光聲顯微成像兼具高光學組織對比度，以及超聲的高穿透深度和高空間分辨率的優點。但一方面在光聲顯微成像中，組織深層目標易被淺表目標屏蔽，另一方面其橫向分辨率與焦深的矛盾一直限制了光聲顯微的成像質量。針對這兩個問題，本實驗搭建了一套基于超聲分辨的光聲顯微成像系統。其采用一種非共軸的照明-探測方式來減少淺層組織對深層信息的影響，并且采用一種新的焦區積分算法來進行數據的處理，結合多次縱向變焦掃描來實現深層組織的高分辨探測。仿體實驗表明，該方法可以在不同縱向深度上保持約 0.6 mm 的橫向分辨率，與理論值相接近。裸鼠腫瘤成像結果表明，本文所提出的方法可以比普通的背向探測聲聚焦光聲顯微成像方法在深度方向上獲取更多的信息。隨著超快脈沖激光和高速掃描方式的發展，本文所提出的方法有望在腦部血管成像、宮頸癌內窺成像、淺表腫瘤成像等方面得到較好的應用。
引用本文： 羅曉飛, 彭寬, 王波, 王天爽, 肖嘉瑩. 基于焦區積分的高分辨率光聲變焦顯微成像. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(1): 115-122. doi: 10.7507/1001-5515.201609072 復制
引言
光聲成像是一種新型的無損生物成像技術。這種成像模態使用超短脈沖激光照射生物組織，通過探測光聲效應所產生的光聲信號來檢測樣品中的光吸收參數變化，兼具光學成像的高靈敏度以及超聲成像的高穿透深度和高空間分辨率的優點[1-10]。光聲顯微成像（photoacoustic microscopy，PAM）作為光聲成像的重要分支，通常通過檢測某個激光光路上所產生的超聲時域信號來直接分析該路徑上光吸收量的分布情況，而不需要使用逆向重建算法。按照空間分辨率的提供方式，光聲顯微系統一般分為兩種類型，一種是光聚焦 PAM，通過激光聚焦獲得高空間分辨率，但由于生物組織對光的強散射作用，其成像只限于淺表層，平均深度不超過光子平均自由程[11-12]。另一種是聲聚焦 PAM，通過超聲聚焦獲得空間分辨率，由于超聲在生物組織中的散射效應遠小于光，這種方法即使在組織內光子自由程范圍外仍然能夠獲得高分辨率的圖像，并且已經成功地應用在腫瘤、深層血管等活體組織成像中[13-18]。
然而，在常見的聲聚焦 PAM 中，通常采用一個與激光光路同軸的聚焦超聲探頭來獲取整個激光光路上所產生的超聲時間序列。這種成像方式會導致在同一激光光路上深層目標的光聲信號可能被淹沒在淺層目標光聲信號的拖尾中，從而降低系統對深層目標檢測的靈敏度[19]。此外，由于超聲探頭的焦點被固定在某個深度上，系統的橫向空間分辨率會隨著遠離聚焦區域而顯著降低[20]。汪力宏課題組[12]在 2005 年提出了一種暗場共聚焦 PAM 系統，這一系統采用一個錐形鏡暗場照明系統，有效降低了超聲探頭正下方表面組織的光照強度，從而極大地減小了表面組織對深層目標信號的影響，并使用高數值孔徑的聚焦探頭來提高系統的橫向分辨率。2012 年，劉炎炎等[21]在汪力宏組類似的暗場光聲顯微系統的基礎上，進一步提出了一種基于稀疏掃描輪廓的滑動焦點 PAM 方法，通過在平面掃描過程中不斷調節探頭的聚焦深度，使得感興趣的目標樣品始終處于焦深的范圍，從而獲得分辨率和信噪比均勻的光聲顯微圖像。但劉炎炎等的實驗只是對二維平面掃描的優化，并沒給出完整的三維圖像。
本文搭建了一套聲聚焦 PAM 系統，采用一種非共軸的照明-探測方法來減少淺層組織對深層信息的影響。這種方法中，超聲檢測波束和激光光路相互垂直且聚焦超聲探頭的焦點始終位于兩者的交匯點上，并將所獲取的光聲信號作為該位置上的光聲成像結果，移動該交匯點遍歷成像區域，從而獲得完整圖像。此外，由于聚焦超聲探頭的焦點始終處于當前的成像深度，這種方法也能夠在不同的成像深度上保持基本一致的空間分辨率。
1 系統與方法
1.1 成像系統
