骨重建是一個不斷進行骨吸收與骨形成的平衡動態過程，需要成骨細胞和破骨細胞的緊密配合，并經由復雜的旁分泌和自分泌途徑，被相關調節蛋白緊密地調控。骨細胞、骨被覆細胞、骨巨噬細胞以及血管內皮細胞在基礎多細胞單位（BMU）中均通過配體-受體復合物的細胞信號網絡參與到骨重建調節過程中。此外，T 淋巴細胞和 B 淋巴細胞通過處于骨微環境中的分泌型和膜結合型因子，也參與到骨重建過程中，在骨免疫中調節骨的內穩態。在骨重建的過程中，常由于 BMU 中的細胞間連接被破壞，導致多發骨質疏松癥和其他骨疾病發生。本文主要從細胞水平上描述骨重建過程中的細胞間聯系、分子基礎和新型旁分泌或偶聯因子，了解骨重建過程和相關基因，有助于對骨質疏松等骨科疾病的藥物開發奠定基礎。
引用本文： 胡淵博, 王樂莎, 蔣蕾, 徐華梓, 朱思品. 在細胞水平上調控骨重建的相關研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2017, 34(3): 471-479. doi: 10.7507/1001-5515.201606011 復制
引言
骨組織是一種兼具穩態和動態平衡特點的結締組織。在生物化學方面，它被定義為無機元素和有機基質的混合物。為了保持其結構的完整性，維持體內礦物質平衡，骨組織不斷地進行塑造、成形和修復這一系列的重建過程。在成年后，骨重建主要是調節骨結構和功能的動態過程。骨重建是一個涉及破骨細胞和成骨細胞這兩類關鍵細胞相互轉化的復雜、嚴格的調控過程[1]。破骨細胞是主管骨吸收功能的細胞，在骨骼的形成和骨密度的調節中發揮了重要作用。成骨細胞是特殊的骨形成細胞，能合成骨基質，調節礦化并最終分化為骨細胞或骨被覆細胞。機體內眾多局部和系統的因子高度調控著破骨細胞和成骨細胞之間的相互作用，以維持骨內平衡[2]。骨重建過程中的平衡無論是偏向成骨細胞還是破骨細胞，都可能引起如：骨量減少、骨質疏松和骨硬化病等臨床疾病。骨重建的確切機制現在還不是很清楚。因此，本文主要闡述與進一步探討參與骨重建的細胞、其內在分子機制，以了解骨重建過程和相關基因，有助于對骨質疏松等骨科疾病的藥物開發奠定基礎。
1 骨重建單位
近期相關研究表明，識別和利用骨重建中分泌的“偶聯因子（coupling factors）”可以調控基礎多細胞單位（basic multicellular unit，BMU）內相關細胞的暫時性激活和功能，有效縮短骨重建的周期。本文則著重強調 BMU 中的細胞作用，以及在細胞水平參與調節骨重建的細胞和因子之間的相互作用。
骨重建是通過功能相同的細胞——BMU 感受力學刺激來對骨的生長或吸收進行調控的過程。BMU 包括破骨細胞、成骨細胞、骨細胞、骨被覆細胞和血管內皮細胞。
骨重建過程是一個多種細胞參與的過程，信號傳導和細胞間交流在這個過程中起著重要作用。細胞因子（cytokine）是一類由各種免疫細胞和非免疫細胞產生的具有生物活性的小分子糖蛋白，負責參與介導細胞間的相互作用。細胞因子包括趨化因子、干擾素、白細胞介素、腫瘤壞死因子和淋巴因子等，每一種細胞因子作用于特定的靶細胞，產生不同或相同的生物學效應[2]。如圖 1 所示，在骨重建過程中，涉及到多種細胞因子的參與和相互作用，而骨細胞、破骨細胞、成骨細胞三者之間的關系最為重要。這些細胞因子中，硬骨素（sclerostin）是硬化性骨化病（sclerosteosis）基因所表達的一種蛋白質產物。近年來，研究者發現，sclerostin 能調節骨細胞分化成為成骨細胞[3-4]。而核因子 κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL）能在成骨細胞、T 淋巴細胞和內皮細胞內翻譯表達，參與破骨細胞的形成，并與破骨細胞及其前體上的核因子 κB 受體活化因子受體（receptor activator of nuclear factor kappa-B，RANK）連接并發揮重要作用[5]。紅細胞生成素誘導的肝細胞受體（Erythropoietin-producing hepato-cellular，Eph）及其配體（Ephrin）是酪氨酸激酶受體家族成員之一，破骨細胞與成骨細胞之間的 Eph-Ephrin 雙向信號系統在骨重建中發揮重要作用。它們之間的聯系體現為：破骨細胞上存在 EphrinB2 配體，成骨細胞前體上存在 EphB4 受體，兩者通過細胞直接接觸，在成骨細胞內產生正向信號的同時，在破骨細胞內產生反向信號，從而起到調節成骨細胞與破骨細胞之間相互平衡的作用[6]。另外，骨組織周圍毛細血管可為骨組織提供氧氣、營養素和激素等，如圖 1 紅色箭頭所示，并且其中的 T 淋巴細胞活化會產生 RNAKL、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor α，TNF-α）等破骨細胞生成因子，參與調節骨重建，如圖 1 綠色箭頭所示。
圖1
骨重建的基礎多細胞單位
Figure1.
BMU of bone remodeling
骨重建周期包括啟動階段、逆轉階段和終止階段。開始的啟動階段，包括破骨細胞前體的募集、分化和成熟以及骨吸收的活化和維持。之后會出現一個逆轉階段，即破骨性骨修復被抑制和破骨細胞凋亡，而成骨細胞開始歸巢和分化。逆轉階段是破骨細胞激活到成骨細胞激活的過渡。最后階段，也叫終止階段，是成骨細胞介導的骨形成過程[7]。這一階段持續時間最長，因為骨形成比骨吸收慢，其中涉及新骨的形成、礦化以及成骨細胞的晚期分化。骨重建過程的時間會因在機體內發生的位置不同而有所不同，例如松質骨的骨重建周期平均約 200 d，其中終止階段占據整個周期的 3/4 時間，而皮質骨的重建周期相較松質骨短的原因就在于其終止階段的持續時間較短。
2 破骨細胞
破骨細胞是一類多核巨細胞，是由單核細胞、巨噬細胞家族的單核祖細胞融合而成，這一融合過程被稱作破骨細胞的形成[2]。破骨細胞一般位于骨內膜表面哈弗斯管內和骨外膜表面的骨膜下，在骨組織中數量通常極少，只有 2～3 個/μm3。破骨細胞有運動期和重吸收期兩種功能狀態，并且在不同的分期呈現出不同的細胞形態。運動期的破骨細胞是扁平的無極化細胞，重吸收期的破骨細胞則呈圓頂狀并且伸出板狀偽足。這些具有被稱為板狀偽足的毛樣突起和包含肌動蛋白的偽足小體復合物的破骨細胞，通過板狀偽足來進行移動和擴散。在到達重吸收位置后，破骨細胞通過細胞骨架重組極化，最后導致皺褶緣、封閉區域、功能分泌域和基底側膜等一系列膜域的形成。其中封閉區域是破骨細胞的一種特殊結構，其將酸性再吸收的環境與細胞的其他區域分開，形成一個器官免干擾區域[8]，而褶皺緣和封閉區域只在非運動的重吸收期的破骨細胞中被發現。
2.1 在 BMU 中破骨細胞分化的調節
破骨細胞的分化和融合需要大量破骨細胞生成因子并經多步驟調節。造血干細胞是一組骨髓單核細胞，能夠生成破骨細胞前體。這些細胞的進一步分化需要骨基質細胞、成骨細胞或 T 淋巴細胞產生的因子共同作用[9]。巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating fact，M-CSF）和 RANKL 這兩個因子是促進破骨細胞生成所必要的。
M-CSF 是由成骨細胞和干細胞產生的，在巨噬細胞成熟、與破骨細胞前體細胞上的跨膜糖蛋白受體酪氨酸激酶受體（transmembrane glycoprotein-receptor tyrosine kinase，c-Fms）結合并在促進其生存和增殖中起重要作用。通過 c-Fms 受體介導的信號轉導包括細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）和磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）等多重途徑。M-CSF 能在早期激活骨肉瘤致癌基因轉錄因子（c-Fos）和造血轉錄因子（PU.1）。缺少 M-CSF 或 PU.1 的小鼠會缺乏破骨細胞和巨噬細胞，與此同時滅活 c-Fos 將阻止破骨細胞生成并導致骨硬化表型的表達[10]。有趣的是，骨硬化（基因型為 op/op）小鼠的突變導致 M-CSF 缺乏，最后卻能恢復破骨細胞分化的功能。這提示我們可能還有其他因素能夠代償 M-CSF 缺乏。
RANKL 可由成骨細胞、T 淋巴細胞和內皮細胞表達，在破骨細胞的形成和連接破骨細胞及其前體上的 RANK 受體時發揮重要作用[11]。通過 RANKL 刺激表達 M-CSF 的前體細胞，使其分化為破骨細胞表型，這些細胞之后將會表達一些破骨細胞關鍵標記物，如抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）。在 M-CSF 和 RANKL 進一步地刺激下，破骨細胞前體融合形成多核細胞并開始表達更多像降血鈣素受體和組織蛋白酶 K 這樣的特殊破骨細胞標記。RANKL 和 RANK 的連接依賴于這兩個分子間的聚合作用，RANKL 的激活作用可以被可溶性誘導的骨保護蛋白（osteoprote-gerin，OPG）受體所抵消[12]。這個受體能阻止 RANKL 和 RANK 的結合，并抑制破骨細胞的分化。RANKL 的信號傳遞取決于 RANK/OPG 和 RANK 在破骨細胞前體中的表達量。因此通過生成 RANKL 和 OPG，成骨細胞能夠控制骨生成和骨重吸收。
