在心血管疾病的發生過程中，常出現內皮功能紊亂等初期癥狀，而此過程與一氧化氮（NO）介導的血管舒張密切相關，NO的釋放是由內皮一氧化氮合酶NOS3所調控。近期研究表明，心血管疾病常常伴隨著NOS3基因多態性變化及表觀遺傳學修飾，而現有研究對于NOS3表觀遺傳學及基因多態性對于心血管疾病調控機制及靶向治療研究關注較少。本文綜述了近年來關于NOS3在心血管系統相關疾病中的研究現狀，總結了其在各類疾病發病過程中的分子機制，重點闡述了NOS3蛋白解離、NOS3表觀遺傳修飾及多態性在心血管疾病發生發展中的作用，并為相關疾病藥物開發的治療靶點設計提供參考。
引用本文： 孫婷, 池晴佳, 王貴學. NOS3 參與心血管疾病調控機制研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(1): 188-192. doi: 10.7507/1001-5515.20160034 復制
引言
心血管疾病包含著內皮功能紊亂、血管新生、血栓形成、血壓升高等一系列病變。成血管化及成血管過程的穩定與否決定著心血管疾病的發生發展狀況。在血管生成過程中，人血管內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS,NOS3)誘導釋放的內皮型一氧化氮(nitric oxide，NO)可以促進血管舒張，參與血管生成的調控。在心血管疾病發展過程中，常常伴有NOS3基因表達受限或促進，從而導致生成NO的量不穩定，進而有可能出現血管內皮功能紊亂，導致動脈粥樣硬化及高血壓等疾病發生。
在哺乳動物中，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)有三種形式：神經型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS，NOS1)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS，NOS2)和NOS3。NOS家族均為二聚體結構，每個多肽鏈含有兩個主要的功能區域，即羰基末端的氧化區域和氨基末端的還原區域[1-2]。它們通過相同的作用途徑來釋放NO，但由于在不同位置表達，在生物體中也分別發揮不同的作用[3]。其中NOS1主要在腦部神經系統中特異性表達，調節各種平滑肌的緊實度，使肌肉松弛[4]。NOS2在正常生物體中幾乎沒有表達，在抵御外來因素入侵時，它才會表現出活性，在巨噬細胞中大量表達生成NO[4]，直接干擾靶細胞的DNA從而致使其斷裂呈碎片[3]。NOS3大部分在內皮細胞中表達，同時在心肌細胞、血小板及腦部某些神經元中也有表達[5]。NOS3的活性受Ca2+濃度的調控，當胞內Ca2+濃度升高時，Ca2+誘導鈣調蛋白與NOS3二聚體結合，促進NOS3活性升高并刺激產生NO[6]。此外，血流剪切力通過使NOS3磷酸化來影響NOS3的功能[7]。在哺乳動物中，NOS3主要通過生成NO參與調節血管生成及抑制血小板凝聚、抑制白細胞黏附等重要生理過程。
NOS3蛋白的解離是造成NO合成不足的主要因素之一，NO的不足引起NO依賴的血管內皮功能紊亂，有可能導致多種病癥的發生。近年來研究發現，NOS3的表觀遺傳學變化及組蛋白轉錄后修飾也與多種疾病的發生有密切關系。也有研究發現，冠心病、中風、心肌梗死、前列腺癌及小兒急性淋巴細胞白血病等多種疾病均與NOS3基因的多態性有一定關聯，其具體機制還未闡明。本文總結了近年來NOS3參與心血管疾病發展過程的相關研究，重點闡述NOS3蛋白解離、NOS3表觀遺傳學變化及基因多態性與疾病發生的關系，進而為相關疾病的治療靶點研究及相應藥物開發提供參考。
1 NOS3參與心血管疾病發展的調控機制