實驗系統設置如圖 1 上圖所示。激光器（Q-switched Nd：YAG，北京鐳寶光電技術有限公司）所產生的 532 nm 脈沖激光被凸透鏡聚焦之后耦合進一根芯徑為 0.8 mm 的多模光纖中，光纖另一端的出射光被另一個凸透鏡進行整形之后與水平面呈 45° 角入射到水槽中的樣品中。一個中心頻率為 10 MHz 的聚焦超聲探頭（A312S-N-SU，日本 Olympus Co，焦距約為 15 mm，橫向分辨率和縱向分辨率分別為 0.4 mm 和 0.2 mm）被用于采集光聲信號，這個超聲探頭同樣與水平面呈 45° 角安裝固定，且超聲探頭的焦點被放置在超聲檢測波束和激光光路的交點上。光纖的出射端、出射光整形透鏡和聚焦超聲探頭一起被安裝在一個 TSA 電控位移臺（TSA150-b，北京卓立漢光儀器有限公司）上以實現水平和縱向移動且步進均為 0.1 mm。超聲探頭所接收到的光聲信號在經過超聲脈沖發射接收器（5072PR，日本 Olympus Co）的濾波和放大之后被計算機中的數據采集卡（Spectrum M4i 2223-x8，北京坤馳科技有限公司，雙通道，最大采樣速率 2.5 GS/s，最大帶寬 1 GHz）記錄和保存。整個系統的觸發信號由脈沖激光器提供，數據的采樣頻率為 100 MHz。在成像時，聚焦超聲探頭和光纖出射端同步進行垂直和水平移動。對于某個移動位置而言，當前聚焦超聲探頭的焦點位置為其成像位置，在該位置上只測量該成像位置上的光聲信號。在完成全部水平和垂直移動之后可以最終獲得一幅樣品的 B 掃描圖像。平移臺的移動由計算機中的 Labview 程序通過電機控制器（SC300，北京卓立漢光儀器有限公司）進行管理。本文實驗在精密光學平臺（OTPOT18-12，北京卓立漢光儀器有限公司）完成。
這一系統中，由于激光光路和聚焦超聲探頭的檢測波束相互垂直，且超聲探頭焦點始終位于超聲探頭檢測波束和激光光路的交匯位置上，因此激光光路上來自淺表層的光聲信號將被超聲探頭的聚焦效應所壓制，從而降低了淺表層光聲信號對深層目標檢測的干擾。此外，由于聚焦超聲探頭焦點始終處于當前的成像位置上，其空間分辨率也不會隨成像深度的改變而發生顯著變化。圖 1 下圖顯示了聚焦超聲探頭探測波束與激光光路的關系。
圖1
所用 PAM 成像系統與光聲探測方法
Figure1.
The PAM system and its optical-ultrasonic detection arrangements
1.2 數據處理方法
數據處理采用 matlab 進行。先獲得系統中聚焦探頭焦點處的沖擊響應函數信號，對其進行頻譜分析，得到其中心頻率和帶寬，并對其進行希爾伯特變換并取包絡，得到包絡的半高寬。用所提出的方法進行數據處理時，需將探頭在每個位置所得的 A 掃描時域信號進行希爾伯特變換后取包絡，然后再選擇一定的時間窗大小，對探頭焦區范圍 t1 和 t2 之間的信號進行積分。由此得到焦點位置信號的強度：
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其中，L 為探頭焦距。經過對焦點位置在縱向二維平面上的掃描，就得到了樣品在縱向斷層截面的圖像。
由于系統中成像位置始終位于聚焦超聲探頭的焦點上，因此可以認為只有來自焦點附近的信號是有效的。為了確定超聲探頭的焦點位置，首先對超聲探頭進行了接收效率空間分布測試。測試中使用激光照射一根 0.1 mm 直徑的金屬絲產生光聲信號，并移動超聲探頭使光聲信號源位于不同的相對位置上，最后把每個位置上所獲得的時域信號幅度的最大值作為該位置處的超聲探頭接收效率，得到的超聲探頭接收效率空間分布如圖 2a 所示。通過取圖 2a 中每行數據中所有大于該行數據最大值 50% 的數據點的分布范圍，獲得如圖 2b 所示的縱向距離與橫向分辨率的關系曲線，從該圖中可以發現超聲探頭的焦距為 16 mm。為了進一步獲得該探頭焦區的范圍，畫出了焦點處的時域信號響應，如圖 3a 所示。最后將信號中所有幅值大于 10% 最大值的信號確定為焦區信號，從而確定了焦區范圍為 10.92～11.59 μs。處理后的數據主要用來生成縱向截面圖。
圖2
聚焦超聲探頭接收效率的空間分布及橫向分辨率
a. 聚焦超聲探頭接收效率的空間分布；b. 橫向分辨率與縱向距離的相對關系
Figure2. Receiving efficiency distribution and lateral resolution of the focused ultrasound transducera. the spatial distribution of the receiving efficiency of the focused ultrasound transducer; b. the relationship between the lateral resolution and the axial distance
圖3
焦區積分區間的確定
a. 聚焦超聲探頭所接收到的時域信號序列；b. 焦點處有效時域信號序列