除此之外，還有一些與破骨細胞相關的重要調節因子，例如其中的核轉錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB），作為一個轉錄因子蛋白家族，包括 5 個亞單位：Rel（cRel）、p65（RelA，NF-κB3）、RelB、p50（NF-κB1）、p52（NF-κB2），其中以 p65 和 p50 組成的二聚體形式最為常見。NF-κB 參與多種基因的轉錄調控，與許多重要的病理生理過程密切相關。位點特異的 NF-κB 抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）的磷酸化對于激活 NF-κB 有重要意義。IκB 激酶（IκB kinase，IKK）能磷酸化 IκB，為進一步了解 NF-κB 在骨重建分子水平的功能和調控提供了線索。其由兩個催化亞基 α、β 和一個調節亞基 γ 組成，其中 β 亞基可能通過降解 IκB 來介導 NF-κB 的活化。IKKα 參與 NF-κB 前體的轉化和 p65 的磷酸化。
在靜息狀態下，NF-κB 與其抑制蛋白 IκB 結合，駐留在胞漿內。在 RANK 與 RANKL 結合后激活，其胞漿部分與泛素連接酶（TNFR-associated activalor factors 6，TRAF6）結合，啟動細胞內的信號級聯反應。TRAF6 能激活 IKK，活化的 IKK 再催化 IκB 磷酸化，并使其被蛋白酶體降解，釋放出 NF-κB。游離的 NF-κB 的 p50、p65 二聚體由胞漿轉移至細胞核中與脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）特異區域結合，啟動破骨細胞特異性基因的轉錄。在破骨細胞中 NF-κB 信號轉導通路的異常激活將破壞骨重建，并導致溶骨性疾病發生[13]，如圖 2 所示。
圖2
破骨細胞內 RANKL 信號通路
Figure2.
RANK/RANKL signalling pathway in osteoclasts
雖然 RANKL 已經被證實是破骨細胞分化的重要信號，但是協同刺激途徑也是不可或缺的。活化 T 細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）也在破骨細胞分化中起重要作用[14]。RANKL 通過促進鈣振蕩來激活 NFAT。這一過程是通過免疫球蛋白樣受體的協同刺激和承接分子的作用實現的。免疫球蛋白樣受體包括破骨細胞相關的受體（osteoclast associated receptor，OSCAR）和髓細胞觸發表達受體（triggering receptor expressed myeloi-dcells，TREM），承接分子則包含免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM motifs）。這一信號級聯反應激活磷脂酶 Cγ（phospholipase Cγ，PLCγ）和下游的鈣離子，介導活化 T 細胞核因子胞 1 蛋白（nuclear factor of activated T-cells，cytoplasmic 1，NFATc1）在細胞核內的轉移、翻譯及自我擴增。除此之外，鈣調蛋白激酶（calcium/calmodulin-dependent protein，CaMK），作為下游鈣離子的主要調節介質，在 RANKL 介導的破骨細胞分化和骨再吸收中起重要作用[15]。
2.2 破骨細胞在骨重建中的作用
雖然破骨細胞在骨重建里的基礎功能是骨的重吸收，但同時也有調節骨形成的功能。在破骨細胞重吸收并與成骨細胞相接觸時，破骨細胞通過分泌因子來調節骨形成和基質衍生因子的釋放。
破骨細胞的骨重吸收功能是調節骨形成的一種方式。吸收池本身的分布是介導骨形成的一個重要因素。在缺乏破骨細胞時，成骨細胞可能識別部分吸收陷窩，如 TRAP 沉積。TRAP 沉積能被破骨細胞再吸收，以及進行膠原轉換[16]。成骨細胞表達的 RANKL 不僅能直接激活破骨細胞的骨重吸收作用，也能作用于成骨細胞的骨形成。
破骨細胞在骨重吸收時，能夠釋放調節成骨細胞骨形成的骨基質衍生因子。在骨基質沉積和作用于成骨細胞時，成骨細胞釋放這些因子來促進骨形成；然而也可能是破骨細胞在吸收骨基質時，加工骨基質衍生因子并調節其釋放來作用于成骨細胞[17]。這些因子包括骨形成蛋白（bone morphoge-netic proteins，BMPs），胰島素樣生長因子（insulin like growth factor system，IGFs）：IGFs I 和 IGFs II，以及轉換生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）。
然而，在有骨硬化病的患者和小鼠中，破骨細胞的重吸收作用并不是成骨細胞骨形成的必要條件。因為在具有較多破骨細胞的骨硬化病情況下，雖然破骨細胞功能受損，但是仍然有大量的有功能的成骨細胞，這不僅表明破骨細胞數量在骨形成中比它的功能活性更重要，也表明破骨細胞并不是骨形成的必須條件[18]。
破骨細胞調節成骨細胞的可能方式一直是一個令人感興趣的課題，并且已經有大量的研究工作來識別這一對耦合因素表達的潛在靶點。鞘氨醇磷酸酯（sphingosine-1-phosphate，S1P）是由破骨細胞分泌的，它通過與成骨細胞上的受體結合可增強成骨細胞的遷移和生存，并上調 RANKL 生成。S1P 也能通過調節破骨細胞前體的遷移來直接作用于破骨細胞[19]。肝配蛋白 B2 作為破骨細胞表達的膜結合配體，通過接觸依賴的機制結合破骨細胞上的受體 EphB4，兩者相互作用促進成骨細胞分化和骨形成。肝配蛋白和 Eph 的相互作用可以產生雙向信號傳導，由此提示 EphB4 作用于破骨細胞并抑制分化。
成熟破骨細胞能表達 EphrinB2，而成骨細胞前體表達 EphB4，于是我們推測在骨重建中 EphrinB2 和 EphB4 的相互作用可能調節骨吸收和骨形成之間的轉化。最近，由破骨細胞表達的腦信號蛋白 4D 已被確定為一個偶聯因子，它通過結合破骨細胞上的 Plexin-B1 受體，激活 RhoA 蛋白從而抑制骨的形成[20]。
3 成骨細胞
成骨細胞是唯一負責骨形成的細胞。它來源于具有分化為成熟成骨細胞潛能的間充質干細胞。成骨細胞分化分成四個階段：前成骨細胞、成骨細胞、骨細胞和骨被覆細胞。當提供適當的刺激時，間充質干細胞能夠分化為前成骨細胞。這些細胞在組織學上類似成骨細胞，并且在堿性磷酸酶染色中呈陽性；然而它們缺乏一些成熟的成骨細胞的特點，包括產生礦化組織的能力[21]。當前成骨細胞形成成熟的成骨細胞時，呈現出立方形的形態和堿性磷酸酶強陽性。在骨形成活躍的位置，它們定植在骨表面。成骨細胞分泌 I 型膠原蛋白作為骨的基本構成材料。此外，它們生產非膠原蛋白，包括骨鈣素（一種骨中特有的維生素k依賴鈣結合小蛋白）和堿性磷酸酶來作用于礦物沉積。若敲除小鼠的堿性磷酸酶基因，小鼠生長受到抑制并在 3 周內死亡，組織檢測顯示小鼠礦化作用缺失，成骨細胞形態異常。這些研究可能表明堿性磷酸酶對成骨細胞的功能具有重要作用。
3.1 在 BMU 中成骨細胞的調節
成骨細胞中調節骨形成的一個最重要的信號通路是 Wnt/β-catenin 信號通路[2]。Wnt 配體與跨膜受體卷曲蛋白 frizzled 和低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）受體相關蛋白 5 或 6（LDL receptor related protein 5/6，LRP5/6）組成的受體復合物結合。在沒有配體結合時，糖原合酶激酶-3（glycogen synthase kinase 3，GSK-3）、結腸腺瘤樣息肉（adenomatous polyposis coli，APC）蛋白和支架蛋白 Axin 復合體使 β-鏈蛋白（β-catenin）磷酸化，繼而導致其泛素化并在蛋白酶體中降解。當 Wnt 與其受體復合物結合時將激活蓬亂蛋白（dishevelled，DVL），并抑制 GSK-3 活性。這樣 β-catenin 就不會被降解，從而轉移到核內激活淋巴樣增強因子（1ymphoid enhancer factor，LEF）和 T 細胞因子（T cell factor，TCF），介導與成骨細胞分化、作用、生存有關的目的基因轉錄，如圖 3 所示。
圖3
成骨細胞中 Wnt/β-catenin 信號通路
Figure3.
