本研究目的為獲得不同濃度唑來膦酸對破骨細胞抑制作用的特征及最低有效濃度。取 C57 小鼠骨髓單核細胞并誘導分化破骨細胞。實驗組分別加入唑來膦酸的濃度為 1×10–8、1×10–7、1×10–6、1×10–5、1×10–4 mol/L；同時設置不含任何雙膦酸鹽的對照組。計數多核細胞、通過濾網細胞、附壁細胞、骨吸收陷窩，觀察不同濃度唑來膦酸對破骨細胞抑制作用的特征。發現唑來膦酸抑制體外破骨細胞形成的最低有效濃度為 1×10–6 mol/L；在 1×10–5 mol/L 濃度下抑制破骨細胞遷移和骨吸收的作用更為顯著；在 1×10–4 mol/L 濃度下效果進一步增強，但高濃度唑來膦酸抑制破骨細胞能力的增強已趨于平緩。提示臨床應用中要注意選擇合適濃度和劑量的唑來膦酸進行治療。
引用本文： 李鵬飛, 楊虎, 賈楠, 靳憲輝, 許道寬, 沈亞欣. 基于唑來膦酸對破骨細胞抑制特征的實驗研究. 生物醫學工程學雜志, 2017, 34(1): 78-82. doi: 10.7507/1001-5515.201601041 復制
引言
唑來膦酸屬于第三代雙膦酸鹽，可靜脈應用[1]。目前普遍應用于抗骨質疏松、抗骨質破壞的臨床治療中[2]，在治療骨巨細胞瘤、骨轉移癌等方面取得滿意療效。唑來膦酸是目前已知的最強雙膦酸鹽藥物，藥效作用強大[3]。文獻報道唑來膦酸預防及治療骨相關事件很有效，在其他雙膦酸鹽類藥物治療失效時，換用唑來膦酸仍能緩解骨痛[4]。雙膦酸鹽類藥物作用特點與劑量相關，即劑量越大藥效越強[5]。但本課題組早期應用唑來膦酸治療癌性骨痛研究中，應用 4 mg劑量時改善率為85.5%，8 mg時為80.1%；并且發現大劑量應用唑來膦酸并沒有達到預期臨床療效，但大劑量應用唑來膦酸時不良反應較突出。同時，文獻報道唑來膦酸在腎臟代謝的半衰期明顯長于同代雙膦酸鹽類藥物（如伊班膦酸），對腎臟的毒性相對較大[6]。本課題組認為唑來膦酸對破骨細胞的抑制作用特征尚未明確，臨床應用缺乏科學的理論依據。所以本研究通過分析比較不同濃度唑來膦酸對破骨細胞活性的影響程度，獲得其抑制作用特征及最低有效濃度，為臨床治療工作提供科學的理論依據。
1 實驗材料與方法
1.1 實驗材料與儀器
課題組 C57 小鼠來自河北醫科大學，一級實驗動物；實驗通過河北醫科大學動物實驗中心批準。唑來膦酸（國藥集團國瑞藥業）；集落刺激因子-1（colony stimulating factor 1，CSF-1，Peprotech，Rocky Hills，NC，US）、NF-κB 受體活化因子（recep-tor activator for nuclearfactor-κB ligand，RANKL，Sigma Ltd.，US）、α-MEM 培養基（α-modified mini-mal essential medium，α-MEM，Gibco BRL Ltd.，US）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，Sigma，Ltd.，US）、TRAP 試劑盒（Sigma，Ltd.，US），8×10–6 m 孔徑濾網（Costar，Boston，MA，US）、光學顯微鏡（Nikon TE2000-S，Nikon Inc.，NY，US）、Imaging-Pro 圖像處理軟件（Media Cybernetics Inc.，US）、SPSS 19.0 統計軟件（version 19.0，SPSS Inc.，Chicago，IL，US）。
1.2 破骨細胞分離和培養
