針對目前市場上顯色生物芯片檢測設備存在的信號采集時間長、通量低、信噪比差、智能程度較低等問題, 開發了一種高通量(1次檢測8片)快速檢測設備。該設備由硬件系統和軟件系統兩部分構成, 采用基于i.MX6嵌入式操作系統, 以電荷耦合元件(CCD)成像方式讀取生物芯片上微陣列檢測圖像, 通過芯片條碼由軟件自動完成微陣列圖像處理以及數據分析和結果輸出。本系統對標準灰度片以及標準格式芯片測量顯示, 光學測量誤差小于0.1%, 檢測信號線性R2為98.7%, 重復性CV值為1.096 1%。對200例臨床檢測芯片的對比研究結果顯示, 檢測性能優于同類型已上市識讀儀。
引用本文： 陸恩澤, 林志松, 朱濱, 魏悅, 邢軍芬. 基于電荷耦合元件的新型顯色生物芯片識讀儀的研究. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(4): 691-697. doi: 10.7507/1001-5515.20160114 復制
0 引言
生物芯片技術作為21世紀生物醫學前沿科技，涉及了現代基因技術、信息技術、微電子技術和微機電技術。它能實現對生命機體的生物組分檢測，且檢測準確、速度快、信息量巨大[1]，因此廣泛用于藥物篩選、分析、開發、疾病診斷、基因結構與功能研究等領域[2]。
目前市場上的生物芯片根據探針標記方法可分為兩大類：熒光標記生物芯片和顯色標記生物芯片；對應的檢測設備主要也有兩類：激光共聚焦掃描儀和顯色成像檢測設備。激光共聚焦掃描儀是基于光電倍增管(photomultiplier tube, PMT)[3]搭建的，通過激光逐點連續激發芯片檢測區域進行信號讀取，檢測時間很長，結構復雜[4]。由于顯色標記芯片的原料易得、制作成本低，并且顯色芯片檢測設備價格低廉、穩定性好，且根據國家藥監局數據庫[5]查詢情況看顯色成像檢測設備占多數，這表明其逐漸成為市場主流。但目前的顯色成像檢測設備也存在通量低、檢測速度慢、信噪比低、自動化程度低等缺點，這些問題日益受到用戶的關注。針對上述問題，本文報告了一種針對玻片材質顯色型基因芯片檢測設備，以高性能電荷耦合元件(charge-coupled device, CCD)工業數字相機作為圖像傳感器，擴大了探測區域且提高了芯片圖像的質量，設計了帶有電機的芯片載物臺增加了檢測通量，可以在掃描的同時對圖像進行分析，縮短了檢測時間，提高自動化程度，以較好地滿足用戶需求。
1 識讀儀硬件系統
本研究的設備是基于CCD圖像傳感器設計的顯色生物芯片檢測系統[外形見圖 1(a)]，主要用于顯色生物芯片信號采集、數據分析以及最終結果的輸出。本研究的顯色生物芯片是玻璃材質，芯片下端貼有CODE128條形碼[見圖 1(b)]，芯片表面固定有基因檢測探針陣列。顯色生物芯片與待測樣品經過一系列反應后，探針區域會生成有色斑點陣列，斑點信號的強弱、分布取決于待測基因的類型[6]。
圖1
識讀儀及部分組件圖
(a)設備外部圖；(b)生物芯片；(c)CCD圖像傳感器；(d)芯片載物臺
Figure1. Photos of the reader and some core components(a) photo of the device; (b) bio-chip; (c) CCD image sensor; (d) the stage of chip
本識讀儀硬件主要包括光源模塊、CCD相機采集模塊、芯片載物臺模塊、電源模塊、控制電路板模塊等，見圖 1。本設備使用美沃精密儀器生產的CS410型CCD相機作為圖像傳感器，其性能參數見表 1，模數變換器(analog-to-digital converter, ADC)分辨率為12 bit。CCD的位數影響生物芯片識讀儀檢測的動態范圍，由于本設備選用的CCD位數較以往有所提高, 使得儀器的動態范圍提高為0~4 095，從而對于不同濃度探針形成的斑點的信號值劃分更加精確，下文將通過線性范圍的計算來論述。不同于其他光學傳感器，該圖像傳感器探測區域覆蓋整張芯片，提高了設備掃描速度。設備的光源模塊選擇了發光二極管(light emitting diode, LED)背光板，該光源采用了平面結構設計，讓生物芯片的探針區域均勻受光，采集到的圖像更加清晰。檢測時將8張芯片置于載物盤，通過步進電機帶動其逐格移動。當芯片移至CCD相機下方時，自動拍照獲得芯片檢測圖像。
表1
CCD圖像傳感器性能參數
Table1.
