本研究旨在探討羥基磷灰石/磷酸三鈣（HA/TCP）生物陶瓷材料植入小鼠體內骨誘導過程中新生血管的形成過程。將 HA/TCP 材料植入小鼠肌肉中，手術后 2、4、6、8、10 和 12 周，收獲材料制備連續切片，通過觀察 HE 染色圖片動態描述新生血管形成過程，并定量分析新生血管形成百分比。結果顯示新生血管形成是一個連續、動態的過程，其在第 2 周時就大量生成，4 周時呈增長趨勢，6 周時達到峰值，8 周后逐步減少。本研究結果為提高骨組織工程成功率提供了思路，也從血管化方面揭示了骨誘導形成的機制。
引用本文： 程麗佳, 鄢碩, 時政, 方依婷, 朱江. 羥基磷灰石/磷酸三鈣生物材料植入小鼠體內的血管化過程. 生物醫學工程學雜志, 2017, 34(1): 83-86. doi: 10.7507/1001-5515.201601007 復制
引言
羥基磷灰石/磷酸三鈣（hydroxyapatite/tricalcium phosphate，HA/TCP）生物陶瓷材料可以在狒狒、豬、狗、兔子、小鼠等多種動物體內誘導異位骨形成，即骨誘導現象[1-2]。利用 HA/TCP 的這種特性，其可以用來修復骨缺損創傷，是一種優良的人工骨[3]，且 HA 和 TCP 比例不同成骨效果亦不同[4]。目前，動物體內骨誘導現象已被廣泛報道，但其骨組織形成動態過程很少被描述；在這個過程中，血管化是新生骨組織形成的基礎，只有通過新生血管供給小分子營養物質，才能促使新生骨組織形成。因此，在異位骨形成過程中必須先要有新生血管的形成。在本研究中，我們將重點關注 HA/TCP 生物陶瓷材料植入小鼠體內后的血管化過程，試圖動態描述骨誘導過程中的血管形成，為骨組織工程提供新的思路。
1 材料和方法
1.1 材料
60HA/40β-TCP 生物陶瓷材料由四川大學生物材料中心制備并提供，其孔隙率約占 50%，孔徑范圍為 300～500 μm。實驗時，將材料制備成 3 mm×5 mm 大小并高溫滅菌后進行移植。
1.2 動物手術
30 只 6 周齡 C57BL/6 小鼠購自成都達碩實驗動物公司，飼養一周后進行手術。首先，用 3% 戊巴比妥鈉（30 mg/kg）對所有動物進行腹腔內麻醉；然后，對所有小鼠的兩側后腿消毒、剃毛和備皮，用剪刀剪開皮膚和肌肉，制備肌袋，然后將 HA/TCP 材料植入肌袋，最后逐層縫合肌肉和皮膚。手術后 2、4、6、8、10 和 12 周，各收獲 5 只小鼠包裹在肌肉中的材料標本置于 10% 中性福爾馬林中固定。
1.3 HE 染色
標本固定后用 pH7.0的 10% 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）脫鈣，流水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，然后制成 5 μm 厚連續切片。切片用蘇木素-伊紅（hema-
1.4 免疫組織化學染色
為了鑒定血管的生成，我們檢測了 HA/TCP 生物陶瓷植入小鼠肌肉中 2、4、6、8 和 10 周后 CD105、CD34 和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）免疫組織化學染色。CD105 是內皮細胞增殖的標志物，其在新生血管內皮細胞中高度表達，而在成熟血管內皮細胞中弱表達或不表達。CD34 是血管內皮細胞的特異性標記物，能標記血管。VEGF 是血管內皮細胞分泌的因子，能促進血管內皮細胞的增殖。切片脫蠟，再水化后用 3% 雙氧水暗室內封閉內源性過氧化物酶 15 min，并放入 Tris-EDTA 中 95 ℃ 水浴 45 min；4 ℃孵育大鼠抗小鼠單克隆抗體 CD105（1∶1 000，Chemicon）、羊抗小鼠單克隆抗體 CD34（1∶2 000，Abcam）和羊抗小鼠單克隆抗體 VEGF（1∶1 000，Abcam）過夜，再室溫孵育辣根過氧化物酶標記的二抗 30 min。最后，切片用 3, 3′-二氨基聯苯胺（3, 3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride，DAB）顯色并在顯微鏡下觀看，若細胞顯棕色則表示相應蛋白呈陽性。