Figure3. Determination of the focal integral zonea. photoacoustic signal received by the focused ultrasound transducer; b. the extracted signal of the focal zone
1.3 實驗方法
1.3.1 信噪比實驗
搭建了一個傳統同軸系統與本文實驗的非共軸系統信噪比對比實驗，以驗證所提出方法對成像信噪比的影響。信噪比實驗所用的瓊脂仿體外徑為 30 mm，由瓊脂粉、脂肪乳、墨汁制作，散射和吸收系數分別為 1 mm–1 和 0.07 mm–1，與活體宮頸正常組織相接近[22]。實驗所使用仿體中橫向插入了一根直徑為 0.5 mm 的金屬絲，其深度為 2 mm。為了進行同軸 PAM 成像，本文使用了如圖 4 所示的系統。激光垂直向下穿過一塊放置在仿體上方呈 45° 放置的 1 mm 厚度透明玻璃，照射到仿體上表面，仿體中所產生的光聲信號被這塊透明玻璃反射到放置在仿體上方側面的聚焦超聲探頭中。同軸 PAM 以 0.1 mm 的橫向步長掃描了仿體中與金屬絲垂直的橫向長度 6 mm、深度 3 mm 的一個面，并取每個橫向位置所對應光聲信號時間序列的最大幅值作為對比數據。采用所提出方法掃描了與同軸 PAM 相同的檢測面，橫向步長為 0.1 mm，深度步長為 0.05 mm，最后取每個橫向位置不同深度上的最大信號幅值作為對比數據。
1.3.2 仿體實驗
通過仿體實驗，對不同深度點目標成像，觀測目標位置、噪聲背景與拖尾情況，并與傳統共軸固定焦點的探測方式進行比較，來驗證所提出的方法的有效性。仿體實驗所用的瓊脂仿體與信噪比試驗中相同。在仿體不同位置豎直埋入四根直徑為 0.5 mm 的金屬絲。其中，金屬絲 1、2 縱向深 1 mm，金屬絲 3、4 縱向深 3 mm，同一縱向深度的兩根金屬絲平行且水平方向相距 2 mm。利用步進電機控制，采用聚焦超聲換能器對四根金屬絲進行斷層掃描。
1.3.3 裸鼠腫瘤實驗
在光聲非共軸探測條件下，本文還采用了縱向移動焦點加焦區積分方法與固定焦點方法，對裸鼠背部腫瘤成像結果進行了對比實驗，以驗證所提方法在活體組織成像中的效果。裸鼠腫瘤掃描實驗選用湖南斯萊克景達實驗動物有限公司 6 周齡的 Balb/c 雌性小鼠 6 只。Hela 細胞培養至足夠數目后將其懸浮于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，取離心后濃度為 5 × 107/mL 的細胞懸浮液 100 μL 注射入裸鼠背部皮下，每日觀察腫瘤生長情況。最終有 5 只成瘤，腫瘤細胞注射兩周后，腫瘤大小為（162 ± 25.2）mm2。在進行實驗前，需將裸鼠從動物房移出，并放置在實驗室環境中適應 1～2 d，然后以 0.5 g/kg 的劑量用水合氯醛麻醉 20 min，再進行掃描實驗。在進行裸鼠背部腫瘤掃描時，裸鼠麻醉后固定加熱板并固定在升降平臺上，水槽下有 30 mm × 30 mm 的開口，開口處貼有透明彈性聚乙烯薄膜。裸鼠背部腫瘤置于透明薄膜正下方，裸鼠腫瘤位置和透明薄膜間涂抹超聲膠以便超聲耦合，如圖 5 所示。
圖4
同軸光聲顯微系統
Figure4.
Coaxial photoacoustic microscopy system
圖5
裸鼠實驗系統裝置圖
Figure5.
System for nude mice experiments
2 結果與討論
2.1 信噪比實驗
將兩種成像方式所獲得的信號強度進行統一的歸一化處理后，進行曲線對比，結果如圖 6 所示。為了評估兩種成像模式的信噪比，本文將結果中大于各自最大值 40% 的數據點作為信號，其他的數據點的平均值作為背景噪聲計算了同軸和非同軸兩種成像模式的信噪比，分別為 3.417 3 dB 和 3.477 2 dB，可見兩種成像模式的信噪比基本相當。通常進行 PAM 同軸成像需要使用一面光學透明的超聲反射鏡，將同軸的光聲信號反射到側面的超聲探頭中。但激光穿透超聲反射鏡時會損失一部分能量，光聲信號在被反射過程中也會損失一部分能量。雖然同軸 PAM 成像在生物組織中的光學/聲學傳輸路徑比所提出方法要短，但其在光聲信號檢測和激光激發過程中要比所提出方法損失更多的能量，因此所提出方法的信噪比相比同軸 PAM 方法并未出現下降。
圖6
典型的同軸與非同軸系統光聲信號對比
Figure6.