人類的NOS3基因位于染色體7p35-p36區，包括26個外顯子，全長21 kb，其蛋白eNOS大小為135 kD，包含有1 203個氨基酸。在生理條件下，血管中的NO主要被NOS3釋放產生。NOS3受剪切力和血管舒緩激肽及乙酰膽堿等激動劑刺激，釋放NO以促進血管舒張，抑制血小板聚集和黏附，參與內皮祖細胞的活化、平滑肌細胞增殖等調控過程[8]，同時也參與多種疾病的發病及抑制進程。
1.1 NOS3蛋白二聚體解離
NOS3蛋白二聚體的解離受多種因素的影響。NOS3蛋白中，多個絲氨酸、蘇氨酸位點的磷酸化和二氫葉酸還原酶的降表達直接導致四氫生物喋呤(tetrahydrobiopterin,BH4)的缺乏，從而導致NOS3二聚體解離。另有近期研究發現，氧化應激及S-谷胱甘肽化在NOS3介導的動脈疾病中高頻率出現，氧化應激及S-谷胱甘肽化導致NOS3蛋白解離而致使多種心血管疾病的產生。
內皮細胞響應血流刺激，通過調控NOS3來釋放血管舒張劑NO進而調節血管生成，同時誘導產生的NO也會擴散入血液中抑制血小板聚集和黏附，不僅可以防止血栓形成，同時也阻止了因血小板誘導的生長因子釋放導致的平滑肌細胞增殖及基質的產生[9]。正常生理條件下，NOS3蛋白產生的NO在內皮層功能維持中有重要作用。在血管中，多種酶類包括NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶、解離的NOS3蛋白及線粒體呼吸鏈均會產生活性氧。同時，血管系統中也存在抗氧化系統，包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽氧化酵素及對氧磷酶等來消耗這些活性氧，達到平衡。血液中膽固醇過多會導致血管中NO生物利用率降低，且伴隨游離的活性氧增加，活性氧過多會導致脂蛋白和磷脂的氧化，導致動脈硬化。活性氧的增加會將原有的NO被快速氧化而失活，NO被氧化的產物——過氧亞硝基導致BH4的氧化，而缺少BH4會導致NOS3蛋白二聚體的解離，減少NOS3蛋白誘導的NO生成[10]，從而降低對血管內壁的保護。同時，NOS3蛋白的解離使其不再生成NO而是生成超氧化物O2-，從而導致更加嚴重的內皮功能紊亂，引起動脈粥樣硬化及高脂血癥等[11]。
在正常血管中，伴隨著L-精氨酸和BH4的消耗以及精氨酸甲基化水平的提高，NOS3解偶聯會引起氧化應激反應。在細胞信號和適應過程中存在一種可逆的蛋白質修飾——硫醇類蛋白質發生S-谷胱甘肽化。研究發現NOS3的S-谷胱甘肽化會可逆性地降低NOS3的活性。在NOS3功能維持中有兩個高度保守的半胱氨酸殘基(與FMN的和與FAD的結合域)是不可或缺的，這兩個位點對于NOS3的氧化還原功能調節至關重要，S-谷胱甘肽化通過這兩個半胱氨酸殘基來調節NOS3的功能。高血壓患者的血管中由于儲存了大量的硫醇類特異性還原劑，導致內皮細胞中的NOS3的 S-谷胱甘肽化提高。NOS3的S-谷胱甘肽化提高進而導致NO合成的不足同時伴有過氧化物O2-的過度生成，導致內皮依賴的血管舒張受損，進一步導致炎性反應、內皮受損等一系列心血管疾病的產生。研究人員在患有高血壓病癥的大鼠血管進行免疫組化實驗，發現大量的S-谷胱甘肽與NOS3一起被共定位在內皮層，而正常的大鼠血管中僅有少量的S-谷胱甘肽，在體證實了高血壓發展過程中NOS3被S-谷胱甘肽化，進而調節細胞信號轉導、內皮功能及血管舒張等過程[12]。此外，其他還原劑也能通過其他途徑如S-亞硝基化作用等還原NOS3，參與調控高血壓發病的病理過程。
1.2 NOS3基因的表觀遺傳修飾