實驗中處置 6 周齡 C57 小鼠符合動物倫理學，致死后無菌條件下取其前肢肱骨和后肢長骨骨髓，并離心沉淀骨髓單核細胞（bone marrow mononu-clear cells，BMMNCs）。在配制的 α-MEM 培養液中將 BMMNCs 培養 3 d，其中 α-MEM 培養液含有 10% FBS、3×10–5 g/L CSF-1、2×10–5 g/L RANKL。在破骨細胞培養的第 4 天，實驗組分別加入 1×10–8、1×10–7、1×10–6、1×10–5、1×10–4 mol/L 濃度的唑來磷酸溶液；對照組中應用同等量磷酸鹽緩沖液。同時調整 α-MEM 培養液并繼續培養 5 d，此時 α-MEM 培養液含有 4×10–5 g/L CSF-1 和 6×10–5 g/L RANKL。
1.3 破骨細胞 TRAP 染色處理
破骨細胞培養結束后（5 d），培養板細胞通過 4%多聚甲醛溶液固定，應用乙醇丙酮混合液處理。進行 TRAP 染色之后光學顯微鏡下觀察制圖；應用 Imaging-Pro 軟件計算 TRAP 陽性細胞數量。
1.4 破骨細胞黏附性觀察
離心沉淀 BMMNCs 接種于 96 孔培養板，并放置骨片。實驗組含有濃度分別為 1×10–8、1×10–7、1×10–6、1×10–5、1×10–4 mol/L 唑來膦酸溶液，對照組中應用同等量磷酸鹽緩沖液。孵育 40 min，應用 pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液反復沖洗去掉游離細胞，觀察附壁 TRAP 陽性細胞并計算數量。在光學顯微鏡下分別觀察 1×10–8、1×10–7、1×10–6、1×10–5、1×10–4 mol/L 唑來膦酸組及對照組破骨細胞結構的變化。
1.5 破骨細胞遷移性觀察
應用 8×10–6 m 孔徑 Transwell 系統（8×10–6 m 孔徑濾網，Costar，Boston，MA）分析并測量破骨細胞活動性。實驗組含有濃度分別為 1×10–8、1×10–7、1×10–6、1×10–5、1×10–4 mol/L 唑來膦酸溶液，對照組為同等量磷酸鹽緩沖液；六組均加入 3×10–5 g/L CSF-1。分出相同量破骨細胞，加于 Transwell 系統濾網上，光學顯微鏡下觀察通過 Transwell 系統濾網的破骨細胞并計算數量。
1.6 破骨細胞骨吸收性觀察
BMMNCs 接種于 96 孔培養板，并放置骨片；添加 4×10–5 g/L CSF-1 和 6×10–5 g/L RANKL。實驗組含有濃度分別為 1×10–8、1×10–7、1×10–6、1×10–5、1×10–4 mol/L 唑來膦酸溶液，對照組為同等量磷酸鹽緩沖液；放置于 37 ℃、體積分數為 0.05 的濕化CO2培養箱內飽和溫度下孵育 5 d，應用 pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液反復沖洗去掉骨板上的破骨細胞，應用四硼 酸鈉（濃度0.005 g/L）、甲苯胺藍（濃度0.01 g/L）染色，光學顯微鏡下觀察骨吸收陷窩（How-ship陷窩）的數量，并計算 Howship 陷窩所占面積的百分比。
1.7 統計學分析
應用 SPSS19.0 進行實驗數據的統計學分析，計量數據用均數±標準差表示，6 組間整體情況比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 Student-Newman-Keuls（SNK）多重比較檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 破骨細胞形態學觀察
破骨細胞體積較大，形態不規則，有短突起，細胞內有多核，在顯微鏡下呈現較清晰的輪廓。可見破骨細胞侵蝕骨板，在骨板上形成 Howship 陷窩。Howship 陷窩大小形態各異，觀察有圓形、橢圓形及不規則形。對照組破骨細胞體積、形態觀察情況良好；而 1×10–6 mol/L 實驗組多核細胞在唑來膦酸作用下體積明顯減小，突起變短甚至消失（見圖 1）。
圖1
1×10–6 mol/L 濃度唑來膦酸對體外培養破骨細胞的抑制作用
Figure1.
