易形成較致密的結構[14]，負載的藥物損失量較小，DL 和 EE 增加。但是進一步增加乳化劑的用量，微球 DL 和 EE 卻并未持續增加，而是保持在一個相對恒定的水平。這可能是因為隨著乳化劑濃度增加，微球表面變得光滑，因此在合成的時候藥物的損失量逐漸減小；與此同時，隨著乳化劑濃度增加，粒徑減小，從而導致總顆粒表面積的增加，藥物損失總量增加。這兩種對立的因素相互抵消，微球 DL 與 EE 則相應地趨于穩定。
綜合微球粒徑及其分布、微球 DL 和 EE 的變化規律，本研究中泊洛沙姆 188 的濃度選擇以 0.05% 較為適宜。
2.3 藥物濃度的影響
在泊洛沙姆 188 濃度為 0.05%（w/v）的條件下，制備了 Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球，考察了 Cur-HP-β-CD 藥物的濃度對 Cur-HP-β-CD-PiBCA 微球的 DL 與 EE 的影響，結果如圖 4 所示。
圖4
Cur-HP-β-CD 藥物濃度對微球 DL 與 EE 的影響
Figure4.
Effect of Cur-HP-β-CD concentration on drug loading and encapsulation efficiency of microspheres
從圖 4 可知，當 Cur-HP-β-CD 藥物濃度從 0.03% 增加到 0.07% 時，微球 DL 逐漸升高（從 5.50% 上升至 9.96%），而 EE 下降（從 76.1% 下降至 59.4%）。出現這種現象的原因，可能與藥物負載方式有關，藥物除了在微球表面的吸附之外，還有一部分藥物隨著 iBCA 聚合的進行被包裹進微球內部。增加藥物濃度，微球內部包裹的藥物雖然有所增加，但是由于微球上藥物的吸附逐漸趨于飽和，藥物的吸附和脫附最終達到平衡狀態[15]。藥物濃度越大，負載到微球上的藥物量越多，但是相應地未負載的藥物也越多，并且占投入藥物的比例增大，故出現了這種現象。
2.4 載藥微球的體外釋放
本文以生理鹽水/無水乙醇混合溶劑作為空白參照液，用紫外可見分光光度計對 Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球的體外藥物釋放進行了研究。圖 5 是載藥率分別為 5.50%、7.84%、9.96% 的 3 種 Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球，在 37℃ 下的生理鹽水/無水乙醇混合溶劑中的體外釋放曲線。
圖5
載藥微球的體外釋放曲線
Figure5.
In vitro cumulative drug release of microspheres
從圖 5 中可以看出，3 種不同 DL 微球的藥物釋放曲線相似，都是在前 20 h 的藥物釋放較快，DL 分別為 5.50%、7.84%、9.96% 的 3 種 Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球的藥物累積釋放百分率 Q 值，在 20 h 時分別達到 91.1%、83.5%、76.3%，在 20 h 后藥物釋放減緩；DL 為 5.50% 的微球在 32 h 后趨于平衡，DL 為 7.84% 和 9.96% 的微球在 48 h 后趨于平衡；在整個藥物釋放周期內，上述載藥微球最高累積釋放百分率分別維持在 92.9%、89.9%、86.0%，即 DL 越高的微球，累積釋放百分率越低。這是由于微球負載的藥物，不僅有一部分包裹在微球內部，還有一部分吸附在微球表面。快速釋放階段，大部分是吸附在微球表面的藥物進行釋放以及包裹在微球表層的藥物通過多孔通道進行釋放；緩慢釋放階段主要是粒子內部的藥物逐漸釋放出來。另外由于部分藥物深埋在微球內部，往往需要在載體材料降解后進行釋放，而載體材料的降解需要一定的時間[14]。
3 結論
本文以 iBCA 為原料，泊洛沙姆 188 為乳化劑，HP-β-CD 與 Cur 經捏合法制備的 Cur-HP-β-CD 包合物為負載藥物，通過一步乳化法成功制備了 Cur-HP-β-CD-PiBCA 載藥微球，不僅有效改善了 Cur 的親水性，而且提高了其溶出度，為提高其生物利用度奠定了基礎。研究發現：
（1）乳化劑用量增加，載藥微球粒徑下降，粒徑分布變寬，DL 和 EE 均增加。
（2）藥物濃度增加，微球 DL 升高，EE 下降。
（3）載藥微球 DL 越高，累積釋放百分率越低，前 20 h 的藥物釋放較快，從而為姜黃素等脂溶性的藥物的負載與釋放提供了技術基礎。