Performance of CCD image sensor
本設備控制電路板模塊的架構見圖 2，主要包括開關電源、主板、核心板、USB相機板、主相機板、接口板、位置傳感器板、背景光板、電機驅動板、按鍵指示燈板、LCD顯示屏等。主控ARM芯片使用的是基于Freescale Cortex-A9架構，主頻1 GHz的i.MX6。i.MX6芯片主要對采集到的微陣列圖像的進行處理，以及產生頻率和占空比可調的控制信號。主板用于電源處理以及核心板到各功能板塊的控制邏輯以及反饋。
圖2
識讀儀硬件結構圖
Figure2.
Structure chart of reader system hardware
2 識讀儀軟件系統
2.1 軟件系統功能
本生物芯片識讀儀配套軟件系統是基于C++語言環境開發的，分別在Linux和Windows操作環境使用，實現圖像處理、圖像顯示、數據采集、數據分析和基因判型。還具備了患者信息錄入、數據庫存儲以及Excel報告輸出等功能。軟件流程圖如圖 3所示。
圖3
軟件系統流程圖
Figure3.
Flow diagram of software system
2.2 微陣列圖像處理
圖像處理主要包括降噪和探針陣列的定位識別兩個部分[7-8]。
圖像降噪主要目的是消除來自于背景污染、光照不均勻和電子噪聲等干擾[9]。在去噪前需對原始圖像進行預處理，先對原始圖像進行裁剪，取出成像部分，裁剪后的圖像采用直方圖均衡法對圖像亮度進行歸一化，增強信號與背景的對比度。去除圖像噪聲的傳統方法是濾波處理，但是濾波器的使用改變了圖像的有用信息。在本設計中采用數學形態學運算，它是以形態為基礎，對圖像進行分析的數學工具。其主要基于一定形狀的內核結構元素對圖像進行相應的運算操作從而抓取對應形狀，實現對背景干擾的識別和處理[10-11]。形態學運算主要操作為腐蝕、膨脹運算以及開、閉運算。消除比結構元素小的亮細節用開運算，消除較大的亮細節則用閉運算[12]。根據本系統檢測圖像噪聲特點，在此使用閉運算操作，內核的形狀為圓形。圖 4是基因微陣列圖像的原始圖及去噪后圖像。
圖4
微陣列圖像及去噪后的圖像
Figure4.
Microarray image and noise reduction image
陣列的識別定位通過軟件首先識別生物芯片上的條形碼，獲取生物芯片上探針陣列的行列信息，然后搜索生物芯片質控點排列位置，鎖定探針陣列。具體方法是先對芯片檢測圖像二值化后進行垂直投影，見圖 5，橫軸表示為投影的坐標位置，縱軸為此位置上y方向像素點灰度值積分，圖像波峰和波谷的交界處對應為這一縱列探針斑點邊界。圖 5垂直投影圖最左三個波谷為三列質控點像素投影，質控點區域的寬為80個像素，迭代統計圖像中80像素寬的區域的信號值，信號值最大且位置在最左邊即為探針陣列的質控點區域，通過輪廓搜索識別質控點，根據行列信息擬合橫向縱向的直線生成探針網格，根據間距和正常點輪廓信息尋找確定陣列的其他探針點。考慮到制備探針陣列時的點樣誤差可能導致排列不完全規則，軟件會在網格交叉點周圍10個像素范圍內繼續搜索，判別是否存在排列不規則的探針點。使用本算法對于陣列的定位結果如圖 5所示。
圖5
微陣列圖像垂直投影和定位結果圖
Figure5.