Inhibition of zoledronic acid with concentration of 1×10–6 mol/L on osteoclasts in vitro
2.2 破骨細胞 TRAP 染色觀察
顯微鏡下觀察 1×10–8、1×10–7、1×10–6、1×10–5、1×10–4 mol/L 唑來磷酸組及對照組均可見 TRAP 陽性細胞。同對照組相比，實驗組唑來膦酸在 1×10–8 mol/L、1×10–7 mol/L 濃度下對破骨細胞形成抑制作用尚不明顯。1×10–6 mol/L 濃度時抑制作用開始明顯增強，為最低有效濃度。1×10–5 mol/L 濃度下，破骨細胞生成被顯著抑制，在1×10–4 mol/L 濃度下效果進一步增強，但其抑制破骨細胞能力的增強已趨于平緩。見表 1。
表1
不同濃度唑來膦酸對體外培養破骨細胞抑制作用比較（n=3，）
Table1.
Comparison of inhibition effects of different concentrations of zoledronic acid on osteoclasts in vitro (n=3, )
對照組與最低有效濃度 1×10–6 mol/L 組的 TRAP 染色結果見圖 1。對照組破骨細胞體積較大，細胞質豐富，胞漿內有紅色陽性顆粒及棕紅色沉淀，形態不規則，有短突起，細胞內有多核，呈現較清晰輪廓。1×10–6 mol/L 實驗組多核細胞輪廓較清晰，但體積明顯減小且無明顯突起。
2.3 唑來膦酸對破骨細胞黏附性的影響
破骨細胞黏附性是發揮骨吸收功能的基本條件，也是細胞遷移及發揮功能的調節因素。實驗組唑來膦酸 1×10–8 mol/L、1×10–7 mol/L 濃度下對破骨細胞黏附性未見明顯抑制作用。1×10–6 mol/L 濃度時抑制作用開始明顯增強，為最低有效濃度。然而 1×10–4 mol/L 濃度唑來膦酸抑制破骨細胞黏附性的效果與 1×10–5 mol/L 濃度進行組間比較，差異無統計學意義。見表 1。
對照組與最低有效濃度 1×10–6 mol/L 組的 TRAP 染色結果見圖 1。對照組附壁 TRAP 陽性細胞數量較多，且密度大。實驗組多核細胞在 1×10–6 mol/L 濃度時細胞的黏附性被明顯抑制，可見附壁破骨細胞數量明顯減少，分布稀疏。
2.4 唑來膦酸對破骨細胞遷移性的影響
破骨細胞遷移性對其發揮骨趨化作用起重要影響。通過觀察 Transwell 系統濾網的破骨細胞數量，對遷移細胞數量進行計數。對實驗組進行組內比較發現：實驗組唑來膦酸在 1×10–8 mol/L、1×10–7 mol/L 濃度下對破骨細胞遷移性的影響尚不明顯；唑來膦酸濃度為 1×10–6 mol/L 時可明顯降低細胞遷移性，為最低有效濃度；1×10–5 mol/L、1×10–4 mol/L 濃度下抑制破骨細胞遷移作用逐漸增強，但其抑制能力的增強已趨于平緩。見表 1。
對照組與最低有效濃度 1×10–6 mol/L 組的 TRAP 染色結果見圖 1。對照組通過 Transwell 系統濾網的破骨細胞數量多，觀察破骨細胞可見明顯偽足變化，胞體收縮。1×10–6 mol/L 實驗組唑來膦酸對破骨細胞遷移性的抑制作用明顯增強，可見主動穿過小孔發生遷移活動的破骨細胞數量明顯減少，胞體及偽足變化相對不明顯，遷移活動性下降。
2.5 唑來膦酸對破骨細胞溶骨性的影響