Canonical Wnt/β-catenin signalling pathway in osteoblasts
Wnt/β-catenin 途徑的各種生理抑制劑的主要功能是阻止配體和受體復合物的形成。它們包括能與 LRP5/6 結合的 sclerostin 和 Dickoff-1（Dkk-1），和與 Wnt 結合的分泌型 frizzled 相關蛋白（Sfrp）。Wnt/β-catenin 通路在骨生物學中的重要性，在人類 LRP5 基因的突變中被突顯出來。LRP5 突變引起的功能損失將導致骨質疏松癥和假神經膠質瘤綜合癥，這是一種以早期出現骨質疏松癥和失明為特點的常染色體隱性疾病[22]。相反，突變引起的功能升高與高骨量相關。這些人類表型已經被復制到小鼠身上，由于改變成骨細胞增殖和功能，缺乏 LRP5 的小鼠表現為低骨量，而成骨細胞過度表達 LRP5 的小鼠表現為骨量增加。
其他重要的信號通路包括的 TGF-β 超家族的兩個關鍵成員 TGF-β 和 BMPs，它們共同參與成骨細胞分化和骨形成[23]。TGF-β 可以維持骨基質細胞形態和促進其生長，及對成骨細胞譜系的定型起重要作用。這是通過選擇性的激活有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPKs）和 Smad2/3 信號途徑實現的。BMP 信號通路的激活也需要 Smad 蛋白家族激活及其后續轉移至核內激活成骨基因轉錄。
3.2 在骨重建中成骨細胞的作用
3.2.1 骨形成 成骨細胞的主要功能是骨形成。因此，成骨細胞在骨架形成起始階段以及在持續的骨生長和骨重建過程中起重要作用。骨形成有兩個不同的機制：膜內成骨和軟骨內成骨。膜內成骨主要形成像顱骨這樣的扁平骨和大部分的鎖骨。由成骨細胞沉積于結締組織預先留有的纖維層上，在此基礎上逐漸形成由 I 型膠原蛋白組成的有機基質，再由磷酸鈣填充入基質形成松質骨。相比之下，軟骨內成骨能形成絕大部分骨。它涉及間質到軟骨雛形的轉化，然后在軟骨被血管侵入、逐步分解的同時，成骨細胞沉積膠原基質并通過釋放包含磷酸鈣的小囊泡調節基質的礦化[24]。礦化發生的確切機制目前尚不清楚，但人們認為堿性磷酸酶的活性在其中起著重要的作用。透明軟骨在骺表面形成關節軟骨，在骨干和骨骺連接處形成生長板，使長骨在生長期間延長長度。
3.2.2 成骨細胞的調節 除了成骨作用，成骨細胞在破骨細胞分化中同樣發揮重要的作用。
成骨細胞通過破骨細胞在重吸收時釋放的骨基質沉積因子調控破骨細胞生成，而分泌型因子則通過細胞間直接相互接觸發揮作用，這與破骨細胞調節成骨細胞的方式相似。成骨細胞能產生 M-CSF，RANKL 和 OPG 等因子。正如上面所討論的，這些因素對于破骨細胞形成和功能至關重要。
RANKL 是破骨細胞分化的主要細胞因子，而 OPG 作為誘餌受體控制 RANKL 激活破骨細胞的數量[25]。除了調節破骨細胞分化之外，成骨細胞通過釋放趨化因子控制破骨細胞前體運動到骨表面。兩種骨的基質衍生趨化因子分別是骨鈣素和 I 型膠原，均由成骨細胞產生，并在骨形成時儲存在基質中。在破骨細胞骨重吸收時這些趨化因子被釋放，從而吸引更多的破骨細胞前體轉移到重建位點繼續重吸收。骨被覆細胞也可能誘導基質釋放趨化因子。單核細胞化學引誘物蛋白（monocyte chemoattractant proteins，MCP-1）是由成骨細胞和募集而來的破骨細胞前體產生。在破骨細胞上 MCP-1 受體的表達是由 RANKL 介導的，表明成骨細胞可以通過調節 RANKL 表達來控制 MCP-1 依賴的破骨細胞前體的募集。
有許多其他因子通過作用于成骨細胞間接調節破骨細胞生成。這樣的可溶性因子包括甲狀旁腺素（parathyroid hormone，PTH）、甲狀旁腺激素相關肽（parathyroid hormone-related protein，PTHrP）、TNF-α，白介素-1 和 1，25-（OH）2 維生素 D3 等。這些因子作用于成骨細胞會增加 RANKL 的表達，從而增加破骨細胞分化。一些因子具有雙重功能并且能夠抑制成骨細胞產生 OPG。成骨細胞能夠通過 PTHrP 旁分泌因子調節分化。PTHrP 是由前破骨細胞產生的，通過存在于成骨細胞上的 PTH1 受體刺激成骨細胞分化和抑制成骨細胞凋亡[26]。因此 PTHrP 在調節破骨細胞生成和成骨細胞分化中具有雙重作用。
4 骨細胞
骨細胞是新生骨基質中的分化晚期成骨細胞。與成骨細胞相比，這些細胞體積更小，并且丟失了許多細胞器。骨細胞在新生骨基質陷窩內駐留較長時間并最終凋亡。骨細胞在空間上是彼此孤立的，但它們延伸出富含微絲骨架的絲狀偽足，將彼此細胞之間以及在骨表面的骨被覆細胞和成骨細胞連接起來。有新證據表明，骨細胞的主要功能與骨結構的確定和維護有關。骨細胞作為機械傳感器能將肌肉骨骼介導的機械輸入轉化為生物輸出[27]。微損傷（是骨基質的小缺陷，被視為骨骼病理條件）已被證明能啟動骨重建。由于 RANKL 生成和破骨細胞的生成增加引起了骨重建水平升高，微損傷附近的骨細胞將會凋亡。最近的一項研究顯示，骨細胞也能表達 RANKL，從而支持破骨細胞生成。在缺乏 RANKL 的小鼠骨細胞中特異地表達骨硬化表型，說明在骨重建時骨細胞可能是 RANKL 的主要來源。而膜結合的或可溶性的 RANKL 與破骨細胞的形成是否有關仍然還未確定。
sclerostin 是骨細胞釋放的成骨抑制劑，被認為是骨骼反應的另一個下游介質，用以應對機械環境。sclerostin 在對機械卸載應答的調節中扮演著重要角色，并且在廢用性骨質流失的患者中它的表達上調。有一種假設是 sclerostin 穿過骨細胞網到達骨表面，抑制成骨細胞上的 Wnt/β-catenin 途徑從而抑制細胞增殖，削弱礦化作用和增強細胞凋亡。除了作用于成骨細胞以外，最近的一項研究表明，sclerostin 還可以通過 RANKL 依賴的方式促進破骨細胞形成和活動[28]。因此，骨細胞產生的 sclerostin 可以調節破骨細胞和成骨細胞。
5 骨被覆細胞
一部分成骨細胞將分化為骨被覆細胞，這些細胞大多數排列在骨表面。有理論提出，骨被覆細胞通過抑制破骨細胞前體與骨表面的不恰當作用在骨重建中發揮作用。人們認為啟動破骨細胞形成的信號能通過激活膠原酶來刺激骨被覆細胞為骨吸收做準備。活化的膠原酶能消化非礦化骨的薄層，暴露底下的礦化基質，然后骨被覆細胞遷移至重建區域形成頂峰，在骨重建中創建一個良好的微環境。
在破骨細胞形成和活動啟動之后，成骨細胞在骨重建位置上形成并產生新的骨質。此時，活化的成骨細胞上細胞相關 RANKL 如何直接介導破骨細胞形成和功能產生仍是一個有爭議的話題。有證據指出當填滿重建隔間時，骨被覆細胞已被證實能夠表達 RANKL 和其他成骨細胞的標記，并與破骨細胞前體的 RANKL 和 RANK 受體之間的細胞間作用有關。這種觀點也適用于許多其他直接作用于細胞間的耦合因子。但在體內骨髓腔內可能的物理作用和激活骨重建所需要的因子濃度等問題目前尚不清楚。
6 骨巨噬細胞
骨巨噬細胞是骨膜和骨內膜的表面巨噬細胞。它們位于骨表面的骨細胞、破骨細胞、成骨細胞這三種細胞中間，并與骨被覆細胞相互作用。在成骨過程中，骨巨噬細胞在成熟成骨細胞上形成頂篷樣結構，通過體內試驗顯示，骨巨噬細胞數量的消耗將導致成骨細胞礦化減少，證明了骨巨噬細胞能調節成骨細胞礦化。這表明骨巨噬細胞的數量在調節骨內穩態中發揮重要的作用。