Comparison between typical photoacoustic signals from coaxial and non-coaxial PAM systems
2.2 仿體實驗
實驗結果如圖 7 所示。其中，圖 7a 為金屬絲在仿體中的相對位置示意圖；圖 7b 為本文所述非共軸移動焦點疊加焦區積分方法所得結果，圖 7c 為非共軸移動焦點方法所得結果，圖 7d 為傳統共軸垂直背向固定焦點方法所得結果。圖 7b–d 的信號最大值都進行了歸一化。可以看到在三幅光聲圖像內，4 根金屬絲都可以清晰地成像，其分布與圖 7a 中的金屬絲的分布十分吻合。由此可見，在現有條件下，系統都可以對目標的光吸收分布進行真實的還原。
圖 7d 中，4 根金屬絲在圖像中表現出明顯的拖尾痕跡，尤其是靠近仿體表層的兩根金屬絲，其拖尾對下層其它 2 根金屬絲信號有明顯的干擾。與其相比，采用非共軸探測方式及移動焦點掃描方法后，拖尾現象得到了明顯的抑制，如圖 7c 所示；然而，在第 1 和第 3 根金屬絲之間，即部分離焦區域還是有較嚴重的雜散信號。圖 7b 中，采用焦區積分的方法處理數據后，4 根金屬絲的位置都得到了很好的還原，圖像背景噪聲也最小。同時也注意到，相對于圖 7d，在圖 7b、c 中下面兩根金屬絲的橫向尺寸更小。這說明本文所提出的縱向移動焦點的方法不僅可以很好地消除目標信號的拖尾現象，還能在較大的縱向深度內保持較高的橫向分辨率。通過截取圖 7b 各金屬絲中心橫向輪廓，并且測量其半高寬可得，各金屬絲的橫向輪廓平均大小約為 0.61 mm，即在本文所提出的方法的設置下，系統橫向分辨率約為 0.61 mm。這與現所用 10 MHz 聚焦探頭（孔徑 8 mm，焦距 15 mm）在 45° 方向上的橫向分辨率理論值 0.52 mm 相接近。
圖7
點目標仿體實驗結果
a. 仿體中目標的位置；b. 移動焦點掃描加焦區積分處理結果圖；c. 移動焦點掃描結果圖；d. 固定焦點掃描結果圖
Figure7. Results of point target experimenta. point target positions in the phantom; b. result of multiple axial scanning combined with focal zone integral; c. result of multiple axial scanning; d. result of focus fixed scanning
2.3 裸鼠腫瘤實驗
圖 8a 為裸鼠腫瘤實物照片，圖 8b 為固定焦點方法和移動焦點疊加焦區積分方法所對應的結果，圖中信號最大值都已歸一化到 1。如圖 8a 所示，腫瘤大小約為 13 mm，實驗中聚焦探頭沿著圖 8a 中黑色虛線箭頭所示方向進行掃描探測，掃描距離為 18 mm，采樣間隔為 0.1 mm。為了對深層成像效果進行定量分析，本文還在 1、2、3 mm 的深度上分別對比了以上兩種成像方式的結果，如圖 8c 所示。
從圖 8b 中可以看出，兩幅圖都給出了腫瘤表面較為清晰的輪廓。然而，圖 8b 左圖中的腫瘤只有在頂部有較強信號，頂部以下結構的信號強度很小。與其相比，圖 8b 右圖中腫瘤側邊輪廓更清晰，且顯示了更多的腫瘤內部結構。這是由于在圖 8b 左圖中，聚焦探頭焦平面在腫瘤頂部附近，因此焦平面下方信號收集效率低，橫向分辨率也較低。而用縱向移動焦點加焦區積分的方法，可以更好地保證縱向上每個位置的分辨率和超聲接收效率，從而得到更好的成像結果。
從圖 8c 中可以看出，成像深度越深，兩種成像方式所獲得的信息量差異越大。圖 8c 左圖為深度在皮膚下 1 mm 處，即為圖 b 中標注的 1 mm 深處的光聲信號。紅色折線為固定焦點方法的結果，藍色折線為經過焦區積分處理的移動焦點系統結果，可以看出在 1 mm 深度兩種方法均能看到較多的腫瘤邊緣信息。在 2 mm 的深度上，如圖 8c 中圖所示，紅色信號線固定焦點方式的結果中信號幅度已經非常小，基本無法提供有價值的信息，而本文所提出的方法仍然能夠提供一定的腫瘤深層的相關光吸收信息。
此外，本文還在成像實驗后從小鼠皮下取出了完整的腫瘤組織，并測量了其在深度上的尺寸，結果如圖 8a 右圖所示。可見腫瘤從頂部到底部的距離約為 10 mm，本文所提出的方法檢測到了其 6.5 mm 深度上的信息，而固定焦點方式的檢測深度未超過 2 mm。
圖8
裸鼠腫瘤實驗結果
a. 裸鼠腫瘤照片圖；b. 光聲顯微系統裸鼠腫瘤結果圖；c. 兩種方法距離表面不同深度腫瘤信號對比圖
Figure8. Results of xenograft experiments on nude micea. photos of in-vivo and excised tumor; b. PAM reconstruction results of the tumor; c. comparison of the tumor reconstructed profiles at different depths between the two methods
3 結論