Vertical projection and location of microarray image
2.3 信號值的采集、分析與結果輸出
本設備通過檢測玻璃材質生物芯片上的探針陣列的色斑強度和分布實現檢測目的。因此選擇陣列色斑的透光率做為作為信號源，透射率越低信號值越強。設備校準后透光率為100%，通過16次曝光采樣反相得到基準采樣值為138。信號值的計算公式見式(1)：
| $ Val = k*\sum\limits_{i = 1}^{16} {\left( {{B_i} - {S_i}} \right)*138} $ |
其中Val為信號值，Si為信號點采樣值，Bi為背景采樣值，k為背光校正系數。
識讀儀讀取的信號是前景信號與背景信號的疊加值，信號值需要減去背景值[13]。為了消除背景不均一的影響，信號值處理時減去的是自適應背景值，即統計信號點所在局部區域背景值取平均。設備讀取的信號值最終傳到個人電腦(personal computer, PC)，PC端軟件根據芯片的類型，自動計算各探針點信號比值，通過與實驗統計確定的純合/雜合基因判定閾值進行比較分析，判定所檢測各基因類型并自動以表格形式輸出結果。
3 檢測實驗及結果
3.1 實驗材料和儀器
透射率為35.6%、55.4%和75.4%標準透射灰度板購自上海百傲科技股份有限公司。標準格式芯片購自上海百傲科技股份有限公司，是將合成的寡核酸探針溶解，經紫外分光光度計標定濃度，稀釋成8個濃度梯度，固定在醛基基片上，制成4行6列的芯片，將芯片與含有0.01 μmol/L生物素標記的互補探針進行雜交顯色反應，形成顏色深淺不同的圓點微陣列，其信號值可測量。上海市第一人民醫院檢驗科提供的ALDH2 (Glu504Lys)基因、CYP2C19基因、MTHFR (C677T)基因檢測芯片樣本各200張。BE-2.0生物芯片識讀儀購自上海百傲科技股份有限公司。
3.2 性能實驗
3.2.1 光學誤差
本設備選用透光率值這一光學信號作為信號源，計算光學誤差可驗證設備讀值準確性。方法為對計量過的3階標準透射灰度板，每個重復測量透光率三次，計算每個透射灰度板的測量誤差，誤差=每三次均值－標定值，結果見表 2。分別計算得到光學誤差為0%、0%、0.1%，因此本設備取值準確可靠。
表2
標準透射灰度板重復性測量數據
Table2.
Data of standard gray sheet
3.2.2 線性范圍和重復性CV值
顯色生物芯片判型是以不同濃度探針信號值作為依據，這就要求儀器可以識別不同濃度探針形成的斑點信號值。通過線性范圍的計算，可以驗證此性能，同時也說明了其檢測的動態范圍。方法為測量標準格式芯片上1~8號探針點信號值，計算線性相關系數R的平方值，Xi為探針濃度的對數值, Yi為每個探針對應三個點的信號平均值，見式(2)，結果見表 3。
表3
標準格式芯片測量數據
Table3.