1.5 新生血管定量分析
每個石蠟塊連續切片 5 張，HE 染色切片于顯微鏡下采圖，用 Image-Pro plus6.0 軟件對其中的新生血管面積進行統計，計算每一時間點新生血管的面積百分數，所有數據以均數 ± 標準差表示，應用 SPSS19.0 統計軟件進行分析，所有數據采用 t 檢驗，P<0.05 表示差異有統計學意義。
2 結果
2.1 新生血管形成過程
我們將 HA/TCP 材料移植入小鼠體內 2、4、6、8、10 和 12 周的 HE 切片在顯微鏡下觀察，發現其形成了一個動態鮮明的血管生成過程（見圖 1）。2 周時，由于材料植入時的創傷，大量炎癥因子侵入材料孔隙中，如淋巴細胞、粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等，在局部形成間充質組織。一方面，血管內皮細胞從周圍組織中遷移到材料間隙中，以促進新生血管的形成；另一方面，材料周圍毛細血管侵入材料，在間充質組織區域形成血管網絡。4 周時，血管繼續生長發育，廣泛分布在間充質組織中，為骨組織形成提供營養輸送，也為新生骨組織形成構建雛形。6 周時，隨著成骨細胞分泌膠原物質和礦物質，加上材料降解的鈣、磷離子沉積在膠原物質上，類骨質在毛細血管構建的雛形上慢慢形成，血管叢在類骨質中繼續為骨組織成熟輸送細胞因子和營養成分。8 周時，骨組織繼續發育成熟，成骨細胞線性排列在骨組織周圍，并分泌抗血管生物因子使骨組織無血管化，毛細血管在未骨化的間充質區域重復前述過程。10 和 12 周時，骨陷窩形成，骨組織成熟為板層骨，并誘導骨髓組織生成，骨組織中仍保持無血管化狀態。因此，新生血管僅在成骨早期發揮作用，而骨成熟后就無需其再提供營養輸送。
圖1
HA/TCP 生物陶瓷標本 HE 染色（200×） 圖片顯示 HA/TCP 生物陶瓷植入小鼠肌肉中的血管化過程；箭頭表示血管
Figure1.
HE staining of HA/TCP bioceramic specimen (200×) The micrograph showing the vascularization of HA/TCP biomaterials implanted in muscle of mice. The arrows denoting blood vessels
2.2 血管相關蛋白的表達
CD105 免疫組織化學結果顯示（見圖 2），2 周時大量新生血管形成，之后的時間內新生血管不斷形成，而已形成的新生血管逐漸成熟且 CD105 表達下降。CD34 組化結果顯示，新生血管在材料間隙間的間充質組織中大量形成，6 周時達到最大量。VEGF 免疫組化結果顯示，從第 2 周開始，間充質組織中有大量新生血管形成，到 10 周時，僅位于新生骨組織周邊的血管和間充質組織中的血管表達 VEGF，而骨組織內部無血管生成。
圖2
HA/TCP 生物陶瓷標本免疫組織化學染色（200×） CD105、CD34 和 VEGF 免疫組織化學圖片提示新生血管形成;其中 VEGF 免疫組化結果中材料被非特異性染色
Figure2.
Immunohistochemistry staining of HA/TCP bioceramic specimen (200×) The immunohistochemistry of CD105, CD34 and VEGF indicating the new blood vessel formation. The materials of VEGF group were nonspecifically stained
2.3 新生血管面積百分比
從血管化的動態過程我們可以看出，新生血管在第 2 周時就大量生成；4 周時呈增長趨勢；6 周時達到峰值，與第 2 周相比新生血管面積百分比明顯增多（P<0.05）；8 周后逐步減少，與第2、4、6 周相比明顯減少（P<0.05）（見圖 3）。
圖3
新生血管面積百分比（*P<0.05）
Figure3.