實驗組唑來膦酸在 1×10–8 mol/L 濃度下對破骨細胞侵蝕骨板的能力起到抑制作用，但仍可見較深的 Howship 陷窩。1×10–6 mol/L 的唑來膦酸可明顯抑制破骨細胞的溶骨作用，為最低有效濃度。1×10–4 mol/L 濃度唑來膦酸抑制破骨細胞溶骨性的能力比 1×10–5 mol/L 濃度稍增強，但其增強已趨于平緩。見表 1。
對照組與最低有效濃度 1×10–6 mol/L 組的四硼酸鈉-甲苯胺藍染色結果見圖 1。對照組存在明顯的 Howship 陷窩，其長度和深度均明顯超過實驗組。對照組 Howship 陷窩數量多，呈現橢圓形、梅花形或串珠狀，陷窩較深，范圍較大并且重疊。唑來膦酸濃度為 1×10–6 mol/L 時，破骨細胞溶骨性被顯著抑制，可見 Howship 陷窩的表面積小、明顯變淺，且數量明顯減少。
3 討論
雙膦酸鹽類藥物與焦磷酸一樣，能緊密地吸附在羥磷灰石的表面并結合，使羥磷灰石與磷酸鈣互相轉變的雙向過程被抑制[7]。雙膦酸鹽抗骨吸收的機制為：① 改變破骨細胞的形態學，從而抑制其功能；② 與骨基質理化結合，直接干擾骨吸收；③ 抑制成骨細胞介導的細胞因子如白細胞介素-6、腫瘤壞死因子的產生[8]。雙膦酸鹽在骨內半衰期長，能吸附在礦物質的結合位點上，從而干擾破骨細胞附著，導致破骨細胞超微結構變化而喪失功能。同時，雙膦酸鹽可抑制成骨細胞產生的細胞因子而阻止破骨細胞修復，誘導破骨細胞的凋亡。并且在抑制腫瘤細胞的濃度下不呈現任何細胞毒作用[9]。本研究中所應用的唑來膦酸為第三代雙膦酸鹽類藥物，含有氮原子的同時含有雜環結構，藥效作用明顯。
唑來膦酸抑制破骨細胞作用的特點與藥物濃度有關[10]，即藥效隨濃度的增加作用逐漸增強。但課題組早期臨床應用唑來膦酸治療癌性骨痛研究中，4 mg 劑量下改善率為 85.5%，8 mg 劑量下為 80.1%，可見大劑量應用唑來膦酸并沒有達到預期效果。在本次試驗中，唑來膦酸在 1×10–6 mol/L 濃度下對破骨細胞生成、黏附、遷移、溶骨的抑制性作用明顯增強，為最低有效濃度。 1×10–6 mol/L 濃度唑來膦酸抑制破骨細胞的黏附性和溶骨性與更高濃度的 1×10–5 mol/L 組、1×10–4 mol/L 組比較，差異沒有統計學意義；1×10–6 mol/L 濃度下唑來膦酸對破骨細胞的抑制作用已經非常明顯， Howship 陷窩的數量明顯減少，而 1×10–5 mol/L 和 1×10–4 mol/L 高濃度下雖然抑制作用亦有增強，但差異亦無統計學意義。
唑來膦酸在 1×10–5 mol/L 和 1×10–4 mol/L 高濃度下對破骨細胞的抑制性進一步增強，這與藥物隨濃度的增加作用逐漸增強的理論一致；但本課題組發現在最低有效濃度 1×10–6 mol/L 下，唑來膦酸抑制破骨細胞的能力已經明顯增強，而更高濃度唑來膦酸對破骨細胞抑制作用的增強已趨于平緩，這可以解釋在臨床應用大劑量唑來膦酸并沒有取得預期療效的現象。提示臨床靜脈應用唑來膦酸應選取合適的劑量，達到其有效治療濃度即可；首次靜脈應用唑來膦酸可適當加大劑量，之后維持有效治療濃度，不必大劑量長療程應用。而且唑來膦酸的不良反應與使用劑量和療程相關，因此選擇合適用量的唑來膦酸對降低不良反應事件發生率具有臨床意義。
綜上所述，此次實驗證明不同濃度唑來膦酸對破骨細胞活性的影響程度不同，高濃度抑制作用更強，但 1×10–6 mol/L 濃度的唑來膦酸即有明顯的抗破骨細胞作用，更高濃度時抑制破骨細胞能力的增強則趨于平緩，提示臨床應用中應注意選擇合適劑量濃度和療程的唑來膦酸用于治療。但是，針對不同疾病仍需進一步的臨床藥學、影像學及病理學研究總結治療方法。