Data of standard format chip
用CV值來標定設備檢測的均勻性。方法為在相同測量條件下，重復測量標準格式芯片5次。由于5號探針濃度位于中間，芯片點樣儀在點樣時濃度穩定可控，因此在本實驗中以5號探針三個點信號平均值(yi)作為單次測量信號值，計算5次測量的CV值(離散系數)，
從實驗結果看本設備的線性范圍接近0.99，可以識別不同濃度探針形成的斑點信號值，檢測動態范圍大，CV值為1.096 1%，能夠滿足基因檢測臨床實驗的要求。
| $ {R^2} = {\left[{\frac{{n\sum\limits_{i = 1}^n {{x_i}{y_i}} - \sum\limits_{i = 1}^n {{x_i}} \bullet \sum\limits_{i = 1}^n {{y_i}} }}{{\sqrt {n\sum\limits_{i = 1}^n {x_i^2} - {{\left( {\sum\limits_{i = 1}^n {{x_i}} } \right)}^2}} \bullet \sqrt {n\sum\limits_{i = 1}^n {y_i^2} - {{\left( {\sum\limits_{i = 1}^n {{y_i}} } \right)}^2}} }}} \right]^2} $ |
| $ {\text{CV = }}\frac{{\sqrt {\left( {\sum\limits_{i = 1}^5 {{y_i} - \bar y} } \right)/4} }}{{\bar y}} $ |
3.3 芯片檢測比較實驗
3.3.1 檢測結果對比
分別用批準上市的BE-2.0生物芯片識讀儀和本文設計的生物芯片識讀儀對來自臨床實驗室的三種顯色生物芯片樣本進行檢測，通過檢出率評價兩種設備的檢測性能。
(1)CYP2C19檢測結果：按照CYP2C19的*1、*2和*3三個等位基因的組進行劃分[14]，兩者均檢出的有195例，兩者檢出結果100%相同，其中*1/*1型71例，*1/*2型89例，*1/*3型16例，*2/*2型16例，*3/*3型0例，*2/*3型3例。剩余5例樣本，2例樣本檢測前雜交顯色實驗失敗；3例樣本檢出結果不一致，這3例樣本BE-2.0檢出為*1/*1型但結果報警待驗證，本文設備檢出均為*1/*1型。
(2)ALDH2檢測結果：兩者均檢出的有192例，檢測結果100%相同，其中Glu504Glu型131例，Glu504Lys型55例，TT型6例。剩余8例樣本中，2例樣本檢測前雜交顯色實驗失敗；6例檢出結果不一致，3例樣本BE-2.0檢出結果為Glu504Glu型但結果報警待驗證，而本文設備檢出為Glu504Glu型，另3例樣本BE-2.0檢出為Glu504Lys型，本文設備為Glu504Lys但結果顯示報警待驗證。
(3)MTHFR檢測結果：兩者均檢出的有189例，兩者檢出結果100%相同，其中CC型49例，CT型90例，TT型50例。剩余11例樣本，5例樣本檢測前雜交顯色實驗失敗；6例樣本檢出結果不一致，5例樣本BE-2.0檢出為CT型但結果報警待驗證，而本文設備檢出為CT型，另1例樣本BE-2.0檢出為TT型，本文設備檢出為TT型但結果報警待驗證。
(4)不一致樣本測序結果：對上述三種芯片中15例不一致樣本，提取樣本血液DNA送交測序，2例測序失敗，獲得13例測序結果。13例中，3例為*1/*1型，3例為Glu504Glu型，5例為CT型，這11例與本文設備檢出結果相同；1例為Glu504Lys型，1例為TT型，這2例與BE-2.0檢出結果相同。
3.3.2 檢測結果分析
對于9例檢測前雜交顯色實驗失敗的樣本和2例測序失敗樣本，在臨床實驗中均需重新檢測，且因為實驗因素和設備性能無關，所以去除這11例樣本統計檢出率。結合均檢出的576例樣本和13例測序結果樣本計算檢出率，BE-2.0為98.1%(578/589)，本文設備為99.7%(587/589)。從檢出率上看，本文設備檢測性能優于BE-2.0型識讀儀。
4 討論和結論