骨巨噬細胞與成骨細胞在骨組織中的位置距離很近并且能調節成骨細胞礦化，因此有人提出在骨重建過程中，與破骨細胞為成骨細胞提供耦合信號類似，骨巨噬細胞同樣能為成骨細胞提供一個耦合信號。比如，骨巨噬細胞表達的 TGF-β 和 EphrinB2 是潛在的耦合信號，它們參與了破骨細胞調節的骨形成。最近的一項研究表明，在脛骨損傷愈合模型中骨巨噬細胞能提高膜內成骨[29]。因為膜內成骨并不涉及軟骨或骨形成前的骨模板的重吸收，所以提出骨巨噬細胞可以作為合成代謝因子的細胞來源。而這些因子在這一過程中調節成骨細胞募集、成熟和骨形成。
7 血管內皮細胞
毛細血管作為 BMU 中至關重要但卻常被忽略的部分，能為骨組織供應氧氣和營養物質，并代謝鈣和再吸收廢物。骨組織是一種高度血管化的組織，血管生成在骨質形成、改造和修復過程中扮演著關鍵的角色[30]。骨骼的血液供應是維持骨密度和骨結構不可或缺的。病理情況下的骨血供的缺乏將導致骨死亡，如缺血性壞死。骨血供缺乏與骨形成、骨質的減少相關，抑制骨血流量將會抑制骨折模型中的骨修復和增加骨不愈合的風險[31]。
骨重建發生在特殊的血管結構上。毛細血管能調節鈣平衡，并提供骨重建過程的反饋調節信號的傳遞。氧氣作為通過血管系統轉運到 BMU 最重要的營養物質，是許多細胞過程的基礎，特別在能量的產生方面。另外，氧氣在骨重建中還扮演其他特殊的角色。其中生產膠原蛋白最主要的酶（脯氨酰-4-羥化酶）就需要分子氧。在缺乏氧氣的情況下，成骨細胞不能有效地產生膠原蛋白，并且其自身的細胞增殖能力會下降。細胞對氧含量變化的反應主要通過低氧誘導因子（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）的活化來反映。HIF-1 能夠激活基因轉錄來應對低氧狀態，其中特異沉默 HIF-1α 和 HIF-2α 基因的成骨細胞顯示：在骨重建和骨血管化形成過程中，HIF-1 對低氧條件起著重要的調控作用[31]。此外，低氧環境促進破骨細胞 HIF-1α 穩定表達并增加破骨細胞數量。HIF-1 最近被確認為是成骨細胞對機械載荷應答的復性調控因子。綜上所述，血管內皮細胞和血管為 BMU 提供營養，對骨重建起直接作用。
8 T 淋巴細胞和 B 淋巴細胞
自 1970 年代初以來，免疫系統和骨骼系統之間的關系就被重點研究，并且用骨免疫學這個詞來描述這兩個領域的重疊。鑒于免疫細胞和造血功能相關細胞都源于骨髓，這兩個系統之間的交叉也就不奇怪了。許多免疫細胞分泌的因子，如T淋巴細胞分泌的 RANKL 能夠激活破骨細胞，但在維護正常的骨生理中免疫細胞的作用尚不清楚。人們認為 T 淋巴細胞可能對骨代謝有保護作用，因為體外研究表明 CD8+T 細胞抑制破骨細胞生成。在存在 1，25-（OH）2 維生素 D3 情況下飼養 CD4+ 和 CD8+ 缺陷的裸鼠，發現其破骨細胞生成增強，表明 T 淋巴細胞抑制破骨細胞的形成。B 淋巴細胞和 T 淋巴細胞缺陷裸鼠的研究中表明這些淋巴細胞在骨內穩態和骨重建中起重要作用。B 淋巴細胞缺陷裸鼠將導致 OPG 缺乏，骨吸收增加導致骨量減少[32]。T 淋巴細胞缺陷裸鼠因為骨重吸收的增加也顯示出一個基礎骨量減少的表型。在裸鼠脊髓中，B 淋巴細胞分泌的 OPG 減少表明 T 淋巴細胞的缺陷影響 B 淋巴細胞分泌 OPG[33]。因此在骨生理平衡時，T 淋巴細胞起到一個保護作用。雖然淋巴細胞并沒有直接在腔體中參與骨重建，但是通過在骨微環境中分泌因子，從而在骨內穩態中發揮重要作用。
自身免疫性疾病如類風濕性關節炎（rheuma-toid arthritis，RA）往往存在廣泛的骨破壞現象，因此免疫系統在骨病理性條件下的作用已經被更全面地研究。早期研究發現破骨細胞樣巨細胞位于滑膜和骨骼的接觸表面，這表明破骨細胞負責骨破壞。進一步的研究發現了滑液中破骨細胞前體和破骨細胞生成的支持細胞，證明了破骨細胞存在于 RA 關節中。RANKL 也同樣在 RA 患者滑膜中的 T 淋巴細胞和滑膜細胞高表達。其他炎癥細胞因子如：IL-1、IL-16 和 TNF 出現在滑膜中介導 RANKL 的表達。目前熱門的課題是研究參與增強破骨細胞生成的 T 淋巴細胞類型。輔助性 T 淋巴細胞（T helper cells，TH）中的 TH17 被認為是增強破骨細胞生成的 T 細胞亞型。破骨細胞生成 T 淋巴細胞的主要特點是產生 IL-17，表達 RANKL 和引發炎癥，但不產生過量的干擾素 γ[34]。因為這些 T 淋巴細胞在共培養中不能介導破骨細胞生成，所以它們在 RA 中不能單獨起破骨細胞生成的作用。進一步了解淋巴細胞在骨生物學中的作用以及這些分子在骨免疫系統中的作用將對骨疾病的靶向治療起重要作用。
9 總結
骨重建過程是由無數細胞緊密協調的。而成骨細胞和破骨細胞之間的相互作用是其中不可或缺的部分，BMU 中其他細胞包括骨細胞、骨被覆細胞、骨巨噬細胞和血管內皮細胞也發揮著重要的作用。這些細胞活動的失衡往往導致骨質疏松、骨硬化病或骨骼生長畸形等骨疾病。另一方面，骨重建微環境的條件十分重要，其中的調控機制失衡可以導致很高的骨相關疾病發病率和死亡率。對骨重建過程和相關基因的更好理解有助于這些骨疾病治療方案的選擇。雖然骨重建的協調與骨的多細胞信號通路有關，但是目前對其中最為關鍵的骨耦合因子的認識是十分有限的。因此，在骨生物學中破譯骨重建的分子基礎是非常有意義的。
引言
骨組織是一種兼具穩態和動態平衡特點的結締組織。在生物化學方面，它被定義為無機元素和有機基質的混合物。為了保持其結構的完整性，維持體內礦物質平衡，骨組織不斷地進行塑造、成形和修復這一系列的重建過程。在成年后，骨重建主要是調節骨結構和功能的動態過程。骨重建是一個涉及破骨細胞和成骨細胞這兩類關鍵細胞相互轉化的復雜、嚴格的調控過程[1]。破骨細胞是主管骨吸收功能的細胞，在骨骼的形成和骨密度的調節中發揮了重要作用。成骨細胞是特殊的骨形成細胞，能合成骨基質，調節礦化并最終分化為骨細胞或骨被覆細胞。機體內眾多局部和系統的因子高度調控著破骨細胞和成骨細胞之間的相互作用，以維持骨內平衡[2]。骨重建過程中的平衡無論是偏向成骨細胞還是破骨細胞，都可能引起如：骨量減少、骨質疏松和骨硬化病等臨床疾病。骨重建的確切機制現在還不是很清楚。因此，本文主要闡述與進一步探討參與骨重建的細胞、其內在分子機制，以了解骨重建過程和相關基因，有助于對骨質疏松等骨科疾病的藥物開發奠定基礎。
1 骨重建單位
近期相關研究表明，識別和利用骨重建中分泌的“偶聯因子（coupling factors）”可以調控基礎多細胞單位（basic multicellular unit，BMU）內相關細胞的暫時性激活和功能，有效縮短骨重建的周期。本文則著重強調 BMU 中的細胞作用，以及在細胞水平參與調節骨重建的細胞和因子之間的相互作用。
骨重建是通過功能相同的細胞——BMU 感受力學刺激來對骨的生長或吸收進行調控的過程。BMU 包括破骨細胞、成骨細胞、骨細胞、骨被覆細胞和血管內皮細胞。