本研究搭建了一套聲聚焦 PAM 實驗系統。采用聚焦探頭和光纖與水平面分別成 45° 角的非共軸的照明-探測方式，來減少淺表目標組織對深層信息的影響，并且采用了縱向滑動焦點和焦區積分的數據處理方法來保證不同深度上較高的橫向分辨率。仿體測試表明，所提出的方法在縱向各深度上都能保持約 0.6 mm 的橫向分辨率，與理論值相一致。該方法有效解決了在常規聲聚焦 PAM 中橫向分辨率與焦深的矛盾，以及組織深層目標易被淺表目標屏蔽這兩個問題，并且在隨后的裸鼠背部腫瘤活體實驗中對其成像效果進行了驗證。雖然由于縱向多次變焦掃描所用時間較長，但是隨著超快脈沖激光和高速步進電機的發展與應用，該方法將有效克服掃描時間過長的障礙，有望在腦部血管成像、宮頸癌內窺成像、表皮腫瘤成像等方面得到較好的應用。
引言
光聲成像是一種新型的無損生物成像技術。這種成像模態使用超短脈沖激光照射生物組織，通過探測光聲效應所產生的光聲信號來檢測樣品中的光吸收參數變化，兼具光學成像的高靈敏度以及超聲成像的高穿透深度和高空間分辨率的優點[1-10]。光聲顯微成像（photoacoustic microscopy，PAM）作為光聲成像的重要分支，通常通過檢測某個激光光路上所產生的超聲時域信號來直接分析該路徑上光吸收量的分布情況，而不需要使用逆向重建算法。按照空間分辨率的提供方式，光聲顯微系統一般分為兩種類型，一種是光聚焦 PAM，通過激光聚焦獲得高空間分辨率，但由于生物組織對光的強散射作用，其成像只限于淺表層，平均深度不超過光子平均自由程[11-12]。另一種是聲聚焦 PAM，通過超聲聚焦獲得空間分辨率，由于超聲在生物組織中的散射效應遠小于光，這種方法即使在組織內光子自由程范圍外仍然能夠獲得高分辨率的圖像，并且已經成功地應用在腫瘤、深層血管等活體組織成像中[13-18]。
然而，在常見的聲聚焦 PAM 中，通常采用一個與激光光路同軸的聚焦超聲探頭來獲取整個激光光路上所產生的超聲時間序列。這種成像方式會導致在同一激光光路上深層目標的光聲信號可能被淹沒在淺層目標光聲信號的拖尾中，從而降低系統對深層目標檢測的靈敏度[19]。此外，由于超聲探頭的焦點被固定在某個深度上，系統的橫向空間分辨率會隨著遠離聚焦區域而顯著降低[20]。汪力宏課題組[12]在 2005 年提出了一種暗場共聚焦 PAM 系統，這一系統采用一個錐形鏡暗場照明系統，有效降低了超聲探頭正下方表面組織的光照強度，從而極大地減小了表面組織對深層目標信號的影響，并使用高數值孔徑的聚焦探頭來提高系統的橫向分辨率。2012 年，劉炎炎等[21]在汪力宏組類似的暗場光聲顯微系統的基礎上，進一步提出了一種基于稀疏掃描輪廓的滑動焦點 PAM 方法，通過在平面掃描過程中不斷調節探頭的聚焦深度，使得感興趣的目標樣品始終處于焦深的范圍，從而獲得分辨率和信噪比均勻的光聲顯微圖像。但劉炎炎等的實驗只是對二維平面掃描的優化，并沒給出完整的三維圖像。
本文搭建了一套聲聚焦 PAM 系統，采用一種非共軸的照明-探測方法來減少淺層組織對深層信息的影響。這種方法中，超聲檢測波束和激光光路相互垂直且聚焦超聲探頭的焦點始終位于兩者的交匯點上，并將所獲取的光聲信號作為該位置上的光聲成像結果，移動該交匯點遍歷成像區域，從而獲得完整圖像。此外，由于聚焦超聲探頭的焦點始終處于當前的成像深度，這種方法也能夠在不同的成像深度上保持基本一致的空間分辨率。
1 系統與方法
1.1 成像系統
實驗系統設置如圖 1 上圖所示。激光器（Q-switched Nd：YAG，北京鐳寶光電技術有限公司）所產生的 532 nm 脈沖激光被凸透鏡聚焦之后耦合進一根芯徑為 0.8 mm 的多模光纖中，光纖另一端的出射光被另一個凸透鏡進行整形之后與水平面呈 45° 角入射到水槽中的樣品中。一個中心頻率為 10 MHz 的聚焦超聲探頭（A312S-N-SU，日本 Olympus Co，焦距約為 15 mm，橫向分辨率和縱向分辨率分別為 0.4 mm 和 0.2 mm）被用于采集光聲信號，這個超聲探頭同樣與水平面呈 45° 角安裝固定，且超聲探頭的焦點被放置在超聲檢測波束和激光光路的交點上。光纖的出射端、出射光整形透鏡和聚焦超聲探頭一起被安裝在一個 TSA 電控位移臺（TSA150-b，北京卓立漢光儀器有限公司）上以實現水平和縱向移動且步進均為 0.1 mm。超聲探頭所接收到的光聲信號在經過超聲脈沖發射接收器（5072PR，日本 Olympus Co）的濾波和放大之后被計算機中的數據采集卡（Spectrum M4i 2223-x8，北京坤馳科技有限公司，雙通道，最大采樣速率 2.5 GS/s，最大帶寬 1 GHz）記錄和保存。整個系統的觸發信號由脈沖激光器提供，數據的采樣頻率為 100 MHz。在成像時，聚焦超聲探頭和光纖出射端同步進行垂直和水平移動。對于某個移動位置而言，當前聚焦超聲探頭的焦點位置為其成像位置，在該位置上只測量該成像位置上的光聲信號。在完成全部水平和垂直移動之后可以最終獲得一幅樣品的 B 掃描圖像。平移臺的移動由計算機中的 Labview 程序通過電機控制器（SC300，北京卓立漢光儀器有限公司）進行管理。本文實驗在精密光學平臺（OTPOT18-12，北京卓立漢光儀器有限公司）完成。
這一系統中，由于激光光路和聚焦超聲探頭的檢測波束相互垂直，且超聲探頭焦點始終位于超聲探頭檢測波束和激光光路的交匯位置上，因此激光光路上來自淺表層的光聲信號將被超聲探頭的聚焦效應所壓制，從而降低了淺表層光聲信號對深層目標檢測的干擾。此外，由于聚焦超聲探頭焦點始終處于當前的成像位置上，其空間分辨率也不會隨成像深度的改變而發生顯著變化。圖 1 下圖顯示了聚焦超聲探頭探測波束與激光光路的關系。
圖1
所用 PAM 成像系統與光聲探測方法
Figure1.