對于此類設備而言，信號采集模塊的性能指標直接影響檢測圖像的最終成像質量。目前的顯色成像檢測設備使用線性CCD作為光學傳感器(如BE-2.0生物芯片識讀儀)，它使用電機帶作為傳動裝置移動線性CCD對芯片上的信號探針進行逐排掃描，一張芯片檢測大概需要耗時三分鐘，一次只能檢測單張芯片。本研究使用CCD相機作為圖像傳感器，該相機圖像傳感器體積小，極大地節省了空間；使用了大視場焦平面調整技術和自動聚焦技術，檢測分辨率可達1 μm/pixel，單次檢測區域可以覆蓋整張芯片；而且CCD相機成像質量優良，即使在低照度環境下優勢依然明顯。采用本文設備一次檢測8張生物芯片，8張芯片的總檢測時間縮短為一分半鐘。采用LAN RJ45接口與PC端進行數據傳輸，設備應用廣泛。本設備采用多次曝光疊加成像技術增強了前后景的對比度，采用邊緣檢測劃定輪廓識別信號點的算法，對于點樣誤差、實驗條件變化、背景污染等導致的芯片檢測圖像質量差，有較好的自動識別能力，特別是對弱信號的檢出率較高。在信號點識別方面引入了條形碼，代替了微陣列圖像處理中手動輸入陣列信息的步驟，提高了設備自動化程度和軟件識別準確性。
本識讀儀實現了從圖像獲取和處理、數據分析到結果輸出的全自動的過程，這極大地提高了實驗人員的工作效率，通過性能研究實驗和比較研究實驗證明了該設備的檢測準確性、穩定性、可靠性以及與同類型設備相比優勢明顯，實用性極強，非常適合于臨床診斷。
0 引言
生物芯片技術作為21世紀生物醫學前沿科技，涉及了現代基因技術、信息技術、微電子技術和微機電技術。它能實現對生命機體的生物組分檢測，且檢測準確、速度快、信息量巨大[1]，因此廣泛用于藥物篩選、分析、開發、疾病診斷、基因結構與功能研究等領域[2]。
目前市場上的生物芯片根據探針標記方法可分為兩大類：熒光標記生物芯片和顯色標記生物芯片；對應的檢測設備主要也有兩類：激光共聚焦掃描儀和顯色成像檢測設備。激光共聚焦掃描儀是基于光電倍增管(photomultiplier tube, PMT)[3]搭建的，通過激光逐點連續激發芯片檢測區域進行信號讀取，檢測時間很長，結構復雜[4]。由于顯色標記芯片的原料易得、制作成本低，并且顯色芯片檢測設備價格低廉、穩定性好，且根據國家藥監局數據庫[5]查詢情況看顯色成像檢測設備占多數，這表明其逐漸成為市場主流。但目前的顯色成像檢測設備也存在通量低、檢測速度慢、信噪比低、自動化程度低等缺點，這些問題日益受到用戶的關注。針對上述問題，本文報告了一種針對玻片材質顯色型基因芯片檢測設備，以高性能電荷耦合元件(charge-coupled device, CCD)工業數字相機作為圖像傳感器，擴大了探測區域且提高了芯片圖像的質量，設計了帶有電機的芯片載物臺增加了檢測通量，可以在掃描的同時對圖像進行分析，縮短了檢測時間，提高自動化程度，以較好地滿足用戶需求。
1 識讀儀硬件系統
本研究的設備是基于CCD圖像傳感器設計的顯色生物芯片檢測系統[外形見圖 1(a)]，主要用于顯色生物芯片信號采集、數據分析以及最終結果的輸出。本研究的顯色生物芯片是玻璃材質，芯片下端貼有CODE128條形碼[見圖 1(b)]，芯片表面固定有基因檢測探針陣列。顯色生物芯片與待測樣品經過一系列反應后，探針區域會生成有色斑點陣列，斑點信號的強弱、分布取決于待測基因的類型[6]。
圖1
識讀儀及部分組件圖
(a)設備外部圖；(b)生物芯片；(c)CCD圖像傳感器；(d)芯片載物臺
Figure1. Photos of the reader and some core components(a) photo of the device; (b) bio-chip; (c) CCD image sensor; (d) the stage of chip
本識讀儀硬件主要包括光源模塊、CCD相機采集模塊、芯片載物臺模塊、電源模塊、控制電路板模塊等，見圖 1。本設備使用美沃精密儀器生產的CS410型CCD相機作為圖像傳感器，其性能參數見表 1，模數變換器(analog-to-digital converter, ADC)分辨率為12 bit。CCD的位數影響生物芯片識讀儀檢測的動態范圍，由于本設備選用的CCD位數較以往有所提高, 使得儀器的動態范圍提高為0~4 095，從而對于不同濃度探針形成的斑點的信號值劃分更加精確，下文將通過線性范圍的計算來論述。不同于其他光學傳感器，該圖像傳感器探測區域覆蓋整張芯片，提高了設備掃描速度。設備的光源模塊選擇了發光二極管(light emitting diode, LED)背光板，該光源采用了平面結構設計，讓生物芯片的探針區域均勻受光，采集到的圖像更加清晰。檢測時將8張芯片置于載物盤，通過步進電機帶動其逐格移動。當芯片移至CCD相機下方時，自動拍照獲得芯片檢測圖像。
表1
CCD圖像傳感器性能參數
Table1.