骨重建過程是一個多種細胞參與的過程，信號傳導和細胞間交流在這個過程中起著重要作用。細胞因子（cytokine）是一類由各種免疫細胞和非免疫細胞產生的具有生物活性的小分子糖蛋白，負責參與介導細胞間的相互作用。細胞因子包括趨化因子、干擾素、白細胞介素、腫瘤壞死因子和淋巴因子等，每一種細胞因子作用于特定的靶細胞，產生不同或相同的生物學效應[2]。如圖 1 所示，在骨重建過程中，涉及到多種細胞因子的參與和相互作用，而骨細胞、破骨細胞、成骨細胞三者之間的關系最為重要。這些細胞因子中，硬骨素（sclerostin）是硬化性骨化病（sclerosteosis）基因所表達的一種蛋白質產物。近年來，研究者發現，sclerostin 能調節骨細胞分化成為成骨細胞[3-4]。而核因子 κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL）能在成骨細胞、T 淋巴細胞和內皮細胞內翻譯表達，參與破骨細胞的形成，并與破骨細胞及其前體上的核因子 κB 受體活化因子受體（receptor activator of nuclear factor kappa-B，RANK）連接并發揮重要作用[5]。紅細胞生成素誘導的肝細胞受體（Erythropoietin-producing hepato-cellular，Eph）及其配體（Ephrin）是酪氨酸激酶受體家族成員之一，破骨細胞與成骨細胞之間的 Eph-Ephrin 雙向信號系統在骨重建中發揮重要作用。它們之間的聯系體現為：破骨細胞上存在 EphrinB2 配體，成骨細胞前體上存在 EphB4 受體，兩者通過細胞直接接觸，在成骨細胞內產生正向信號的同時，在破骨細胞內產生反向信號，從而起到調節成骨細胞與破骨細胞之間相互平衡的作用[6]。另外，骨組織周圍毛細血管可為骨組織提供氧氣、營養素和激素等，如圖 1 紅色箭頭所示，并且其中的 T 淋巴細胞活化會產生 RNAKL、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor α，TNF-α）等破骨細胞生成因子，參與調節骨重建，如圖 1 綠色箭頭所示。
圖1
骨重建的基礎多細胞單位
Figure1.
BMU of bone remodeling
骨重建周期包括啟動階段、逆轉階段和終止階段。開始的啟動階段，包括破骨細胞前體的募集、分化和成熟以及骨吸收的活化和維持。之后會出現一個逆轉階段，即破骨性骨修復被抑制和破骨細胞凋亡，而成骨細胞開始歸巢和分化。逆轉階段是破骨細胞激活到成骨細胞激活的過渡。最后階段，也叫終止階段，是成骨細胞介導的骨形成過程[7]。這一階段持續時間最長，因為骨形成比骨吸收慢，其中涉及新骨的形成、礦化以及成骨細胞的晚期分化。骨重建過程的時間會因在機體內發生的位置不同而有所不同，例如松質骨的骨重建周期平均約 200 d，其中終止階段占據整個周期的 3/4 時間，而皮質骨的重建周期相較松質骨短的原因就在于其終止階段的持續時間較短。
2 破骨細胞
破骨細胞是一類多核巨細胞，是由單核細胞、巨噬細胞家族的單核祖細胞融合而成，這一融合過程被稱作破骨細胞的形成[2]。破骨細胞一般位于骨內膜表面哈弗斯管內和骨外膜表面的骨膜下，在骨組織中數量通常極少，只有 2～3 個/μm3。破骨細胞有運動期和重吸收期兩種功能狀態，并且在不同的分期呈現出不同的細胞形態。運動期的破骨細胞是扁平的無極化細胞，重吸收期的破骨細胞則呈圓頂狀并且伸出板狀偽足。這些具有被稱為板狀偽足的毛樣突起和包含肌動蛋白的偽足小體復合物的破骨細胞，通過板狀偽足來進行移動和擴散。在到達重吸收位置后，破骨細胞通過細胞骨架重組極化，最后導致皺褶緣、封閉區域、功能分泌域和基底側膜等一系列膜域的形成。其中封閉區域是破骨細胞的一種特殊結構，其將酸性再吸收的環境與細胞的其他區域分開，形成一個器官免干擾區域[8]，而褶皺緣和封閉區域只在非運動的重吸收期的破骨細胞中被發現。
2.1 在 BMU 中破骨細胞分化的調節
破骨細胞的分化和融合需要大量破骨細胞生成因子并經多步驟調節。造血干細胞是一組骨髓單核細胞，能夠生成破骨細胞前體。這些細胞的進一步分化需要骨基質細胞、成骨細胞或 T 淋巴細胞產生的因子共同作用[9]。巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating fact，M-CSF）和 RANKL 這兩個因子是促進破骨細胞生成所必要的。
M-CSF 是由成骨細胞和干細胞產生的，在巨噬細胞成熟、與破骨細胞前體細胞上的跨膜糖蛋白受體酪氨酸激酶受體（transmembrane glycoprotein-receptor tyrosine kinase，c-Fms）結合并在促進其生存和增殖中起重要作用。通過 c-Fms 受體介導的信號轉導包括細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）和磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）等多重途徑。M-CSF 能在早期激活骨肉瘤致癌基因轉錄因子（c-Fos）和造血轉錄因子（PU.1）。缺少 M-CSF 或 PU.1 的小鼠會缺乏破骨細胞和巨噬細胞，與此同時滅活 c-Fos 將阻止破骨細胞生成并導致骨硬化表型的表達[10]。有趣的是，骨硬化（基因型為 op/op）小鼠的突變導致 M-CSF 缺乏，最后卻能恢復破骨細胞分化的功能。這提示我們可能還有其他因素能夠代償 M-CSF 缺乏。
RANKL 可由成骨細胞、T 淋巴細胞和內皮細胞表達，在破骨細胞的形成和連接破骨細胞及其前體上的 RANK 受體時發揮重要作用[11]。通過 RANKL 刺激表達 M-CSF 的前體細胞，使其分化為破骨細胞表型，這些細胞之后將會表達一些破骨細胞關鍵標記物，如抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）。在 M-CSF 和 RANKL 進一步地刺激下，破骨細胞前體融合形成多核細胞并開始表達更多像降血鈣素受體和組織蛋白酶 K 這樣的特殊破骨細胞標記。RANKL 和 RANK 的連接依賴于這兩個分子間的聚合作用，RANKL 的激活作用可以被可溶性誘導的骨保護蛋白（osteoprote-gerin，OPG）受體所抵消[12]。這個受體能阻止 RANKL 和 RANK 的結合，并抑制破骨細胞的分化。RANKL 的信號傳遞取決于 RANK/OPG 和 RANK 在破骨細胞前體中的表達量。因此通過生成 RANKL 和 OPG，成骨細胞能夠控制骨生成和骨重吸收。
除此之外，還有一些與破骨細胞相關的重要調節因子，例如其中的核轉錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB），作為一個轉錄因子蛋白家族，包括 5 個亞單位：Rel（cRel）、p65（RelA，NF-κB3）、RelB、p50（NF-κB1）、p52（NF-κB2），其中以 p65 和 p50 組成的二聚體形式最為常見。NF-κB 參與多種基因的轉錄調控，與許多重要的病理生理過程密切相關。位點特異的 NF-κB 抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）的磷酸化對于激活 NF-κB 有重要意義。IκB 激酶（IκB kinase，IKK）能磷酸化 IκB，為進一步了解 NF-κB 在骨重建分子水平的功能和調控提供了線索。其由兩個催化亞基 α、β 和一個調節亞基 γ 組成，其中 β 亞基可能通過降解 IκB 來介導 NF-κB 的活化。IKKα 參與 NF-κB 前體的轉化和 p65 的磷酸化。
