本文以絲素蛋白為載體，以萬古霉素（VCM）為藥物模型，采用水-油相溶解擴散方法制備了不同濃度的絲素微球（SFM），并進一步構建了載VCM半水硫酸鈣（CSH）/SFM復合人工骨材料。實驗中用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察材料的表面形態，用傅里葉變換紅外吸收光譜（FTIR）研究材料的構象，用抑菌圈實驗驗證材料的抑菌性能，用紫外/可見分光光度計檢測材料的藥物釋放性能，用萬能試驗機測定樣品的抗壓性能。結果表明，隨著絲素濃度從20、40 mg/mL增加到60 mg/mL，絲素構象及抑菌性沒有顯著改變，而SFM粒徑增加，藥物釋放速率減慢；同時在CSH中復合SFM后，隨著SFM絲素濃度增加，復合人工骨材料藥物釋放速率逐漸減小，壓縮斷裂功逐漸增加。上述結果表明，本研究在一定程度上改進了CSH存在的脆性大、作為藥物載體前期釋放快的缺點，有望在臨床感染性骨缺損的治療中取得更好的應用成效。
引用本文： 劉力明, 連小潔, 劉世超, 吳亞麗, 黃棣, 王曉君, 王秀梅, 崔福齋. 不同濃度載萬古霉素半水硫酸鈣/絲素微球復合人工骨材料的制備及性能研究. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(5): 903-910. doi: 10.7507/1001-5515.20160146 復制
引言
目前由腫瘤切除、感染、創傷以及骨缺陷與衰老引起的骨損傷，仍然是臨床中所面臨的棘手問題[1-3]。自體骨移植是骨缺損治療的金標準[4]，但其來源與功能有限；而異體骨移植存在疾病傳播、免疫排斥反應等缺陷[5]，會對骨缺損治療的預后效果造成不良影響。Augat等[6]使用聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)進行內固定增強，但PMMA不能降解，如進行二次手術將進一步增加患者的痛苦，且有發熱、妨害骨折愈合等缺點[7-8]。
α-半水硫酸鈣(calcium sulfate hemihydrate，CSH)用作骨修復材料已經有很長的歷史[9]，且有著明顯的優勢，如良好的生物相容性、骨傳導性、生物可降解性及易塑性等[10]。但CSH也存在一定缺陷，如脆性大[11]，作為藥物載體材料，前期突釋明顯，導致將其應用于藥物緩釋領域受到限制[12]。
絲素蛋白是從蠶絲中提取的蛋白質，具有良好的生物相容性、生物可降解性和良好的力學性能[13]，可以再生和加工成不同產品，如薄膜、多孔支架等[14]。絲素超微結構能很好地適應人體的肌體組織，被廣泛應用于手術縫合線、人工皮膚、藥物緩釋載體等[15]。以絲素蛋白為原料制備的絲素微球(silk fibroin microspheres，SFM)，具有比表面積大、生物相容性好、可生物降解等優點，正逐漸成為一種重要的藥物載體[16]。
萬古霉素(vancomycin，VCM)是糖肽抗生素，對許多革蘭陽性細菌，如金黃色葡萄球菌，具有很強的殺菌作用，并且已經應用于多個臨床領域[17]。VCM目前被認為是最有效的抗金黃色葡萄球菌感染與治療的藥物[18]。
本文一方面以絲素蛋白為載體，VCM為藥物模型，通過水-油相溶解擴散方法制備不同濃度的SFM，研究了絲素濃度對SFM粒徑、構象以及藥物釋放性能的影響；同時將不同濃度SFM與CSH復合，構建載萬古霉素半水硫酸鈣/絲素微球(CSH/SFM/VCM)復合人工骨材料，檢測其表面形態、抑菌性、藥物釋放性能及力學性能。通過掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)、傅里葉變換紅外吸收光譜(Fourier transform infrared spectroscope，FTIR)、抑菌圈實驗、紫外/可見分光光度計以及萬能試驗機對材料進行表征和測試。本研究將天然高分子絲素引入CSH，改善了單獨CSH材料存在的脆性大、易突釋的問題，制備了具有一定力學性能、可藥物緩釋的復合人工骨材料，為進一步制備理想的抗感染骨修復材料提供了實驗依據，也為今后的臨床應用研究奠定了基礎。