Area percentage of new blood vessels (*P<0.05)
3 討論
臨床上，即使利用人工骨，大范圍、大節段的骨缺損也難以修復，究其原因是因為缺乏支持骨再生的營養分子，而這些營養分子均是通過血管再生來輸送的[5]。因此，了解骨誘導過程中的血管化過程對骨組織工程十分重要。本研究以 HA/TCP 生物陶瓷材料植入小鼠肌肉內骨誘導為基礎，動態描述了此過程中的血管化過程，明確了血管形成的時間和條件，可更好地用于骨組織工程。
血管生成一般分為兩種，一種是由血管內皮祖細胞分化形成新的血管，另一種是已存在的血管通過出芽及微血管融合生長的方式形成新的毛細血管[6]。在本研究中，新生血管形成機制是兩者結合起來實現的。當小鼠機體遭受手術帶來的創傷時，大量炎癥細胞涌入，釋放血管內皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子等促血管生成因子，促進內皮細胞分化形成新的血管；另一方面，手術位點周圍已存在的血管通過出芽的方式也會形成一部分毛細血管。這些新生血管為異位骨組織形成提供了必要的生長因子。本研究中選用 CD105、CD34 和 VEGF 做為鑒定血管生成的標志物，有效地鑒定了新生血管和成熟的血管，動態地描述了骨誘導過程中的血管化過程。骨組織工程是由支架材料、種子細胞和生長因子三種因素共同構成的促進骨組織再生的工程 [7-8]。HA/TCP 生物材料可作為骨組織工程的一種良好的支架材料[9]，由于本研究 HA/TCP 材料的孔徑范圍為 300～500 μm，因此其誘導骨組織形成過程為膜內成骨，而這個孔徑也是最適合血管長入的孔徑[10]。盡管骨組織工程已得到了廣泛的應用，但是假如植入種子細胞離血管距離較遠（大于 200 μm）就難以獲得營養得以存活，如果不能快速建立血管，就難以構建大節段骨組織[11]。因此，根據本研究的提示，我們可以通過復合血管內皮細胞、植入血管束、加入 VEGF 因子等方式，來提高骨組織工程的成功率。同時，本研究也從血管化方面揭示了骨誘導形成的機制。
引言
羥基磷灰石/磷酸三鈣（hydroxyapatite/tricalcium phosphate，HA/TCP）生物陶瓷材料可以在狒狒、豬、狗、兔子、小鼠等多種動物體內誘導異位骨形成，即骨誘導現象[1-2]。利用 HA/TCP 的這種特性，其可以用來修復骨缺損創傷，是一種優良的人工骨[3]，且 HA 和 TCP 比例不同成骨效果亦不同[4]。目前，動物體內骨誘導現象已被廣泛報道，但其骨組織形成動態過程很少被描述；在這個過程中，血管化是新生骨組織形成的基礎，只有通過新生血管供給小分子營養物質，才能促使新生骨組織形成。因此，在異位骨形成過程中必須先要有新生血管的形成。在本研究中，我們將重點關注 HA/TCP 生物陶瓷材料植入小鼠體內后的血管化過程，試圖動態描述骨誘導過程中的血管形成，為骨組織工程提供新的思路。
1 材料和方法
1.1 材料
60HA/40β-TCP 生物陶瓷材料由四川大學生物材料中心制備并提供，其孔隙率約占 50%，孔徑范圍為 300～500 μm。實驗時，將材料制備成 3 mm×5 mm 大小并高溫滅菌后進行移植。
1.2 動物手術
30 只 6 周齡 C57BL/6 小鼠購自成都達碩實驗動物公司，飼養一周后進行手術。首先，用 3% 戊巴比妥鈉（30 mg/kg）對所有動物進行腹腔內麻醉；然后，對所有小鼠的兩側后腿消毒、剃毛和備皮，用剪刀剪開皮膚和肌肉，制備肌袋，然后將 HA/TCP 材料植入肌袋，最后逐層縫合肌肉和皮膚。手術后 2、4、6、8、10 和 12 周，各收獲 5 只小鼠包裹在肌肉中的材料標本置于 10% 中性福爾馬林中固定。