在靜息狀態下，NF-κB 與其抑制蛋白 IκB 結合，駐留在胞漿內。在 RANK 與 RANKL 結合后激活，其胞漿部分與泛素連接酶（TNFR-associated activalor factors 6，TRAF6）結合，啟動細胞內的信號級聯反應。TRAF6 能激活 IKK，活化的 IKK 再催化 IκB 磷酸化，并使其被蛋白酶體降解，釋放出 NF-κB。游離的 NF-κB 的 p50、p65 二聚體由胞漿轉移至細胞核中與脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）特異區域結合，啟動破骨細胞特異性基因的轉錄。在破骨細胞中 NF-κB 信號轉導通路的異常激活將破壞骨重建，并導致溶骨性疾病發生[13]，如圖 2 所示。
圖2
破骨細胞內 RANKL 信號通路
Figure2.
RANK/RANKL signalling pathway in osteoclasts
雖然 RANKL 已經被證實是破骨細胞分化的重要信號，但是協同刺激途徑也是不可或缺的。活化 T 細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）也在破骨細胞分化中起重要作用[14]。RANKL 通過促進鈣振蕩來激活 NFAT。這一過程是通過免疫球蛋白樣受體的協同刺激和承接分子的作用實現的。免疫球蛋白樣受體包括破骨細胞相關的受體（osteoclast associated receptor，OSCAR）和髓細胞觸發表達受體（triggering receptor expressed myeloi-dcells，TREM），承接分子則包含免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM motifs）。這一信號級聯反應激活磷脂酶 Cγ（phospholipase Cγ，PLCγ）和下游的鈣離子，介導活化 T 細胞核因子胞 1 蛋白（nuclear factor of activated T-cells，cytoplasmic 1，NFATc1）在細胞核內的轉移、翻譯及自我擴增。除此之外，鈣調蛋白激酶（calcium/calmodulin-dependent protein，CaMK），作為下游鈣離子的主要調節介質，在 RANKL 介導的破骨細胞分化和骨再吸收中起重要作用[15]。
2.2 破骨細胞在骨重建中的作用
雖然破骨細胞在骨重建里的基礎功能是骨的重吸收，但同時也有調節骨形成的功能。在破骨細胞重吸收并與成骨細胞相接觸時，破骨細胞通過分泌因子來調節骨形成和基質衍生因子的釋放。
破骨細胞的骨重吸收功能是調節骨形成的一種方式。吸收池本身的分布是介導骨形成的一個重要因素。在缺乏破骨細胞時，成骨細胞可能識別部分吸收陷窩，如 TRAP 沉積。TRAP 沉積能被破骨細胞再吸收，以及進行膠原轉換[16]。成骨細胞表達的 RANKL 不僅能直接激活破骨細胞的骨重吸收作用，也能作用于成骨細胞的骨形成。
破骨細胞在骨重吸收時，能夠釋放調節成骨細胞骨形成的骨基質衍生因子。在骨基質沉積和作用于成骨細胞時，成骨細胞釋放這些因子來促進骨形成；然而也可能是破骨細胞在吸收骨基質時，加工骨基質衍生因子并調節其釋放來作用于成骨細胞[17]。這些因子包括骨形成蛋白（bone morphoge-netic proteins，BMPs），胰島素樣生長因子（insulin like growth factor system，IGFs）：IGFs I 和 IGFs II，以及轉換生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）。
然而，在有骨硬化病的患者和小鼠中，破骨細胞的重吸收作用并不是成骨細胞骨形成的必要條件。因為在具有較多破骨細胞的骨硬化病情況下，雖然破骨細胞功能受損，但是仍然有大量的有功能的成骨細胞，這不僅表明破骨細胞數量在骨形成中比它的功能活性更重要，也表明破骨細胞并不是骨形成的必須條件[18]。
破骨細胞調節成骨細胞的可能方式一直是一個令人感興趣的課題，并且已經有大量的研究工作來識別這一對耦合因素表達的潛在靶點。鞘氨醇磷酸酯（sphingosine-1-phosphate，S1P）是由破骨細胞分泌的，它通過與成骨細胞上的受體結合可增強成骨細胞的遷移和生存，并上調 RANKL 生成。S1P 也能通過調節破骨細胞前體的遷移來直接作用于破骨細胞[19]。肝配蛋白 B2 作為破骨細胞表達的膜結合配體，通過接觸依賴的機制結合破骨細胞上的受體 EphB4，兩者相互作用促進成骨細胞分化和骨形成。肝配蛋白和 Eph 的相互作用可以產生雙向信號傳導，由此提示 EphB4 作用于破骨細胞并抑制分化。
成熟破骨細胞能表達 EphrinB2，而成骨細胞前體表達 EphB4，于是我們推測在骨重建中 EphrinB2 和 EphB4 的相互作用可能調節骨吸收和骨形成之間的轉化。最近，由破骨細胞表達的腦信號蛋白 4D 已被確定為一個偶聯因子，它通過結合破骨細胞上的 Plexin-B1 受體，激活 RhoA 蛋白從而抑制骨的形成[20]。
3 成骨細胞
成骨細胞是唯一負責骨形成的細胞。它來源于具有分化為成熟成骨細胞潛能的間充質干細胞。成骨細胞分化分成四個階段：前成骨細胞、成骨細胞、骨細胞和骨被覆細胞。當提供適當的刺激時，間充質干細胞能夠分化為前成骨細胞。這些細胞在組織學上類似成骨細胞，并且在堿性磷酸酶染色中呈陽性；然而它們缺乏一些成熟的成骨細胞的特點，包括產生礦化組織的能力[21]。當前成骨細胞形成成熟的成骨細胞時，呈現出立方形的形態和堿性磷酸酶強陽性。在骨形成活躍的位置，它們定植在骨表面。成骨細胞分泌 I 型膠原蛋白作為骨的基本構成材料。此外，它們生產非膠原蛋白，包括骨鈣素（一種骨中特有的維生素k依賴鈣結合小蛋白）和堿性磷酸酶來作用于礦物沉積。若敲除小鼠的堿性磷酸酶基因，小鼠生長受到抑制并在 3 周內死亡，組織檢測顯示小鼠礦化作用缺失，成骨細胞形態異常。這些研究可能表明堿性磷酸酶對成骨細胞的功能具有重要作用。
3.1 在 BMU 中成骨細胞的調節
成骨細胞中調節骨形成的一個最重要的信號通路是 Wnt/β-catenin 信號通路[2]。Wnt 配體與跨膜受體卷曲蛋白 frizzled 和低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）受體相關蛋白 5 或 6（LDL receptor related protein 5/6，LRP5/6）組成的受體復合物結合。在沒有配體結合時，糖原合酶激酶-3（glycogen synthase kinase 3，GSK-3）、結腸腺瘤樣息肉（adenomatous polyposis coli，APC）蛋白和支架蛋白 Axin 復合體使 β-鏈蛋白（β-catenin）磷酸化，繼而導致其泛素化并在蛋白酶體中降解。當 Wnt 與其受體復合物結合時將激活蓬亂蛋白（dishevelled，DVL），并抑制 GSK-3 活性。這樣 β-catenin 就不會被降解，從而轉移到核內激活淋巴樣增強因子（1ymphoid enhancer factor，LEF）和 T 細胞因子（T cell factor，TCF），介導與成骨細胞分化、作用、生存有關的目的基因轉錄，如圖 3 所示。
圖3
成骨細胞中 Wnt/β-catenin 信號通路
Figure3.