1 材料與方法
1.1 絲素溶液的制備
稱取一定量的蠶絲，洗凈、烘干；然后投入質量分數為0.02%的碳酸鈉溶液中，于100 ℃下脫膠30 min，沖洗以除去絲膠，重復以上操作一次[19]，烘干后即獲得絲素蛋白。按溶液與絲素質量比為10:1配置一定量的氯化鈣-乙醇-水(摩爾比8:2:1)三元溶液。將絲素于80 ℃的三元溶液中攪拌溶解30 min，得到混合溶液[20]，冷卻后，將混合溶液裝入透析袋，在蒸餾水中透析72 h以除去氯化鈣[21]，經過濾獲得絲素溶液。
1.2 空白絲素微球與載藥絲素微球的制備及形貌觀察
空白絲素微球(SFM)制備：100 mL乙酸乙酯與2 mL乳化劑Span 80攪拌混合，常溫下采用注射器將2 mL絲素溶液以0.4 mL/min的速度逐滴滴入攪拌的乙酸乙酯中[22]。攪拌2 h，SFM懸浮于乙酸乙酯中。石油醚、異丙醇洗滌，凍干，收集微球。
對材料進行實驗分組，滴加的絲素濃度分別為20、40、60 mg/mL，調節攪拌機轉速為600~700 r/min。
載萬古霉素/絲素微球(SFM/VCM)制備：按VCM與絲素質量比為1:20的比例，將VCM溶于絲素溶液中，常溫下磁力攪拌30 min，獲得載VCM絲素溶液。其他步驟與SFM制備步驟相同。
采用紅外光譜儀(bruck tensor 27，德國布魯克公司)檢測SFM構象。
1.3 抑菌實驗
分別稱取絲素濃度為20、40、60 mg/mL的SFM/VCM各0.01 g，置于5 mm×5 mm的濾紙上。在濾紙上滴加少量蒸餾水以使微球均勻散開。再將濾紙放置在金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)培養皿中，取空白濾紙作為對照組，培養16 h后，觀察各濾紙上是否有金黃色葡萄球菌抑菌圈出現[18]。
1.4 CSH/SFM/VCM的制備
選用CSH、SFM為固相，二水硫酸鈣(calcium sulphate dihydrate，CSD)為促凝劑，蒸餾水為固化液，加工成兩種規格的試樣。大試樣規格為Φ10 mm×15 mm，進行壓縮實驗與凝固時間的測定；小試樣規格為Φ4 mm×3 mm，進行SEM觀察與藥物釋放實驗。其中，CSH與水反應固化后的終產物為CSD，而作為促凝劑的CSD與CSH和水反應固化后形成的CSD融為一體，所以，作為促凝劑的CSD并不是作為終產物的外相物質[23-24]。將固相與固化液混合，在燒杯中將混合物攪拌成均勻的糊狀，再通過模具成型，得到CSH/SFM/VCM的固化體，如圖 1所示。依照前述制備空白SFM和SFM/VCM時所取絲素濃度不同，SFM-20、SFM-40、SFM-60表示絲素濃度分別為20、40、60 mg/mL的SFM，SFM/VCM-20、SFM/VCM-40、SFM/VCM-60表示絲素濃度分別為20、40、60 mg/mL的SFM/VCM。CSH/SFM/VCM的大試樣中均加入了CSD，按成分中有無SFM/VCM以及所取絲素濃度的不同，分為4組(含SFM/VCM時，其在固相中質量分數均為10%)；CSH/SFM/VCM小試樣則未加入CSD，按成分中有無SFM與SFM/VCM(在固相中的質量分數分別為5%、10%)以及所取絲素濃度的不同分為13組。CSH/SFM/VCM的組成及配比如表 1所示。
圖1
CSH/SFM/VCM的試樣
Figure1.
Samples of CSH/SFM/VCM
表1
CSH/SFM/VCM的組成及配比
Table1.