1.3 HE 染色
標本固定后用 pH7.0的 10% 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）脫鈣，流水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，然后制成 5 μm 厚連續切片。切片用蘇木素-伊紅（hema-
1.4 免疫組織化學染色
為了鑒定血管的生成，我們檢測了 HA/TCP 生物陶瓷植入小鼠肌肉中 2、4、6、8 和 10 周后 CD105、CD34 和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）免疫組織化學染色。CD105 是內皮細胞增殖的標志物，其在新生血管內皮細胞中高度表達，而在成熟血管內皮細胞中弱表達或不表達。CD34 是血管內皮細胞的特異性標記物，能標記血管。VEGF 是血管內皮細胞分泌的因子，能促進血管內皮細胞的增殖。切片脫蠟，再水化后用 3% 雙氧水暗室內封閉內源性過氧化物酶 15 min，并放入 Tris-EDTA 中 95 ℃ 水浴 45 min；4 ℃孵育大鼠抗小鼠單克隆抗體 CD105（1∶1 000，Chemicon）、羊抗小鼠單克隆抗體 CD34（1∶2 000，Abcam）和羊抗小鼠單克隆抗體 VEGF（1∶1 000，Abcam）過夜，再室溫孵育辣根過氧化物酶標記的二抗 30 min。最后，切片用 3, 3′-二氨基聯苯胺（3, 3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride，DAB）顯色并在顯微鏡下觀看，若細胞顯棕色則表示相應蛋白呈陽性。
1.5 新生血管定量分析
每個石蠟塊連續切片 5 張，HE 染色切片于顯微鏡下采圖，用 Image-Pro plus6.0 軟件對其中的新生血管面積進行統計，計算每一時間點新生血管的面積百分數，所有數據以均數 ± 標準差表示，應用 SPSS19.0 統計軟件進行分析，所有數據采用 t 檢驗，P<0.05 表示差異有統計學意義。
2 結果
2.1 新生血管形成過程
我們將 HA/TCP 材料移植入小鼠體內 2、4、6、8、10 和 12 周的 HE 切片在顯微鏡下觀察，發現其形成了一個動態鮮明的血管生成過程（見圖 1）。2 周時，由于材料植入時的創傷，大量炎癥因子侵入材料孔隙中，如淋巴細胞、粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等，在局部形成間充質組織。一方面，血管內皮細胞從周圍組織中遷移到材料間隙中，以促進新生血管的形成；另一方面，材料周圍毛細血管侵入材料，在間充質組織區域形成血管網絡。4 周時，血管繼續生長發育，廣泛分布在間充質組織中，為骨組織形成提供營養輸送，也為新生骨組織形成構建雛形。6 周時，隨著成骨細胞分泌膠原物質和礦物質，加上材料降解的鈣、磷離子沉積在膠原物質上，類骨質在毛細血管構建的雛形上慢慢形成，血管叢在類骨質中繼續為骨組織成熟輸送細胞因子和營養成分。8 周時，骨組織繼續發育成熟，成骨細胞線性排列在骨組織周圍，并分泌抗血管生物因子使骨組織無血管化，毛細血管在未骨化的間充質區域重復前述過程。10 和 12 周時，骨陷窩形成，骨組織成熟為板層骨，并誘導骨髓組織生成，骨組織中仍保持無血管化狀態。因此，新生血管僅在成骨早期發揮作用，而骨成熟后就無需其再提供營養輸送。
圖1
HA/TCP 生物陶瓷標本 HE 染色（200×） 圖片顯示 HA/TCP 生物陶瓷植入小鼠肌肉中的血管化過程；箭頭表示血管
Figure1.