Canonical Wnt/β-catenin signalling pathway in osteoblasts
Wnt/β-catenin 途徑的各種生理抑制劑的主要功能是阻止配體和受體復合物的形成。它們包括能與 LRP5/6 結合的 sclerostin 和 Dickoff-1（Dkk-1），和與 Wnt 結合的分泌型 frizzled 相關蛋白（Sfrp）。Wnt/β-catenin 通路在骨生物學中的重要性，在人類 LRP5 基因的突變中被突顯出來。LRP5 突變引起的功能損失將導致骨質疏松癥和假神經膠質瘤綜合癥，這是一種以早期出現骨質疏松癥和失明為特點的常染色體隱性疾病[22]。相反，突變引起的功能升高與高骨量相關。這些人類表型已經被復制到小鼠身上，由于改變成骨細胞增殖和功能，缺乏 LRP5 的小鼠表現為低骨量，而成骨細胞過度表達 LRP5 的小鼠表現為骨量增加。
其他重要的信號通路包括的 TGF-β 超家族的兩個關鍵成員 TGF-β 和 BMPs，它們共同參與成骨細胞分化和骨形成[23]。TGF-β 可以維持骨基質細胞形態和促進其生長，及對成骨細胞譜系的定型起重要作用。這是通過選擇性的激活有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPKs）和 Smad2/3 信號途徑實現的。BMP 信號通路的激活也需要 Smad 蛋白家族激活及其后續轉移至核內激活成骨基因轉錄。
3.2 在骨重建中成骨細胞的作用
3.2.1 骨形成 成骨細胞的主要功能是骨形成。因此，成骨細胞在骨架形成起始階段以及在持續的骨生長和骨重建過程中起重要作用。骨形成有兩個不同的機制：膜內成骨和軟骨內成骨。膜內成骨主要形成像顱骨這樣的扁平骨和大部分的鎖骨。由成骨細胞沉積于結締組織預先留有的纖維層上，在此基礎上逐漸形成由 I 型膠原蛋白組成的有機基質，再由磷酸鈣填充入基質形成松質骨。相比之下，軟骨內成骨能形成絕大部分骨。它涉及間質到軟骨雛形的轉化，然后在軟骨被血管侵入、逐步分解的同時，成骨細胞沉積膠原基質并通過釋放包含磷酸鈣的小囊泡調節基質的礦化[24]。礦化發生的確切機制目前尚不清楚，但人們認為堿性磷酸酶的活性在其中起著重要的作用。透明軟骨在骺表面形成關節軟骨，在骨干和骨骺連接處形成生長板，使長骨在生長期間延長長度。
3.2.2 成骨細胞的調節 除了成骨作用，成骨細胞在破骨細胞分化中同樣發揮重要的作用。
成骨細胞通過破骨細胞在重吸收時釋放的骨基質沉積因子調控破骨細胞生成，而分泌型因子則通過細胞間直接相互接觸發揮作用，這與破骨細胞調節成骨細胞的方式相似。成骨細胞能產生 M-CSF，RANKL 和 OPG 等因子。正如上面所討論的，這些因素對于破骨細胞形成和功能至關重要。
RANKL 是破骨細胞分化的主要細胞因子，而 OPG 作為誘餌受體控制 RANKL 激活破骨細胞的數量[25]。除了調節破骨細胞分化之外，成骨細胞通過釋放趨化因子控制破骨細胞前體運動到骨表面。兩種骨的基質衍生趨化因子分別是骨鈣素和 I 型膠原，均由成骨細胞產生，并在骨形成時儲存在基質中。在破骨細胞骨重吸收時這些趨化因子被釋放，從而吸引更多的破骨細胞前體轉移到重建位點繼續重吸收。骨被覆細胞也可能誘導基質釋放趨化因子。單核細胞化學引誘物蛋白（monocyte chemoattractant proteins，MCP-1）是由成骨細胞和募集而來的破骨細胞前體產生。在破骨細胞上 MCP-1 受體的表達是由 RANKL 介導的，表明成骨細胞可以通過調節 RANKL 表達來控制 MCP-1 依賴的破骨細胞前體的募集。
有許多其他因子通過作用于成骨細胞間接調節破骨細胞生成。這樣的可溶性因子包括甲狀旁腺素（parathyroid hormone，PTH）、甲狀旁腺激素相關肽（parathyroid hormone-related protein，PTHrP）、TNF-α，白介素-1 和 1，25-（OH）2 維生素 D3 等。這些因子作用于成骨細胞會增加 RANKL 的表達，從而增加破骨細胞分化。一些因子具有雙重功能并且能夠抑制成骨細胞產生 OPG。成骨細胞能夠通過 PTHrP 旁分泌因子調節分化。PTHrP 是由前破骨細胞產生的，通過存在于成骨細胞上的 PTH1 受體刺激成骨細胞分化和抑制成骨細胞凋亡[26]。因此 PTHrP 在調節破骨細胞生成和成骨細胞分化中具有雙重作用。
4 骨細胞
骨細胞是新生骨基質中的分化晚期成骨細胞。與成骨細胞相比，這些細胞體積更小，并且丟失了許多細胞器。骨細胞在新生骨基質陷窩內駐留較長時間并最終凋亡。骨細胞在空間上是彼此孤立的，但它們延伸出富含微絲骨架的絲狀偽足，將彼此細胞之間以及在骨表面的骨被覆細胞和成骨細胞連接起來。有新證據表明，骨細胞的主要功能與骨結構的確定和維護有關。骨細胞作為機械傳感器能將肌肉骨骼介導的機械輸入轉化為生物輸出[27]。微損傷（是骨基質的小缺陷，被視為骨骼病理條件）已被證明能啟動骨重建。由于 RANKL 生成和破骨細胞的生成增加引起了骨重建水平升高，微損傷附近的骨細胞將會凋亡。最近的一項研究顯示，骨細胞也能表達 RANKL，從而支持破骨細胞生成。在缺乏 RANKL 的小鼠骨細胞中特異地表達骨硬化表型，說明在骨重建時骨細胞可能是 RANKL 的主要來源。而膜結合的或可溶性的 RANKL 與破骨細胞的形成是否有關仍然還未確定。
sclerostin 是骨細胞釋放的成骨抑制劑，被認為是骨骼反應的另一個下游介質，用以應對機械環境。sclerostin 在對機械卸載應答的調節中扮演著重要角色，并且在廢用性骨質流失的患者中它的表達上調。有一種假設是 sclerostin 穿過骨細胞網到達骨表面，抑制成骨細胞上的 Wnt/β-catenin 途徑從而抑制細胞增殖，削弱礦化作用和增強細胞凋亡。除了作用于成骨細胞以外，最近的一項研究表明，sclerostin 還可以通過 RANKL 依賴的方式促進破骨細胞形成和活動[28]。因此，骨細胞產生的 sclerostin 可以調節破骨細胞和成骨細胞。
5 骨被覆細胞
一部分成骨細胞將分化為骨被覆細胞，這些細胞大多數排列在骨表面。有理論提出，骨被覆細胞通過抑制破骨細胞前體與骨表面的不恰當作用在骨重建中發揮作用。人們認為啟動破骨細胞形成的信號能通過激活膠原酶來刺激骨被覆細胞為骨吸收做準備。活化的膠原酶能消化非礦化骨的薄層，暴露底下的礦化基質，然后骨被覆細胞遷移至重建區域形成頂峰，在骨重建中創建一個良好的微環境。