Performance of CCD image sensor
本設備控制電路板模塊的架構見圖 2，主要包括開關電源、主板、核心板、USB相機板、主相機板、接口板、位置傳感器板、背景光板、電機驅動板、按鍵指示燈板、LCD顯示屏等。主控ARM芯片使用的是基于Freescale Cortex-A9架構，主頻1 GHz的i.MX6。i.MX6芯片主要對采集到的微陣列圖像的進行處理，以及產生頻率和占空比可調的控制信號。主板用于電源處理以及核心板到各功能板塊的控制邏輯以及反饋。
圖2
識讀儀硬件結構圖
Figure2.
Structure chart of reader system hardware
2 識讀儀軟件系統
2.1 軟件系統功能
本生物芯片識讀儀配套軟件系統是基于C++語言環境開發的，分別在Linux和Windows操作環境使用，實現圖像處理、圖像顯示、數據采集、數據分析和基因判型。還具備了患者信息錄入、數據庫存儲以及Excel報告輸出等功能。軟件流程圖如圖 3所示。
圖3
軟件系統流程圖
Figure3.
Flow diagram of software system
2.2 微陣列圖像處理
圖像處理主要包括降噪和探針陣列的定位識別兩個部分[7-8]。
圖像降噪主要目的是消除來自于背景污染、光照不均勻和電子噪聲等干擾[9]。在去噪前需對原始圖像進行預處理，先對原始圖像進行裁剪，取出成像部分，裁剪后的圖像采用直方圖均衡法對圖像亮度進行歸一化，增強信號與背景的對比度。去除圖像噪聲的傳統方法是濾波處理，但是濾波器的使用改變了圖像的有用信息。在本設計中采用數學形態學運算，它是以形態為基礎，對圖像進行分析的數學工具。其主要基于一定形狀的內核結構元素對圖像進行相應的運算操作從而抓取對應形狀，實現對背景干擾的識別和處理[10-11]。形態學運算主要操作為腐蝕、膨脹運算以及開、閉運算。消除比結構元素小的亮細節用開運算，消除較大的亮細節則用閉運算[12]。根據本系統檢測圖像噪聲特點，在此使用閉運算操作，內核的形狀為圓形。圖 4是基因微陣列圖像的原始圖及去噪后圖像。
圖4
微陣列圖像及去噪后的圖像
Figure4.
Microarray image and noise reduction image
陣列的識別定位通過軟件首先識別生物芯片上的條形碼，獲取生物芯片上探針陣列的行列信息，然后搜索生物芯片質控點排列位置，鎖定探針陣列。具體方法是先對芯片檢測圖像二值化后進行垂直投影，見圖 5，橫軸表示為投影的坐標位置，縱軸為此位置上y方向像素點灰度值積分，圖像波峰和波谷的交界處對應為這一縱列探針斑點邊界。圖 5垂直投影圖最左三個波谷為三列質控點像素投影，質控點區域的寬為80個像素，迭代統計圖像中80像素寬的區域的信號值，信號值最大且位置在最左邊即為探針陣列的質控點區域，通過輪廓搜索識別質控點，根據行列信息擬合橫向縱向的直線生成探針網格，根據間距和正常點輪廓信息尋找確定陣列的其他探針點。考慮到制備探針陣列時的點樣誤差可能導致排列不完全規則，軟件會在網格交叉點周圍10個像素范圍內繼續搜索，判別是否存在排列不規則的探針點。使用本算法對于陣列的定位結果如圖 5所示。
圖5
微陣列圖像垂直投影和定位結果圖
Figure5.