The PAM system and its optical-ultrasonic detection arrangements
1.2 數據處理方法
數據處理采用 matlab 進行。先獲得系統中聚焦探頭焦點處的沖擊響應函數信號，對其進行頻譜分析，得到其中心頻率和帶寬，并對其進行希爾伯特變換并取包絡，得到包絡的半高寬。用所提出的方法進行數據處理時，需將探頭在每個位置所得的 A 掃描時域信號進行希爾伯特變換后取包絡，然后再選擇一定的時間窗大小，對探頭焦區范圍 t1 和 t2 之間的信號進行積分。由此得到焦點位置信號的強度：
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其中，L 為探頭焦距。經過對焦點位置在縱向二維平面上的掃描，就得到了樣品在縱向斷層截面的圖像。
由于系統中成像位置始終位于聚焦超聲探頭的焦點上，因此可以認為只有來自焦點附近的信號是有效的。為了確定超聲探頭的焦點位置，首先對超聲探頭進行了接收效率空間分布測試。測試中使用激光照射一根 0.1 mm 直徑的金屬絲產生光聲信號，并移動超聲探頭使光聲信號源位于不同的相對位置上，最后把每個位置上所獲得的時域信號幅度的最大值作為該位置處的超聲探頭接收效率，得到的超聲探頭接收效率空間分布如圖 2a 所示。通過取圖 2a 中每行數據中所有大于該行數據最大值 50% 的數據點的分布范圍，獲得如圖 2b 所示的縱向距離與橫向分辨率的關系曲線，從該圖中可以發現超聲探頭的焦距為 16 mm。為了進一步獲得該探頭焦區的范圍，畫出了焦點處的時域信號響應，如圖 3a 所示。最后將信號中所有幅值大于 10% 最大值的信號確定為焦區信號，從而確定了焦區范圍為 10.92～11.59 μs。處理后的數據主要用來生成縱向截面圖。
圖2
聚焦超聲探頭接收效率的空間分布及橫向分辨率
a. 聚焦超聲探頭接收效率的空間分布；b. 橫向分辨率與縱向距離的相對關系
Figure2. Receiving efficiency distribution and lateral resolution of the focused ultrasound transducera. the spatial distribution of the receiving efficiency of the focused ultrasound transducer; b. the relationship between the lateral resolution and the axial distance
圖3
焦區積分區間的確定
a. 聚焦超聲探頭所接收到的時域信號序列；b. 焦點處有效時域信號序列
Figure3. Determination of the focal integral zonea. photoacoustic signal received by the focused ultrasound transducer; b. the extracted signal of the focal zone
1.3 實驗方法
1.3.1 信噪比實驗