在破骨細胞形成和活動啟動之后，成骨細胞在骨重建位置上形成并產生新的骨質。此時，活化的成骨細胞上細胞相關 RANKL 如何直接介導破骨細胞形成和功能產生仍是一個有爭議的話題。有證據指出當填滿重建隔間時，骨被覆細胞已被證實能夠表達 RANKL 和其他成骨細胞的標記，并與破骨細胞前體的 RANKL 和 RANK 受體之間的細胞間作用有關。這種觀點也適用于許多其他直接作用于細胞間的耦合因子。但在體內骨髓腔內可能的物理作用和激活骨重建所需要的因子濃度等問題目前尚不清楚。
6 骨巨噬細胞
骨巨噬細胞是骨膜和骨內膜的表面巨噬細胞。它們位于骨表面的骨細胞、破骨細胞、成骨細胞這三種細胞中間，并與骨被覆細胞相互作用。在成骨過程中，骨巨噬細胞在成熟成骨細胞上形成頂篷樣結構，通過體內試驗顯示，骨巨噬細胞數量的消耗將導致成骨細胞礦化減少，證明了骨巨噬細胞能調節成骨細胞礦化。這表明骨巨噬細胞的數量在調節骨內穩態中發揮重要的作用。
骨巨噬細胞與成骨細胞在骨組織中的位置距離很近并且能調節成骨細胞礦化，因此有人提出在骨重建過程中，與破骨細胞為成骨細胞提供耦合信號類似，骨巨噬細胞同樣能為成骨細胞提供一個耦合信號。比如，骨巨噬細胞表達的 TGF-β 和 EphrinB2 是潛在的耦合信號，它們參與了破骨細胞調節的骨形成。最近的一項研究表明，在脛骨損傷愈合模型中骨巨噬細胞能提高膜內成骨[29]。因為膜內成骨并不涉及軟骨或骨形成前的骨模板的重吸收，所以提出骨巨噬細胞可以作為合成代謝因子的細胞來源。而這些因子在這一過程中調節成骨細胞募集、成熟和骨形成。
7 血管內皮細胞
毛細血管作為 BMU 中至關重要但卻常被忽略的部分，能為骨組織供應氧氣和營養物質，并代謝鈣和再吸收廢物。骨組織是一種高度血管化的組織，血管生成在骨質形成、改造和修復過程中扮演著關鍵的角色[30]。骨骼的血液供應是維持骨密度和骨結構不可或缺的。病理情況下的骨血供的缺乏將導致骨死亡，如缺血性壞死。骨血供缺乏與骨形成、骨質的減少相關，抑制骨血流量將會抑制骨折模型中的骨修復和增加骨不愈合的風險[31]。
骨重建發生在特殊的血管結構上。毛細血管能調節鈣平衡，并提供骨重建過程的反饋調節信號的傳遞。氧氣作為通過血管系統轉運到 BMU 最重要的營養物質，是許多細胞過程的基礎，特別在能量的產生方面。另外，氧氣在骨重建中還扮演其他特殊的角色。其中生產膠原蛋白最主要的酶（脯氨酰-4-羥化酶）就需要分子氧。在缺乏氧氣的情況下，成骨細胞不能有效地產生膠原蛋白，并且其自身的細胞增殖能力會下降。細胞對氧含量變化的反應主要通過低氧誘導因子（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）的活化來反映。HIF-1 能夠激活基因轉錄來應對低氧狀態，其中特異沉默 HIF-1α 和 HIF-2α 基因的成骨細胞顯示：在骨重建和骨血管化形成過程中，HIF-1 對低氧條件起著重要的調控作用[31]。此外，低氧環境促進破骨細胞 HIF-1α 穩定表達并增加破骨細胞數量。HIF-1 最近被確認為是成骨細胞對機械載荷應答的復性調控因子。綜上所述，血管內皮細胞和血管為 BMU 提供營養，對骨重建起直接作用。
8 T 淋巴細胞和 B 淋巴細胞
自 1970 年代初以來，免疫系統和骨骼系統之間的關系就被重點研究，并且用骨免疫學這個詞來描述這兩個領域的重疊。鑒于免疫細胞和造血功能相關細胞都源于骨髓，這兩個系統之間的交叉也就不奇怪了。許多免疫細胞分泌的因子，如T淋巴細胞分泌的 RANKL 能夠激活破骨細胞，但在維護正常的骨生理中免疫細胞的作用尚不清楚。人們認為 T 淋巴細胞可能對骨代謝有保護作用，因為體外研究表明 CD8+T 細胞抑制破骨細胞生成。在存在 1，25-（OH）2 維生素 D3 情況下飼養 CD4+ 和 CD8+ 缺陷的裸鼠，發現其破骨細胞生成增強，表明 T 淋巴細胞抑制破骨細胞的形成。B 淋巴細胞和 T 淋巴細胞缺陷裸鼠的研究中表明這些淋巴細胞在骨內穩態和骨重建中起重要作用。B 淋巴細胞缺陷裸鼠將導致 OPG 缺乏，骨吸收增加導致骨量減少[32]。T 淋巴細胞缺陷裸鼠因為骨重吸收的增加也顯示出一個基礎骨量減少的表型。在裸鼠脊髓中，B 淋巴細胞分泌的 OPG 減少表明 T 淋巴細胞的缺陷影響 B 淋巴細胞分泌 OPG[33]。因此在骨生理平衡時，T 淋巴細胞起到一個保護作用。雖然淋巴細胞并沒有直接在腔體中參與骨重建，但是通過在骨微環境中分泌因子，從而在骨內穩態中發揮重要作用。
自身免疫性疾病如類風濕性關節炎（rheuma-toid arthritis，RA）往往存在廣泛的骨破壞現象，因此免疫系統在骨病理性條件下的作用已經被更全面地研究。早期研究發現破骨細胞樣巨細胞位于滑膜和骨骼的接觸表面，這表明破骨細胞負責骨破壞。進一步的研究發現了滑液中破骨細胞前體和破骨細胞生成的支持細胞，證明了破骨細胞存在于 RA 關節中。RANKL 也同樣在 RA 患者滑膜中的 T 淋巴細胞和滑膜細胞高表達。其他炎癥細胞因子如：IL-1、IL-16 和 TNF 出現在滑膜中介導 RANKL 的表達。目前熱門的課題是研究參與增強破骨細胞生成的 T 淋巴細胞類型。輔助性 T 淋巴細胞（T helper cells，TH）中的 TH17 被認為是增強破骨細胞生成的 T 細胞亞型。破骨細胞生成 T 淋巴細胞的主要特點是產生 IL-17，表達 RANKL 和引發炎癥，但不產生過量的干擾素 γ[34]。因為這些 T 淋巴細胞在共培養中不能介導破骨細胞生成，所以它們在 RA 中不能單獨起破骨細胞生成的作用。進一步了解淋巴細胞在骨生物學中的作用以及這些分子在骨免疫系統中的作用將對骨疾病的靶向治療起重要作用。
9 總結
骨重建過程是由無數細胞緊密協調的。而成骨細胞和破骨細胞之間的相互作用是其中不可或缺的部分，BMU 中其他細胞包括骨細胞、骨被覆細胞、骨巨噬細胞和血管內皮細胞也發揮著重要的作用。這些細胞活動的失衡往往導致骨質疏松、骨硬化病或骨骼生長畸形等骨疾病。另一方面，骨重建微環境的條件十分重要，其中的調控機制失衡可以導致很高的骨相關疾病發病率和死亡率。對骨重建過程和相關基因的更好理解有助于這些骨疾病治療方案的選擇。雖然骨重建的協調與骨的多細胞信號通路有關，但是目前對其中最為關鍵的骨耦合因子的認識是十分有限的。因此，在骨生物學中破譯骨重建的分子基礎是非常有意義的。