Vertical projection and location of microarray image
2.3 信號值的采集、分析與結果輸出
本設備通過檢測玻璃材質生物芯片上的探針陣列的色斑強度和分布實現檢測目的。因此選擇陣列色斑的透光率做為作為信號源，透射率越低信號值越強。設備校準后透光率為100%，通過16次曝光采樣反相得到基準采樣值為138。信號值的計算公式見式(1)：
| $ Val = k*\sum\limits_{i = 1}^{16} {\left( {{B_i} - {S_i}} \right)*138} $ |
其中Val為信號值，Si為信號點采樣值，Bi為背景采樣值，k為背光校正系數。
識讀儀讀取的信號是前景信號與背景信號的疊加值，信號值需要減去背景值[13]。為了消除背景不均一的影響，信號值處理時減去的是自適應背景值，即統計信號點所在局部區域背景值取平均。設備讀取的信號值最終傳到個人電腦(personal computer, PC)，PC端軟件根據芯片的類型，自動計算各探針點信號比值，通過與實驗統計確定的純合/雜合基因判定閾值進行比較分析，判定所檢測各基因類型并自動以表格形式輸出結果。
3 檢測實驗及結果
3.1 實驗材料和儀器
透射率為35.6%、55.4%和75.4%標準透射灰度板購自上海百傲科技股份有限公司。標準格式芯片購自上海百傲科技股份有限公司，是將合成的寡核酸探針溶解，經紫外分光光度計標定濃度，稀釋成8個濃度梯度，固定在醛基基片上，制成4行6列的芯片，將芯片與含有0.01 μmol/L生物素標記的互補探針進行雜交顯色反應，形成顏色深淺不同的圓點微陣列，其信號值可測量。上海市第一人民醫院檢驗科提供的ALDH2 (Glu504Lys)基因、CYP2C19基因、MTHFR (C677T)基因檢測芯片樣本各200張。BE-2.0生物芯片識讀儀購自上海百傲科技股份有限公司。
3.2 性能實驗
3.2.1 光學誤差
本設備選用透光率值這一光學信號作為信號源，計算光學誤差可驗證設備讀值準確性。方法為對計量過的3階標準透射灰度板，每個重復測量透光率三次，計算每個透射灰度板的測量誤差，誤差=每三次均值－標定值，結果見表 2。分別計算得到光學誤差為0%、0%、0.1%，因此本設備取值準確可靠。
表2
標準透射灰度板重復性測量數據
Table2.
Data of standard gray sheet
3.2.2 線性范圍和重復性CV值
顯色生物芯片判型是以不同濃度探針信號值作為依據，這就要求儀器可以識別不同濃度探針形成的斑點信號值。通過線性范圍的計算，可以驗證此性能，同時也說明了其檢測的動態范圍。方法為測量標準格式芯片上1~8號探針點信號值，計算線性相關系數R的平方值，Xi為探針濃度的對數值, Yi為每個探針對應三個點的信號平均值，見式(2)，結果見表 3。
表3
標準格式芯片測量數據
Table3.
Data of standard format chip
用CV值來標定設備檢測的均勻性。方法為在相同測量條件下，重復測量標準格式芯片5次。由于5號探針濃度位于中間，芯片點樣儀在點樣時濃度穩定可控，因此在本實驗中以5號探針三個點信號平均值(yi)作為單次測量信號值，計算5次測量的CV值(離散系數)，
從實驗結果看本設備的線性范圍接近0.99，可以識別不同濃度探針形成的斑點信號值，檢測動態范圍大，CV值為1.096 1%，能夠滿足基因檢測臨床實驗的要求。
| $ {R^2} = {\left[{\frac{{n\sum\limits_{i = 1}^n {{x_i}{y_i}} - \sum\limits_{i = 1}^n {{x_i}} \bullet \sum\limits_{i = 1}^n {{y_i}} }}{{\sqrt {n\sum\limits_{i = 1}^n {x_i^2} - {{\left( {\sum\limits_{i = 1}^n {{x_i}} } \right)}^2}} \bullet \sqrt {n\sum\limits_{i = 1}^n {y_i^2} - {{\left( {\sum\limits_{i = 1}^n {{y_i}} } \right)}^2}} }}} \right]^2} $ |