Composition and ratio of CSH/SFM/VCM
1.5 CSH/SFM/VCM凝固時間的測定
采用維卡儀(ZSY-13，滄州智晟試驗儀器廠)按照ISO 9597-1989E測定試樣的凝固時間。每隔一段時間使維卡儀重針(350 g，Φ2.0 mm)自由并垂直釋放，若試樣表面出現壓痕，則將試樣養護一段時間后再測，直到試樣表面沒有明顯可見的印記為止，并立即在試樣其他位置重測一次，兩次結果相同，定義為終凝。從試樣固液相混合均勻開始至表面無明顯可見的印記的這段時間定為凝固時間。
1.6 藥物釋放實驗
稱取不同濃度的SFM與SFM/VCM各10 mg，再分別按如表 1所示的不同組成及配比制備CSH/SFM/VCM小試樣，每組3份，放入10 mL離心管，加入4 mL蒸餾水，標號。將各離心管放置在37 ℃的恒溫振蕩水槽內，調節振蕩速度為30 r/min。在0~22 d內每隔兩天定時將上層清液抽濾，保存于4 ℃冰箱備用，并補充相同體積的蒸餾水。采用紫外/可見分光光度計(TU-1901，北京普析通用儀器有限責任公司)測波長280 nm下各個時間點對應藥液的吸光度(Abs)，并以各樣品相應的不含VCM的SFM及CSH/SFM作為空白對照。VCM的線性回歸方程為：吸光度=4.203C-0.045，相關系數R=0.999 4，表現出藥物的濃度(單位：mg/mL)與吸光度之間良好的線性關系。每組SFM內載藥總量(單位：mg)為藥液體積與濃度的乘積。通過計算第n天時材料的藥物釋放率rn，式中C2i為第2i天時所抽取藥液的濃度，V為藥液體積，m為材料包裹藥物質量。
稱取不同濃度的SFM/VCM各10 mg置于10 mL的離心管中，加入4 mL蒸餾水，超聲30 min，3 000 r/min離心20 min，抽濾上層清液，以相應濃度的SFM在同樣條件下的上層清液為空白對照，測波長280 nm下各個藥液的吸光度。不同濃度SFM對VCM的載藥率與包封率分別通過如下公式得到：
載藥率=微球內藥物質量/微球總質量×100%??(1)
包封率=微球包裹藥物質量/投入藥物質量×100%??(2)
其中，
投入藥物質量=0.05×絲素質量??(3)
絲素質量=微球質量-微球包裹VCM質量??(4)
進而，
包封率=20×載藥率/(1-載藥率)??(5)
1.7 壓縮實驗
對各大試樣進行壓縮實驗。用砂紙輕輕把試樣兩端打磨平滑，實驗加載設備采用微機控制電子萬能試驗機(CMT 5105A，天水三思新技術有限公司)，設置速率為0.5 mm/min。實驗過程中計算機實時記錄應力、應變數據，并實時繪制實驗曲線。根據實驗曲線獲得壓縮強度、壓縮斷裂功。
1.8 統計學分析
實驗數據用SPSS 13.0軟件進行分析，以均數±標準差(x±s)表示，并進行獨立樣本t檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果與討論
2.1 紅外吸收光譜結果
經堿脫膠、溶絲，再通過水-油相溶解擴散法制備得到的3個濃度的SFM，其紅外吸收光譜如圖 2所示，酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ吸收峰的位置分別在1 625、1 514、1 229 cm-1左右。對照絲素蛋白的紅外光譜特征譜帶數據如表 2所示[25]。謝孟峽等[26]研究了蛋白質中各種二級結構在酰胺Ⅲ的紅外光譜特征，他們認為1 220~1 250 cm-1譜峰歸屬于β折疊，1 245~1 270 cm-1為無規卷曲。結果表明SFM接近β折疊。另外，三條曲線峰位基本一致，沒有明顯移動，說明在本實驗制備條件下，SFM構象受絲素濃度影響不大。
圖2
不同濃度SFM的FTIR圖像
Figure2.
FTIR spectroscopy of SFM with different concentrations
表2
絲素紅外光譜特征譜帶
Table2.
FTIR spectroscopy characteristic bands of silk fibroin
2.2 抑菌實驗結果
為了研究不同濃度的SFM/VCM對抑菌性能的影響，本文分別選SFM/VCM-20、SFM/VCM-40與SFM/VCM-60作為實驗組。16 h后的抑菌實驗結果如圖 3所示，空白組沒有抑菌圈出現，細菌仍生長良好；而含SFM/VCM的濾紙組均出現了抑菌圈。
檢測依據衛生部《消毒技術規范》2002版，抑菌環實驗規定如下：抑菌環直徑大于7 mm時，判為有抑菌作用。如圖 3所示，SFM/VCM-20、SFM/VCM-40、SFM/VCM-60對應抑菌環直徑分別為(19.63±0.96)、(19.88±0.74)、(20.00±1.27) mm，均具有抑菌作用，但三組間沒有明顯差異。
圖3
不同濃度的SFM/VCM對應抑菌圈的大小
Figure3.
Inhibition zone of SFM/VCM with different concentrations
2.3 掃描電鏡結果
如圖 4所示，SFM/VCM-20、SFM/VCM-40與SFM/VCM-60的粒徑分別為(63±5.6)、(70±8.4)、(154±20.1) μm。結果表明，隨著絲素濃度從20 mg/mL增加到60 mg/mL，SFM/VCM平均粒徑逐漸增加。原因可能是濃度的增加，促進了乳液滴凝聚，所形成的乳液滴變大，SFM/VCM的粒徑隨之增大[22]。
圖4
SFM/VCM掃描電鏡圖像
Figure4.
SEM images of SFM/VCM
不同絲素濃度的CSH/SFM/VCM固化后的掃描電鏡如圖 5所示，不含SFM/VCM的CSH，其SEM圖片呈現出相互連接的薄片或塊狀晶體結構；而含SFM/VCM的圖片中可見SFM/VCM被附在CSH表面或鑲嵌在晶體結構的孔隙中。
圖5
CSH/SFM/VCM的電鏡掃描
Figure5.