引言
唑來膦酸屬于第三代雙膦酸鹽，可靜脈應用[1]。目前普遍應用于抗骨質疏松、抗骨質破壞的臨床治療中[2]，在治療骨巨細胞瘤、骨轉移癌等方面取得滿意療效。唑來膦酸是目前已知的最強雙膦酸鹽藥物，藥效作用強大[3]。文獻報道唑來膦酸預防及治療骨相關事件很有效，在其他雙膦酸鹽類藥物治療失效時，換用唑來膦酸仍能緩解骨痛[4]。雙膦酸鹽類藥物作用特點與劑量相關，即劑量越大藥效越強[5]。但本課題組早期應用唑來膦酸治療癌性骨痛研究中，應用 4 mg劑量時改善率為85.5%，8 mg時為80.1%；并且發現大劑量應用唑來膦酸并沒有達到預期臨床療效，但大劑量應用唑來膦酸時不良反應較突出。同時，文獻報道唑來膦酸在腎臟代謝的半衰期明顯長于同代雙膦酸鹽類藥物（如伊班膦酸），對腎臟的毒性相對較大[6]。本課題組認為唑來膦酸對破骨細胞的抑制作用特征尚未明確，臨床應用缺乏科學的理論依據。所以本研究通過分析比較不同濃度唑來膦酸對破骨細胞活性的影響程度，獲得其抑制作用特征及最低有效濃度，為臨床治療工作提供科學的理論依據。
1 實驗材料與方法
1.1 實驗材料與儀器
課題組 C57 小鼠來自河北醫科大學，一級實驗動物；實驗通過河北醫科大學動物實驗中心批準。唑來膦酸（國藥集團國瑞藥業）；集落刺激因子-1（colony stimulating factor 1，CSF-1，Peprotech，Rocky Hills，NC，US）、NF-κB 受體活化因子（recep-tor activator for nuclearfactor-κB ligand，RANKL，Sigma Ltd.，US）、α-MEM 培養基（α-modified mini-mal essential medium，α-MEM，Gibco BRL Ltd.，US）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，Sigma，Ltd.，US）、TRAP 試劑盒（Sigma，Ltd.，US），8×10–6 m 孔徑濾網（Costar，Boston，MA，US）、光學顯微鏡（Nikon TE2000-S，Nikon Inc.，NY，US）、Imaging-Pro 圖像處理軟件（Media Cybernetics Inc.，US）、SPSS 19.0 統計軟件（version 19.0，SPSS Inc.，Chicago，IL，US）。
1.2 破骨細胞分離和培養
實驗中處置 6 周齡 C57 小鼠符合動物倫理學，致死后無菌條件下取其前肢肱骨和后肢長骨骨髓，并離心沉淀骨髓單核細胞（bone marrow mononu-clear cells，BMMNCs）。在配制的 α-MEM 培養液中將 BMMNCs 培養 3 d，其中 α-MEM 培養液含有 10% FBS、3×10–5 g/L CSF-1、2×10–5 g/L RANKL。在破骨細胞培養的第 4 天，實驗組分別加入 1×10–8、1×10–7、1×10–6、1×10–5、1×10–4 mol/L 濃度的唑來磷酸溶液；對照組中應用同等量磷酸鹽緩沖液。同時調整 α-MEM 培養液并繼續培養 5 d，此時 α-MEM 培養液含有 4×10–5 g/L CSF-1 和 6×10–5 g/L RANKL。