| $ {\text{CV = }}\frac{{\sqrt {\left( {\sum\limits_{i = 1}^5 {{y_i} - \bar y} } \right)/4} }}{{\bar y}} $ |
3.3 芯片檢測比較實驗
3.3.1 檢測結果對比
分別用批準上市的BE-2.0生物芯片識讀儀和本文設計的生物芯片識讀儀對來自臨床實驗室的三種顯色生物芯片樣本進行檢測，通過檢出率評價兩種設備的檢測性能。
(1)CYP2C19檢測結果：按照CYP2C19的*1、*2和*3三個等位基因的組進行劃分[14]，兩者均檢出的有195例，兩者檢出結果100%相同，其中*1/*1型71例，*1/*2型89例，*1/*3型16例，*2/*2型16例，*3/*3型0例，*2/*3型3例。剩余5例樣本，2例樣本檢測前雜交顯色實驗失敗；3例樣本檢出結果不一致，這3例樣本BE-2.0檢出為*1/*1型但結果報警待驗證，本文設備檢出均為*1/*1型。
(2)ALDH2檢測結果：兩者均檢出的有192例，檢測結果100%相同，其中Glu504Glu型131例，Glu504Lys型55例，TT型6例。剩余8例樣本中，2例樣本檢測前雜交顯色實驗失敗；6例檢出結果不一致，3例樣本BE-2.0檢出結果為Glu504Glu型但結果報警待驗證，而本文設備檢出為Glu504Glu型，另3例樣本BE-2.0檢出為Glu504Lys型，本文設備為Glu504Lys但結果顯示報警待驗證。
(3)MTHFR檢測結果：兩者均檢出的有189例，兩者檢出結果100%相同，其中CC型49例，CT型90例，TT型50例。剩余11例樣本，5例樣本檢測前雜交顯色實驗失敗；6例樣本檢出結果不一致，5例樣本BE-2.0檢出為CT型但結果報警待驗證，而本文設備檢出為CT型，另1例樣本BE-2.0檢出為TT型，本文設備檢出為TT型但結果報警待驗證。
(4)不一致樣本測序結果：對上述三種芯片中15例不一致樣本，提取樣本血液DNA送交測序，2例測序失敗，獲得13例測序結果。13例中，3例為*1/*1型，3例為Glu504Glu型，5例為CT型，這11例與本文設備檢出結果相同；1例為Glu504Lys型，1例為TT型，這2例與BE-2.0檢出結果相同。
3.3.2 檢測結果分析
對于9例檢測前雜交顯色實驗失敗的樣本和2例測序失敗樣本，在臨床實驗中均需重新檢測，且因為實驗因素和設備性能無關，所以去除這11例樣本統計檢出率。結合均檢出的576例樣本和13例測序結果樣本計算檢出率，BE-2.0為98.1%(578/589)，本文設備為99.7%(587/589)。從檢出率上看，本文設備檢測性能優于BE-2.0型識讀儀。
4 討論和結論
對于此類設備而言，信號采集模塊的性能指標直接影響檢測圖像的最終成像質量。目前的顯色成像檢測設備使用線性CCD作為光學傳感器(如BE-2.0生物芯片識讀儀)，它使用電機帶作為傳動裝置移動線性CCD對芯片上的信號探針進行逐排掃描，一張芯片檢測大概需要耗時三分鐘，一次只能檢測單張芯片。本研究使用CCD相機作為圖像傳感器，該相機圖像傳感器體積小，極大地節省了空間；使用了大視場焦平面調整技術和自動聚焦技術，檢測分辨率可達1 μm/pixel，單次檢測區域可以覆蓋整張芯片；而且CCD相機成像質量優良，即使在低照度環境下優勢依然明顯。采用本文設備一次檢測8張生物芯片，8張芯片的總檢測時間縮短為一分半鐘。采用LAN RJ45接口與PC端進行數據傳輸，設備應用廣泛。本設備采用多次曝光疊加成像技術增強了前后景的對比度，采用邊緣檢測劃定輪廓識別信號點的算法，對于點樣誤差、實驗條件變化、背景污染等導致的芯片檢測圖像質量差，有較好的自動識別能力，特別是對弱信號的檢出率較高。在信號點識別方面引入了條形碼，代替了微陣列圖像處理中手動輸入陣列信息的步驟，提高了設備自動化程度和軟件識別準確性。
本識讀儀實現了從圖像獲取和處理、數據分析到結果輸出的全自動的過程，這極大地提高了實驗人員的工作效率，通過性能研究實驗和比較研究實驗證明了該設備的檢測準確性、穩定性、可靠性以及與同類型設備相比優勢明顯，實用性極強，非常適合于臨床診斷。