SEM images of CSH/SFM/VCM
2.4 藥物釋放結果
載藥率、包封率與藥物釋放速率在藥物釋放系統中是三個很重要的參數[18]。實驗中測得SFM/VCM-20、SFM/VCM-40與SFM/VCM-60的載藥率分別為3.82%±0.10%、4.26%±0.09%、4.57%±0.09%，包封率分別為79.51%±2.06%、88.99%±2.05%、95.78%±2.00%。對于載藥率與包封率，任意兩組結果均有P < 0.05，說明不同濃度的SFM/VCM其載藥率與包封率的差異均有統計學意義，如圖 6所示。結果顯示，隨著SFM濃度增加，載藥率和包封率均逐漸增大，原因可能是隨絲素濃度增加，單位體積內VCM與絲素質量增加，二者的結合機會增多，更有利于絲素包裹或吸附藥物。
圖6
SFM/VCM的載藥率及包封率
*不同SFM/VCM濃度間，
*with different SFM/VCM concentration,
如圖 7所示，隨著絲素濃度從20 mg/mL增加到60 mg/mL，SFM/VCM藥物釋放速率逐漸減小。另一方面，如圖 8所示，可以得出結論：在CSH中添加SFM/VCM，降低了其藥物釋放速率，可以看到在0~6 d，不加SFM/VCM載VCM的CSH釋放速率較快，藥物釋放率大于40%，而其他復合SFM/VCM的CSH樣品則小于33%，并且隨絲素濃度或SFM/VCM質量分數增加，藥物釋放速率逐漸降低。對比圖 7、8可知，SFM/VCM結合CSH后進一步增強了緩釋效果，降低了藥物釋放速率，原因是在SFM/VCM外又增加了CSH這一支架材料，藥物的釋放需要突破SFM和CSH雙層的“禁錮”才能得以實現。
圖7
不同濃度SFM/VCM的VCM釋放曲線
Figure7.
VCM release curves of SFM/VCM with different concentrations
圖8
不同組成及配比CSH/SFM/VCM的VCM釋放曲線
Figure8.
VCM release curves of CSH/SFM/VCM with different composition and ratio
2.5 凝固時間
實驗測得各大樣品凝固時間如表 3所示。可見，在CSH中添加SFM/VCM后，凝固時間延長，但不同絲素濃度的CSH/SFM/VCM凝固時間差異沒有統計學意義。
表3
各組CSH/SFM/VCM人工骨材料的凝固時間
Table3.
Setting time of CSH/SFM/VCM artificial bone samples
2.6 壓縮實驗結果
如圖 9所示，為壓縮率ε=3.33×10-3 s-1時典型的單軸壓縮應力-應變曲線。從圖中可以清楚地看到樣品破壞過程中的幾個階段。以CSH為例，應變值在0.008附近出現局部裂紋，之后裂紋逐漸擴展，直到0.036附近裂紋擴展到整個試樣，試樣徹底破裂。在裂紋穩定擴展階段，應力總體趨勢是增大的，說明試樣內部尚未出現實質性損傷，原因可能是損傷應變能相對于彈性應變能要小得多，試樣的能量仍以彈性應變能的形式存在[27]。
圖9
各試樣單軸壓縮應力-應變曲線(ε=3.33×10-3 s-1)
Figure9.
Stress-strain curves of CSH/SFM/VCM samples under uniaxial compression (ε=3.33×10-3 s-1)
如表 4所示，與空白CSH試樣相比，加入SFM/VCM后，試樣的壓縮強度雖下降，但仍滿足人松質骨最低限要求[28]；而壓縮斷裂功明顯提高，說明材料的韌性得到了提高，原因可能是絲素大分子上帶有極性基團如氨基、羧基與羥基，可以與鈣鹽形成一定的化學結合，當材料受到外力作用時，外力通過基體傳到絲素大分子，絲素分子發生滑移，使材料應變增加，壓縮斷裂功隨之增加[29]。同時，隨絲素濃度從20 mg/mL增加到60 mg/mL，壓縮斷裂功逐漸提高。
表4
實驗測得的各試樣壓縮強度與斷裂功
Table4.