1.3 破骨細胞 TRAP 染色處理
破骨細胞培養結束后（5 d），培養板細胞通過 4%多聚甲醛溶液固定，應用乙醇丙酮混合液處理。進行 TRAP 染色之后光學顯微鏡下觀察制圖；應用 Imaging-Pro 軟件計算 TRAP 陽性細胞數量。
1.4 破骨細胞黏附性觀察
離心沉淀 BMMNCs 接種于 96 孔培養板，并放置骨片。實驗組含有濃度分別為 1×10–8、1×10–7、1×10–6、1×10–5、1×10–4 mol/L 唑來膦酸溶液，對照組中應用同等量磷酸鹽緩沖液。孵育 40 min，應用 pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液反復沖洗去掉游離細胞，觀察附壁 TRAP 陽性細胞并計算數量。在光學顯微鏡下分別觀察 1×10–8、1×10–7、1×10–6、1×10–5、1×10–4 mol/L 唑來膦酸組及對照組破骨細胞結構的變化。
1.5 破骨細胞遷移性觀察
應用 8×10–6 m 孔徑 Transwell 系統（8×10–6 m 孔徑濾網，Costar，Boston，MA）分析并測量破骨細胞活動性。實驗組含有濃度分別為 1×10–8、1×10–7、1×10–6、1×10–5、1×10–4 mol/L 唑來膦酸溶液，對照組為同等量磷酸鹽緩沖液；六組均加入 3×10–5 g/L CSF-1。分出相同量破骨細胞，加于 Transwell 系統濾網上，光學顯微鏡下觀察通過 Transwell 系統濾網的破骨細胞并計算數量。
1.6 破骨細胞骨吸收性觀察
BMMNCs 接種于 96 孔培養板，并放置骨片；添加 4×10–5 g/L CSF-1 和 6×10–5 g/L RANKL。實驗組含有濃度分別為 1×10–8、1×10–7、1×10–6、1×10–5、1×10–4 mol/L 唑來膦酸溶液，對照組為同等量磷酸鹽緩沖液；放置于 37 ℃、體積分數為 0.05 的濕化CO2培養箱內飽和溫度下孵育 5 d，應用 pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液反復沖洗去掉骨板上的破骨細胞，應用四硼 酸鈉（濃度0.005 g/L）、甲苯胺藍（濃度0.01 g/L）染色，光學顯微鏡下觀察骨吸收陷窩（How-ship陷窩）的數量，并計算 Howship 陷窩所占面積的百分比。
1.7 統計學分析
應用 SPSS19.0 進行實驗數據的統計學分析，計量數據用均數±標準差表示，6 組間整體情況比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 Student-Newman-Keuls（SNK）多重比較檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 破骨細胞形態學觀察
破骨細胞體積較大，形態不規則，有短突起，細胞內有多核，在顯微鏡下呈現較清晰的輪廓。可見破骨細胞侵蝕骨板，在骨板上形成 Howship 陷窩。Howship 陷窩大小形態各異，觀察有圓形、橢圓形及不規則形。對照組破骨細胞體積、形態觀察情況良好；而 1×10–6 mol/L 實驗組多核細胞在唑來膦酸作用下體積明顯減小，突起變短甚至消失（見圖 1）。
圖1
1×10–6 mol/L 濃度唑來膦酸對體外培養破骨細胞的抑制作用
Figure1.