搭建了一個傳統同軸系統與本文實驗的非共軸系統信噪比對比實驗，以驗證所提出方法對成像信噪比的影響。信噪比實驗所用的瓊脂仿體外徑為 30 mm，由瓊脂粉、脂肪乳、墨汁制作，散射和吸收系數分別為 1 mm–1 和 0.07 mm–1，與活體宮頸正常組織相接近[22]。實驗所使用仿體中橫向插入了一根直徑為 0.5 mm 的金屬絲，其深度為 2 mm。為了進行同軸 PAM 成像，本文使用了如圖 4 所示的系統。激光垂直向下穿過一塊放置在仿體上方呈 45° 放置的 1 mm 厚度透明玻璃，照射到仿體上表面，仿體中所產生的光聲信號被這塊透明玻璃反射到放置在仿體上方側面的聚焦超聲探頭中。同軸 PAM 以 0.1 mm 的橫向步長掃描了仿體中與金屬絲垂直的橫向長度 6 mm、深度 3 mm 的一個面，并取每個橫向位置所對應光聲信號時間序列的最大幅值作為對比數據。采用所提出方法掃描了與同軸 PAM 相同的檢測面，橫向步長為 0.1 mm，深度步長為 0.05 mm，最后取每個橫向位置不同深度上的最大信號幅值作為對比數據。
1.3.2 仿體實驗
通過仿體實驗，對不同深度點目標成像，觀測目標位置、噪聲背景與拖尾情況，并與傳統共軸固定焦點的探測方式進行比較，來驗證所提出的方法的有效性。仿體實驗所用的瓊脂仿體與信噪比試驗中相同。在仿體不同位置豎直埋入四根直徑為 0.5 mm 的金屬絲。其中，金屬絲 1、2 縱向深 1 mm，金屬絲 3、4 縱向深 3 mm，同一縱向深度的兩根金屬絲平行且水平方向相距 2 mm。利用步進電機控制，采用聚焦超聲換能器對四根金屬絲進行斷層掃描。
1.3.3 裸鼠腫瘤實驗
在光聲非共軸探測條件下，本文還采用了縱向移動焦點加焦區積分方法與固定焦點方法，對裸鼠背部腫瘤成像結果進行了對比實驗，以驗證所提方法在活體組織成像中的效果。裸鼠腫瘤掃描實驗選用湖南斯萊克景達實驗動物有限公司 6 周齡的 Balb/c 雌性小鼠 6 只。Hela 細胞培養至足夠數目后將其懸浮于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，取離心后濃度為 5 × 107/mL 的細胞懸浮液 100 μL 注射入裸鼠背部皮下，每日觀察腫瘤生長情況。最終有 5 只成瘤，腫瘤細胞注射兩周后，腫瘤大小為（162 ± 25.2）mm2。在進行實驗前，需將裸鼠從動物房移出，并放置在實驗室環境中適應 1～2 d，然后以 0.5 g/kg 的劑量用水合氯醛麻醉 20 min，再進行掃描實驗。在進行裸鼠背部腫瘤掃描時，裸鼠麻醉后固定加熱板并固定在升降平臺上，水槽下有 30 mm × 30 mm 的開口，開口處貼有透明彈性聚乙烯薄膜。裸鼠背部腫瘤置于透明薄膜正下方，裸鼠腫瘤位置和透明薄膜間涂抹超聲膠以便超聲耦合，如圖 5 所示。
圖4
同軸光聲顯微系統
Figure4.
Coaxial photoacoustic microscopy system
圖5
裸鼠實驗系統裝置圖
Figure5.
System for nude mice experiments
2 結果與討論
2.1 信噪比實驗
將兩種成像方式所獲得的信號強度進行統一的歸一化處理后，進行曲線對比，結果如圖 6 所示。為了評估兩種成像模式的信噪比，本文將結果中大于各自最大值 40% 的數據點作為信號，其他的數據點的平均值作為背景噪聲計算了同軸和非同軸兩種成像模式的信噪比，分別為 3.417 3 dB 和 3.477 2 dB，可見兩種成像模式的信噪比基本相當。通常進行 PAM 同軸成像需要使用一面光學透明的超聲反射鏡，將同軸的光聲信號反射到側面的超聲探頭中。但激光穿透超聲反射鏡時會損失一部分能量，光聲信號在被反射過程中也會損失一部分能量。雖然同軸 PAM 成像在生物組織中的光學/聲學傳輸路徑比所提出方法要短，但其在光聲信號檢測和激光激發過程中要比所提出方法損失更多的能量，因此所提出方法的信噪比相比同軸 PAM 方法并未出現下降。
圖6
典型的同軸與非同軸系統光聲信號對比
Figure6.