Compression strength and fracture absorbing energy of CSH/SFM/VCM samples measured in the experiments
3 結論
本文采用水-油相溶解擴散方法制備了SFM，并與CSH、VCM復合構建了CSH/SFM/VCM復合人工骨，研究了絲素濃度對SFM以及CSH/SFM/VCM的表面形態、抑菌、構象、藥物釋放及力學等性能的影響。結果表明，隨著絲素濃度從20 mg/mL、40 mg/mL到60 mg/mL的增加，SFM粒徑增加，對抑菌性能影響不顯著，藥物釋放速率減慢，構象沒有明顯變化。對于CSH/SFM/VCM復合人工骨，隨絲素濃度從20 mg/mL增加到60 mg/mL，不同濃度間凝固時間的差異沒有統計學意義，但是壓縮斷裂功逐漸提高，藥物釋放速率逐漸減小，說明SFM的加入不僅提高了其韌性，而且緩解了藥物直接負載在CSH中前期的突釋問題。這一研究為進一步制備理想的抗感染骨修復材料提供了實驗依據，并為今后的深入研究奠定了基礎。
引言
目前由腫瘤切除、感染、創傷以及骨缺陷與衰老引起的骨損傷，仍然是臨床中所面臨的棘手問題[1-3]。自體骨移植是骨缺損治療的金標準[4]，但其來源與功能有限；而異體骨移植存在疾病傳播、免疫排斥反應等缺陷[5]，會對骨缺損治療的預后效果造成不良影響。Augat等[6]使用聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)進行內固定增強，但PMMA不能降解，如進行二次手術將進一步增加患者的痛苦，且有發熱、妨害骨折愈合等缺點[7-8]。
α-半水硫酸鈣(calcium sulfate hemihydrate，CSH)用作骨修復材料已經有很長的歷史[9]，且有著明顯的優勢，如良好的生物相容性、骨傳導性、生物可降解性及易塑性等[10]。但CSH也存在一定缺陷，如脆性大[11]，作為藥物載體材料，前期突釋明顯，導致將其應用于藥物緩釋領域受到限制[12]。
絲素蛋白是從蠶絲中提取的蛋白質，具有良好的生物相容性、生物可降解性和良好的力學性能[13]，可以再生和加工成不同產品，如薄膜、多孔支架等[14]。絲素超微結構能很好地適應人體的肌體組織，被廣泛應用于手術縫合線、人工皮膚、藥物緩釋載體等[15]。以絲素蛋白為原料制備的絲素微球(silk fibroin microspheres，SFM)，具有比表面積大、生物相容性好、可生物降解等優點，正逐漸成為一種重要的藥物載體[16]。
萬古霉素(vancomycin，VCM)是糖肽抗生素，對許多革蘭陽性細菌，如金黃色葡萄球菌，具有很強的殺菌作用，并且已經應用于多個臨床領域[17]。VCM目前被認為是最有效的抗金黃色葡萄球菌感染與治療的藥物[18]。
本文一方面以絲素蛋白為載體，VCM為藥物模型，通過水-油相溶解擴散方法制備不同濃度的SFM，研究了絲素濃度對SFM粒徑、構象以及藥物釋放性能的影響；同時將不同濃度SFM與CSH復合，構建載萬古霉素半水硫酸鈣/絲素微球(CSH/SFM/VCM)復合人工骨材料，檢測其表面形態、抑菌性、藥物釋放性能及力學性能。通過掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)、傅里葉變換紅外吸收光譜(Fourier transform infrared spectroscope，FTIR)、抑菌圈實驗、紫外/可見分光光度計以及萬能試驗機對材料進行表征和測試。本研究將天然高分子絲素引入CSH，改善了單獨CSH材料存在的脆性大、易突釋的問題，制備了具有一定力學性能、可藥物緩釋的復合人工骨材料，為進一步制備理想的抗感染骨修復材料提供了實驗依據，也為今后的臨床應用研究奠定了基礎。
1 材料與方法
1.1 絲素溶液的制備
稱取一定量的蠶絲，洗凈、烘干；然后投入質量分數為0.02%的碳酸鈉溶液中，于100 ℃下脫膠30 min，沖洗以除去絲膠，重復以上操作一次[19]，烘干后即獲得絲素蛋白。按溶液與絲素質量比為10:1配置一定量的氯化鈣-乙醇-水(摩爾比8:2:1)三元溶液。將絲素于80 ℃的三元溶液中攪拌溶解30 min，得到混合溶液[20]，冷卻后，將混合溶液裝入透析袋，在蒸餾水中透析72 h以除去氯化鈣[21]，經過濾獲得絲素溶液。
1.2 空白絲素微球與載藥絲素微球的制備及形貌觀察