Inhibition of zoledronic acid with concentration of 1×10–6 mol/L on osteoclasts in vitro
2.2 破骨細胞 TRAP 染色觀察
顯微鏡下觀察 1×10–8、1×10–7、1×10–6、1×10–5、1×10–4 mol/L 唑來磷酸組及對照組均可見 TRAP 陽性細胞。同對照組相比，實驗組唑來膦酸在 1×10–8 mol/L、1×10–7 mol/L 濃度下對破骨細胞形成抑制作用尚不明顯。1×10–6 mol/L 濃度時抑制作用開始明顯增強，為最低有效濃度。1×10–5 mol/L 濃度下，破骨細胞生成被顯著抑制，在1×10–4 mol/L 濃度下效果進一步增強，但其抑制破骨細胞能力的增強已趨于平緩。見表 1。
表1
不同濃度唑來膦酸對體外培養破骨細胞抑制作用比較（n=3，）
Table1.
Comparison of inhibition effects of different concentrations of zoledronic acid on osteoclasts in vitro (n=3, )
對照組與最低有效濃度 1×10–6 mol/L 組的 TRAP 染色結果見圖 1。對照組破骨細胞體積較大，細胞質豐富，胞漿內有紅色陽性顆粒及棕紅色沉淀，形態不規則，有短突起，細胞內有多核，呈現較清晰輪廓。1×10–6 mol/L 實驗組多核細胞輪廓較清晰，但體積明顯減小且無明顯突起。
2.3 唑來膦酸對破骨細胞黏附性的影響
破骨細胞黏附性是發揮骨吸收功能的基本條件，也是細胞遷移及發揮功能的調節因素。實驗組唑來膦酸 1×10–8 mol/L、1×10–7 mol/L 濃度下對破骨細胞黏附性未見明顯抑制作用。1×10–6 mol/L 濃度時抑制作用開始明顯增強，為最低有效濃度。然而 1×10–4 mol/L 濃度唑來膦酸抑制破骨細胞黏附性的效果與 1×10–5 mol/L 濃度進行組間比較，差異無統計學意義。見表 1。
對照組與最低有效濃度 1×10–6 mol/L 組的 TRAP 染色結果見圖 1。對照組附壁 TRAP 陽性細胞數量較多，且密度大。實驗組多核細胞在 1×10–6 mol/L 濃度時細胞的黏附性被明顯抑制，可見附壁破骨細胞數量明顯減少，分布稀疏。
2.4 唑來膦酸對破骨細胞遷移性的影響
破骨細胞遷移性對其發揮骨趨化作用起重要影響。通過觀察 Transwell 系統濾網的破骨細胞數量，對遷移細胞數量進行計數。對實驗組進行組內比較發現：實驗組唑來膦酸在 1×10–8 mol/L、1×10–7 mol/L 濃度下對破骨細胞遷移性的影響尚不明顯；唑來膦酸濃度為 1×10–6 mol/L 時可明顯降低細胞遷移性，為最低有效濃度；1×10–5 mol/L、1×10–4 mol/L 濃度下抑制破骨細胞遷移作用逐漸增強，但其抑制能力的增強已趨于平緩。見表 1。
對照組與最低有效濃度 1×10–6 mol/L 組的 TRAP 染色結果見圖 1。對照組通過 Transwell 系統濾網的破骨細胞數量多，觀察破骨細胞可見明顯偽足變化，胞體收縮。1×10–6 mol/L 實驗組唑來膦酸對破骨細胞遷移性的抑制作用明顯增強，可見主動穿過小孔發生遷移活動的破骨細胞數量明顯減少，胞體及偽足變化相對不明顯，遷移活動性下降。
2.5 唑來膦酸對破骨細胞溶骨性的影響