Comparison between typical photoacoustic signals from coaxial and non-coaxial PAM systems
2.2 仿體實驗
實驗結果如圖 7 所示。其中，圖 7a 為金屬絲在仿體中的相對位置示意圖；圖 7b 為本文所述非共軸移動焦點疊加焦區積分方法所得結果，圖 7c 為非共軸移動焦點方法所得結果，圖 7d 為傳統共軸垂直背向固定焦點方法所得結果。圖 7b–d 的信號最大值都進行了歸一化。可以看到在三幅光聲圖像內，4 根金屬絲都可以清晰地成像，其分布與圖 7a 中的金屬絲的分布十分吻合。由此可見，在現有條件下，系統都可以對目標的光吸收分布進行真實的還原。
圖 7d 中，4 根金屬絲在圖像中表現出明顯的拖尾痕跡，尤其是靠近仿體表層的兩根金屬絲，其拖尾對下層其它 2 根金屬絲信號有明顯的干擾。與其相比，采用非共軸探測方式及移動焦點掃描方法后，拖尾現象得到了明顯的抑制，如圖 7c 所示；然而，在第 1 和第 3 根金屬絲之間，即部分離焦區域還是有較嚴重的雜散信號。圖 7b 中，采用焦區積分的方法處理數據后，4 根金屬絲的位置都得到了很好的還原，圖像背景噪聲也最小。同時也注意到，相對于圖 7d，在圖 7b、c 中下面兩根金屬絲的橫向尺寸更小。這說明本文所提出的縱向移動焦點的方法不僅可以很好地消除目標信號的拖尾現象，還能在較大的縱向深度內保持較高的橫向分辨率。通過截取圖 7b 各金屬絲中心橫向輪廓，并且測量其半高寬可得，各金屬絲的橫向輪廓平均大小約為 0.61 mm，即在本文所提出的方法的設置下，系統橫向分辨率約為 0.61 mm。這與現所用 10 MHz 聚焦探頭（孔徑 8 mm，焦距 15 mm）在 45° 方向上的橫向分辨率理論值 0.52 mm 相接近。
圖7
點目標仿體實驗結果
a. 仿體中目標的位置；b. 移動焦點掃描加焦區積分處理結果圖；c. 移動焦點掃描結果圖；d. 固定焦點掃描結果圖
Figure7. Results of point target experimenta. point target positions in the phantom; b. result of multiple axial scanning combined with focal zone integral; c. result of multiple axial scanning; d. result of focus fixed scanning
2.3 裸鼠腫瘤實驗
圖 8a 為裸鼠腫瘤實物照片，圖 8b 為固定焦點方法和移動焦點疊加焦區積分方法所對應的結果，圖中信號最大值都已歸一化到 1。如圖 8a 所示，腫瘤大小約為 13 mm，實驗中聚焦探頭沿著圖 8a 中黑色虛線箭頭所示方向進行掃描探測，掃描距離為 18 mm，采樣間隔為 0.1 mm。為了對深層成像效果進行定量分析，本文還在 1、2、3 mm 的深度上分別對比了以上兩種成像方式的結果，如圖 8c 所示。
從圖 8b 中可以看出，兩幅圖都給出了腫瘤表面較為清晰的輪廓。然而，圖 8b 左圖中的腫瘤只有在頂部有較強信號，頂部以下結構的信號強度很小。與其相比，圖 8b 右圖中腫瘤側邊輪廓更清晰，且顯示了更多的腫瘤內部結構。這是由于在圖 8b 左圖中，聚焦探頭焦平面在腫瘤頂部附近，因此焦平面下方信號收集效率低，橫向分辨率也較低。而用縱向移動焦點加焦區積分的方法，可以更好地保證縱向上每個位置的分辨率和超聲接收效率，從而得到更好的成像結果。
從圖 8c 中可以看出，成像深度越深，兩種成像方式所獲得的信息量差異越大。圖 8c 左圖為深度在皮膚下 1 mm 處，即為圖 b 中標注的 1 mm 深處的光聲信號。紅色折線為固定焦點方法的結果，藍色折線為經過焦區積分處理的移動焦點系統結果，可以看出在 1 mm 深度兩種方法均能看到較多的腫瘤邊緣信息。在 2 mm 的深度上，如圖 8c 中圖所示，紅色信號線固定焦點方式的結果中信號幅度已經非常小，基本無法提供有價值的信息，而本文所提出的方法仍然能夠提供一定的腫瘤深層的相關光吸收信息。
此外，本文還在成像實驗后從小鼠皮下取出了完整的腫瘤組織，并測量了其在深度上的尺寸，結果如圖 8a 右圖所示。可見腫瘤從頂部到底部的距離約為 10 mm，本文所提出的方法檢測到了其 6.5 mm 深度上的信息，而固定焦點方式的檢測深度未超過 2 mm。
圖8
裸鼠腫瘤實驗結果
a. 裸鼠腫瘤照片圖；b. 光聲顯微系統裸鼠腫瘤結果圖；c. 兩種方法距離表面不同深度腫瘤信號對比圖
Figure8. Results of xenograft experiments on nude micea. photos of in-vivo and excised tumor; b. PAM reconstruction results of the tumor; c. comparison of the tumor reconstructed profiles at different depths between the two methods
3 結論
本研究搭建了一套聲聚焦 PAM 實驗系統。采用聚焦探頭和光纖與水平面分別成 45° 角的非共軸的照明-探測方式，來減少淺表目標組織對深層信息的影響，并且采用了縱向滑動焦點和焦區積分的數據處理方法來保證不同深度上較高的橫向分辨率。仿體測試表明，所提出的方法在縱向各深度上都能保持約 0.6 mm 的橫向分辨率，與理論值相一致。該方法有效解決了在常規聲聚焦 PAM 中橫向分辨率與焦深的矛盾，以及組織深層目標易被淺表目標屏蔽這兩個問題，并且在隨后的裸鼠背部腫瘤活體實驗中對其成像效果進行了驗證。雖然由于縱向多次變焦掃描所用時間較長，但是隨著超快脈沖激光和高速步進電機的發展與應用，該方法將有效克服掃描時間過長的障礙，有望在腦部血管成像、宮頸癌內窺成像、表皮腫瘤成像等方面得到較好的應用。