空白絲素微球(SFM)制備：100 mL乙酸乙酯與2 mL乳化劑Span 80攪拌混合，常溫下采用注射器將2 mL絲素溶液以0.4 mL/min的速度逐滴滴入攪拌的乙酸乙酯中[22]。攪拌2 h，SFM懸浮于乙酸乙酯中。石油醚、異丙醇洗滌，凍干，收集微球。
對材料進行實驗分組，滴加的絲素濃度分別為20、40、60 mg/mL，調節攪拌機轉速為600~700 r/min。
載萬古霉素/絲素微球(SFM/VCM)制備：按VCM與絲素質量比為1:20的比例，將VCM溶于絲素溶液中，常溫下磁力攪拌30 min，獲得載VCM絲素溶液。其他步驟與SFM制備步驟相同。
采用紅外光譜儀(bruck tensor 27，德國布魯克公司)檢測SFM構象。
1.3 抑菌實驗
分別稱取絲素濃度為20、40、60 mg/mL的SFM/VCM各0.01 g，置于5 mm×5 mm的濾紙上。在濾紙上滴加少量蒸餾水以使微球均勻散開。再將濾紙放置在金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)培養皿中，取空白濾紙作為對照組，培養16 h后，觀察各濾紙上是否有金黃色葡萄球菌抑菌圈出現[18]。
1.4 CSH/SFM/VCM的制備
選用CSH、SFM為固相，二水硫酸鈣(calcium sulphate dihydrate，CSD)為促凝劑，蒸餾水為固化液，加工成兩種規格的試樣。大試樣規格為Φ10 mm×15 mm，進行壓縮實驗與凝固時間的測定；小試樣規格為Φ4 mm×3 mm，進行SEM觀察與藥物釋放實驗。其中，CSH與水反應固化后的終產物為CSD，而作為促凝劑的CSD與CSH和水反應固化后形成的CSD融為一體，所以，作為促凝劑的CSD并不是作為終產物的外相物質[23-24]。將固相與固化液混合，在燒杯中將混合物攪拌成均勻的糊狀，再通過模具成型，得到CSH/SFM/VCM的固化體，如圖 1所示。依照前述制備空白SFM和SFM/VCM時所取絲素濃度不同，SFM-20、SFM-40、SFM-60表示絲素濃度分別為20、40、60 mg/mL的SFM，SFM/VCM-20、SFM/VCM-40、SFM/VCM-60表示絲素濃度分別為20、40、60 mg/mL的SFM/VCM。CSH/SFM/VCM的大試樣中均加入了CSD，按成分中有無SFM/VCM以及所取絲素濃度的不同，分為4組(含SFM/VCM時，其在固相中質量分數均為10%)；CSH/SFM/VCM小試樣則未加入CSD，按成分中有無SFM與SFM/VCM(在固相中的質量分數分別為5%、10%)以及所取絲素濃度的不同分為13組。CSH/SFM/VCM的組成及配比如表 1所示。
圖1
CSH/SFM/VCM的試樣
Figure1.
Samples of CSH/SFM/VCM
表1
CSH/SFM/VCM的組成及配比
Table1.
Composition and ratio of CSH/SFM/VCM
1.5 CSH/SFM/VCM凝固時間的測定
采用維卡儀(ZSY-13，滄州智晟試驗儀器廠)按照ISO 9597-1989E測定試樣的凝固時間。每隔一段時間使維卡儀重針(350 g，Φ2.0 mm)自由并垂直釋放，若試樣表面出現壓痕，則將試樣養護一段時間后再測，直到試樣表面沒有明顯可見的印記為止，并立即在試樣其他位置重測一次，兩次結果相同，定義為終凝。從試樣固液相混合均勻開始至表面無明顯可見的印記的這段時間定為凝固時間。
1.6 藥物釋放實驗
稱取不同濃度的SFM與SFM/VCM各10 mg，再分別按如表 1所示的不同組成及配比制備CSH/SFM/VCM小試樣，每組3份，放入10 mL離心管，加入4 mL蒸餾水，標號。將各離心管放置在37 ℃的恒溫振蕩水槽內，調節振蕩速度為30 r/min。在0~22 d內每隔兩天定時將上層清液抽濾，保存于4 ℃冰箱備用，并補充相同體積的蒸餾水。采用紫外/可見分光光度計(TU-1901，北京普析通用儀器有限責任公司)測波長280 nm下各個時間點對應藥液的吸光度(Abs)，并以各樣品相應的不含VCM的SFM及CSH/SFM作為空白對照。VCM的線性回歸方程為：吸光度=4.203C-0.045，相關系數R=0.999 4，表現出藥物的濃度(單位：mg/mL)與吸光度之間良好的線性關系。每組SFM內載藥總量(單位：mg)為藥液體積與濃度的乘積。通過計算第n天時材料的藥物釋放率rn，式中C2i為第2i天時所抽取藥液的濃度，V為藥液體積，m為材料包裹藥物質量。