實驗組唑來膦酸在 1×10–8 mol/L 濃度下對破骨細胞侵蝕骨板的能力起到抑制作用，但仍可見較深的 Howship 陷窩。1×10–6 mol/L 的唑來膦酸可明顯抑制破骨細胞的溶骨作用，為最低有效濃度。1×10–4 mol/L 濃度唑來膦酸抑制破骨細胞溶骨性的能力比 1×10–5 mol/L 濃度稍增強，但其增強已趨于平緩。見表 1。
對照組與最低有效濃度 1×10–6 mol/L 組的四硼酸鈉-甲苯胺藍染色結果見圖 1。對照組存在明顯的 Howship 陷窩，其長度和深度均明顯超過實驗組。對照組 Howship 陷窩數量多，呈現橢圓形、梅花形或串珠狀，陷窩較深，范圍較大并且重疊。唑來膦酸濃度為 1×10–6 mol/L 時，破骨細胞溶骨性被顯著抑制，可見 Howship 陷窩的表面積小、明顯變淺，且數量明顯減少。
3 討論
雙膦酸鹽類藥物與焦磷酸一樣，能緊密地吸附在羥磷灰石的表面并結合，使羥磷灰石與磷酸鈣互相轉變的雙向過程被抑制[7]。雙膦酸鹽抗骨吸收的機制為：① 改變破骨細胞的形態學，從而抑制其功能；② 與骨基質理化結合，直接干擾骨吸收；③ 抑制成骨細胞介導的細胞因子如白細胞介素-6、腫瘤壞死因子的產生[8]。雙膦酸鹽在骨內半衰期長，能吸附在礦物質的結合位點上，從而干擾破骨細胞附著，導致破骨細胞超微結構變化而喪失功能。同時，雙膦酸鹽可抑制成骨細胞產生的細胞因子而阻止破骨細胞修復，誘導破骨細胞的凋亡。并且在抑制腫瘤細胞的濃度下不呈現任何細胞毒作用[9]。本研究中所應用的唑來膦酸為第三代雙膦酸鹽類藥物，含有氮原子的同時含有雜環結構，藥效作用明顯。
唑來膦酸抑制破骨細胞作用的特點與藥物濃度有關[10]，即藥效隨濃度的增加作用逐漸增強。但課題組早期臨床應用唑來膦酸治療癌性骨痛研究中，4 mg 劑量下改善率為 85.5%，8 mg 劑量下為 80.1%，可見大劑量應用唑來膦酸并沒有達到預期效果。在本次試驗中，唑來膦酸在 1×10–6 mol/L 濃度下對破骨細胞生成、黏附、遷移、溶骨的抑制性作用明顯增強，為最低有效濃度。 1×10–6 mol/L 濃度唑來膦酸抑制破骨細胞的黏附性和溶骨性與更高濃度的 1×10–5 mol/L 組、1×10–4 mol/L 組比較，差異沒有統計學意義；1×10–6 mol/L 濃度下唑來膦酸對破骨細胞的抑制作用已經非常明顯， Howship 陷窩的數量明顯減少，而 1×10–5 mol/L 和 1×10–4 mol/L 高濃度下雖然抑制作用亦有增強，但差異亦無統計學意義。
唑來膦酸在 1×10–5 mol/L 和 1×10–4 mol/L 高濃度下對破骨細胞的抑制性進一步增強，這與藥物隨濃度的增加作用逐漸增強的理論一致；但本課題組發現在最低有效濃度 1×10–6 mol/L 下，唑來膦酸抑制破骨細胞的能力已經明顯增強，而更高濃度唑來膦酸對破骨細胞抑制作用的增強已趨于平緩，這可以解釋在臨床應用大劑量唑來膦酸并沒有取得預期療效的現象。提示臨床靜脈應用唑來膦酸應選取合適的劑量，達到其有效治療濃度即可；首次靜脈應用唑來膦酸可適當加大劑量，之后維持有效治療濃度，不必大劑量長療程應用。而且唑來膦酸的不良反應與使用劑量和療程相關，因此選擇合適用量的唑來膦酸對降低不良反應事件發生率具有臨床意義。
綜上所述，此次實驗證明不同濃度唑來膦酸對破骨細胞活性的影響程度不同，高濃度抑制作用更強，但 1×10–6 mol/L 濃度的唑來膦酸即有明顯的抗破骨細胞作用，更高濃度時抑制破骨細胞能力的增強則趨于平緩，提示臨床應用中應注意選擇合適劑量濃度和療程的唑來膦酸用于治療。但是，針對不同疾病仍需進一步的臨床藥學、影像學及病理學研究總結治療方法。