HE staining of HA/TCP bioceramic specimen (200×) The micrograph showing the vascularization of HA/TCP biomaterials implanted in muscle of mice. The arrows denoting blood vessels
2.2 血管相關蛋白的表達
CD105 免疫組織化學結果顯示（見圖 2），2 周時大量新生血管形成，之后的時間內新生血管不斷形成，而已形成的新生血管逐漸成熟且 CD105 表達下降。CD34 組化結果顯示，新生血管在材料間隙間的間充質組織中大量形成，6 周時達到最大量。VEGF 免疫組化結果顯示，從第 2 周開始，間充質組織中有大量新生血管形成，到 10 周時，僅位于新生骨組織周邊的血管和間充質組織中的血管表達 VEGF，而骨組織內部無血管生成。
圖2
HA/TCP 生物陶瓷標本免疫組織化學染色（200×） CD105、CD34 和 VEGF 免疫組織化學圖片提示新生血管形成;其中 VEGF 免疫組化結果中材料被非特異性染色
Figure2.
Immunohistochemistry staining of HA/TCP bioceramic specimen (200×) The immunohistochemistry of CD105, CD34 and VEGF indicating the new blood vessel formation. The materials of VEGF group were nonspecifically stained
2.3 新生血管面積百分比
從血管化的動態過程我們可以看出，新生血管在第 2 周時就大量生成；4 周時呈增長趨勢；6 周時達到峰值，與第 2 周相比新生血管面積百分比明顯增多（P<0.05）；8 周后逐步減少，與第2、4、6 周相比明顯減少（P<0.05）（見圖 3）。
圖3
新生血管面積百分比（*P<0.05）
Figure3.
Area percentage of new blood vessels (*P<0.05)
3 討論
臨床上，即使利用人工骨，大范圍、大節段的骨缺損也難以修復，究其原因是因為缺乏支持骨再生的營養分子，而這些營養分子均是通過血管再生來輸送的[5]。因此，了解骨誘導過程中的血管化過程對骨組織工程十分重要。本研究以 HA/TCP 生物陶瓷材料植入小鼠肌肉內骨誘導為基礎，動態描述了此過程中的血管化過程，明確了血管形成的時間和條件，可更好地用于骨組織工程。
血管生成一般分為兩種，一種是由血管內皮祖細胞分化形成新的血管，另一種是已存在的血管通過出芽及微血管融合生長的方式形成新的毛細血管[6]。在本研究中，新生血管形成機制是兩者結合起來實現的。當小鼠機體遭受手術帶來的創傷時，大量炎癥細胞涌入，釋放血管內皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子等促血管生成因子，促進內皮細胞分化形成新的血管；另一方面，手術位點周圍已存在的血管通過出芽的方式也會形成一部分毛細血管。這些新生血管為異位骨組織形成提供了必要的生長因子。本研究中選用 CD105、CD34 和 VEGF 做為鑒定血管生成的標志物，有效地鑒定了新生血管和成熟的血管，動態地描述了骨誘導過程中的血管化過程。骨組織工程是由支架材料、種子細胞和生長因子三種因素共同構成的促進骨組織再生的工程 [7-8]。HA/TCP 生物材料可作為骨組織工程的一種良好的支架材料[9]，由于本研究 HA/TCP 材料的孔徑范圍為 300～500 μm，因此其誘導骨組織形成過程為膜內成骨，而這個孔徑也是最適合血管長入的孔徑[10]。盡管骨組織工程已得到了廣泛的應用，但是假如植入種子細胞離血管距離較遠（大于 200 μm）就難以獲得營養得以存活，如果不能快速建立血管，就難以構建大節段骨組織[11]。因此，根據本研究的提示，我們可以通過復合血管內皮細胞、植入血管束、加入 VEGF 因子等方式，來提高骨組織工程的成功率。同時，本研究也從血管化方面揭示了骨誘導形成的機制。