稱取不同濃度的SFM/VCM各10 mg置于10 mL的離心管中，加入4 mL蒸餾水，超聲30 min，3 000 r/min離心20 min，抽濾上層清液，以相應濃度的SFM在同樣條件下的上層清液為空白對照，測波長280 nm下各個藥液的吸光度。不同濃度SFM對VCM的載藥率與包封率分別通過如下公式得到：
載藥率=微球內藥物質量/微球總質量×100%??(1)
包封率=微球包裹藥物質量/投入藥物質量×100%??(2)
其中，
投入藥物質量=0.05×絲素質量??(3)
絲素質量=微球質量-微球包裹VCM質量??(4)
進而，
包封率=20×載藥率/(1-載藥率)??(5)
1.7 壓縮實驗
對各大試樣進行壓縮實驗。用砂紙輕輕把試樣兩端打磨平滑，實驗加載設備采用微機控制電子萬能試驗機(CMT 5105A，天水三思新技術有限公司)，設置速率為0.5 mm/min。實驗過程中計算機實時記錄應力、應變數據，并實時繪制實驗曲線。根據實驗曲線獲得壓縮強度、壓縮斷裂功。
1.8 統計學分析
實驗數據用SPSS 13.0軟件進行分析，以均數±標準差(x±s)表示，并進行獨立樣本t檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果與討論
2.1 紅外吸收光譜結果
經堿脫膠、溶絲，再通過水-油相溶解擴散法制備得到的3個濃度的SFM，其紅外吸收光譜如圖 2所示，酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ吸收峰的位置分別在1 625、1 514、1 229 cm-1左右。對照絲素蛋白的紅外光譜特征譜帶數據如表 2所示[25]。謝孟峽等[26]研究了蛋白質中各種二級結構在酰胺Ⅲ的紅外光譜特征，他們認為1 220~1 250 cm-1譜峰歸屬于β折疊，1 245~1 270 cm-1為無規卷曲。結果表明SFM接近β折疊。另外，三條曲線峰位基本一致，沒有明顯移動，說明在本實驗制備條件下，SFM構象受絲素濃度影響不大。
圖2
不同濃度SFM的FTIR圖像
Figure2.
FTIR spectroscopy of SFM with different concentrations
表2
絲素紅外光譜特征譜帶
Table2.
FTIR spectroscopy characteristic bands of silk fibroin
2.2 抑菌實驗結果
為了研究不同濃度的SFM/VCM對抑菌性能的影響，本文分別選SFM/VCM-20、SFM/VCM-40與SFM/VCM-60作為實驗組。16 h后的抑菌實驗結果如圖 3所示，空白組沒有抑菌圈出現，細菌仍生長良好；而含SFM/VCM的濾紙組均出現了抑菌圈。
檢測依據衛生部《消毒技術規范》2002版，抑菌環實驗規定如下：抑菌環直徑大于7 mm時，判為有抑菌作用。如圖 3所示，SFM/VCM-20、SFM/VCM-40、SFM/VCM-60對應抑菌環直徑分別為(19.63±0.96)、(19.88±0.74)、(20.00±1.27) mm，均具有抑菌作用，但三組間沒有明顯差異。
圖3
不同濃度的SFM/VCM對應抑菌圈的大小
Figure3.
Inhibition zone of SFM/VCM with different concentrations
2.3 掃描電鏡結果
如圖 4所示，SFM/VCM-20、SFM/VCM-40與SFM/VCM-60的粒徑分別為(63±5.6)、(70±8.4)、(154±20.1) μm。結果表明，隨著絲素濃度從20 mg/mL增加到60 mg/mL，SFM/VCM平均粒徑逐漸增加。原因可能是濃度的增加，促進了乳液滴凝聚，所形成的乳液滴變大，SFM/VCM的粒徑隨之增大[22]。
圖4
SFM/VCM掃描電鏡圖像
Figure4.
SEM images of SFM/VCM
不同絲素濃度的CSH/SFM/VCM固化后的掃描電鏡如圖 5所示，不含SFM/VCM的CSH，其SEM圖片呈現出相互連接的薄片或塊狀晶體結構；而含SFM/VCM的圖片中可見SFM/VCM被附在CSH表面或鑲嵌在晶體結構的孔隙中。
圖5
CSH/SFM/VCM的電鏡掃描
Figure5.
SEM images of CSH/SFM/VCM
2.4 藥物釋放結果
載藥率、包封率與藥物釋放速率在藥物釋放系統中是三個很重要的參數[18]。實驗中測得SFM/VCM-20、SFM/VCM-40與SFM/VCM-60的載藥率分別為3.82%±0.10%、4.26%±0.09%、4.57%±0.09%，包封率分別為79.51%±2.06%、88.99%±2.05%、95.78%±2.00%。對于載藥率與包封率，任意兩組結果均有P < 0.05，說明不同濃度的SFM/VCM其載藥率與包封率的差異均有統計學意義，如圖 6所示。結果顯示，隨著SFM濃度增加，載藥率和包封率均逐漸增大，原因可能是隨絲素濃度增加，單位體積內VCM與絲素質量增加，二者的結合機會增多，更有利于絲素包裹或吸附藥物。
圖6
SFM/VCM的載藥率及包封率
*不同SFM/VCM濃度間，
*with different SFM/VCM concentration,
如圖 7所示，隨著絲素濃度從20 mg/mL增加到60 mg/mL，SFM/VCM藥物釋放速率逐漸減小。另一方面，如圖 8所示，可以得出結論：在CSH中添加SFM/VCM，降低了其藥物釋放速率，可以看到在0~6 d，不加SFM/VCM載VCM的CSH釋放速率較快，藥物釋放率大于40%，而其他復合SFM/VCM的CSH樣品則小于33%，并且隨絲素濃度或SFM/VCM質量分數增加，藥物釋放速率逐漸降低。對比圖 7、8可知，SFM/VCM結合CSH后進一步增強了緩釋效果，降低了藥物釋放速率，原因是在SFM/VCM外又增加了CSH這一支架材料，藥物的釋放需要突破SFM和CSH雙層的“禁錮”才能得以實現。
圖7
不同濃度SFM/VCM的VCM釋放曲線
Figure7.
VCM release curves of SFM/VCM with different concentrations
圖8
不同組成及配比CSH/SFM/VCM的VCM釋放曲線
Figure8.
VCM release curves of CSH/SFM/VCM with different composition and ratio
2.5 凝固時間
實驗測得各大樣品凝固時間如表 3所示。可見，在CSH中添加SFM/VCM后，凝固時間延長，但不同絲素濃度的CSH/SFM/VCM凝固時間差異沒有統計學意義。
表3
各組CSH/SFM/VCM人工骨材料的凝固時間
Table3.
Setting time of CSH/SFM/VCM artificial bone samples
2.6 壓縮實驗結果
如圖 9所示，為壓縮率ε=3.33×10-3 s-1時典型的單軸壓縮應力-應變曲線。從圖中可以清楚地看到樣品破壞過程中的幾個階段。以CSH為例，應變值在0.008附近出現局部裂紋，之后裂紋逐漸擴展，直到0.036附近裂紋擴展到整個試樣，試樣徹底破裂。在裂紋穩定擴展階段，應力總體趨勢是增大的，說明試樣內部尚未出現實質性損傷，原因可能是損傷應變能相對于彈性應變能要小得多，試樣的能量仍以彈性應變能的形式存在[27]。
圖9
各試樣單軸壓縮應力-應變曲線(ε=3.33×10-3 s-1)
Figure9.
Stress-strain curves of CSH/SFM/VCM samples under uniaxial compression (ε=3.33×10-3 s-1)
如表 4所示，與空白CSH試樣相比，加入SFM/VCM后，試樣的壓縮強度雖下降，但仍滿足人松質骨最低限要求[28]；而壓縮斷裂功明顯提高，說明材料的韌性得到了提高，原因可能是絲素大分子上帶有極性基團如氨基、羧基與羥基，可以與鈣鹽形成一定的化學結合，當材料受到外力作用時，外力通過基體傳到絲素大分子，絲素分子發生滑移，使材料應變增加，壓縮斷裂功隨之增加[29]。同時，隨絲素濃度從20 mg/mL增加到60 mg/mL，壓縮斷裂功逐漸提高。
表4
實驗測得的各試樣壓縮強度與斷裂功
Table4.
Compression strength and fracture absorbing energy of CSH/SFM/VCM samples measured in the experiments
3 結論
本文采用水-油相溶解擴散方法制備了SFM，并與CSH、VCM復合構建了CSH/SFM/VCM復合人工骨，研究了絲素濃度對SFM以及CSH/SFM/VCM的表面形態、抑菌、構象、藥物釋放及力學等性能的影響。結果表明，隨著絲素濃度從20 mg/mL、40 mg/mL到60 mg/mL的增加，SFM粒徑增加，對抑菌性能影響不顯著，藥物釋放速率減慢，構象沒有明顯變化。對于CSH/SFM/VCM復合人工骨，隨絲素濃度從20 mg/mL增加到60 mg/mL，不同濃度間凝固時間的差異沒有統計學意義，但是壓縮斷裂功逐漸提高，藥物釋放速率逐漸減小，說明SFM的加入不僅提高了其韌性，而且緩解了藥物直接負載在CSH中前期的突釋問題。這一研究為進一步制備理想的抗感染骨修復材料提供了實驗依據，并為今后的深入研究奠定了基礎。