NOS3的表達部分由表觀遺傳學修飾調控，包括基因啟動子區域的甲基化及組蛋白乙酰化等。眾所周知，基因的DNA甲基化程度決定了基因的轉錄水平，甲基化程度越高，其mRNA水平的表達越低。在NOS3低表達的細胞中，NOS3啟動子區域呈現高度甲基化狀態，而在NOS3高表達的細胞類型中，NOS3啟動子區域幾乎全部為去甲基化狀態。體外實驗表明，NOS3基因在未分化的早期內皮祖細胞及CD34+造血祖細胞和中期成血管細胞中呈高度甲基化，而在分化的內皮細胞[臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)及微血管內皮細胞等]中呈極低甲基化[13]，通過去甲基化可以提高NOS3低表達的細胞中NOS3的表達情況[14]。某些NOS3甲基化水平異常與心血管疾病發生有密切關系。
近期研究表明，小兒阻塞性睡眠呼吸綜合征患者中可出現內皮功能紊亂現象，而這一現象是由NOS3表達的降低導致的，進一步研究發現，該表達降低是通過-171位CpG位點的甲基化造成的[15]。研究人員分別測定了正常胎兒和宮內生長受限胎兒的臍動脈內皮細胞(human umbilical artery endothelial cells,HUAEC)和HUVEC中NOS3的甲基化狀態。發現與正常懷孕的對照組相比，患病胎兒的HUAEC中NOS3蛋白和mRNA水平表達均增加，HUVEC中NOS3蛋白和mRNA水平表達均降低。患病胎兒HUAEC中NOS3甲基化程度較對照組降低，患病胎兒HUVEC中NOS3甲基化程度較對照組升高，且CpG-352位點甲基化在患病胎兒的HUAEC中表達低于對照組，但在其HUVEC中CpG-352位點甲基化水平高于對照組[16]。此外，研究表明，NOS3甲基化狀態與肥胖癥也有一定聯系，且胎兒時期的NOS3甲基化狀態與未成年時期的骨密度也有一定關聯[15, 17-18]。
在NOS3啟動子區域有多個組蛋白修飾位點，不同的組蛋白修飾導致不同細胞類型中特異性的DNA轉錄水平，進而來調控不同類型細胞中NOS3的表達。NOS3的內皮特異性表達被細胞特異性的組蛋白修飾所調控，在NOS3基因啟動子區域檢測到了大量的組蛋白修飾位點，它們均與NOS3轉錄調控有關。缺氧狀態下，細胞中組蛋白脫乙酰酶Jmjd3表達升高，導致NOS3組蛋白乙酰化降低進而抑制NOS3基因的表達，造成內皮功能紊亂[13]。研究人員構建了新生兒持續性肺動脈高壓大鼠模型，通過染色體免疫共沉淀發現，在患者發病過程中伴隨著NOS3表達變化，而此變化是通過表觀遺傳學機制來調控的。患病組中組蛋白H3和組蛋白H4的乙酰化水平顯著高于對照組[19]。Won等[20]通過在小鼠中開展ChIP實驗，發現DJ-1/park7可以通過調控NOS3中-138和-291啟動子區域的乙酰化來改變NOS3的表達，進一步調節血管舒張及血壓。
1.3 NOS3基因多態性
1998年，NOS3的一些多態性位點被科學家所發現，經后續研究表明，多種疾病的發生發展與NOS3基因的多態性密切相關。在NOS3基因中目前已發現多個多態性位點，包括外顯子7中G894T(rs1799983)突變，內含子4位置有27 bp的可變數目串聯重復區域(NOS3的4a4b多態性)(rs61722009)，啟動子區域的T-786C突變(rs2070744)和內含子23的G/T突變等。其中外顯子7中的G894T突變使其編碼的氨基酸序列發生改變(Glu298-Asp)，研究人員分別對三種形式(GG，GT和TT)的個體進行了統計分析，研究表明，此突變有可能與冠心病、中風、心肌梗死及前列腺癌[21-22]等相關。在對妊娠高血壓患者的研究中，發現晚期妊娠高血壓患病者中894TT頻率明顯高于正常對照組[23]，對中國大陸漢族孕婦的研究中也發現妊娠高血壓患者中298Asp等位基因頻率明顯降低[24]。也有研究發現，894GT和TT人群體重指數(body mass index,BMI)也較GG人群偏高[25]。另外，內含子4a4b多態性在所有人種的糖尿病患者中均存在[26]。在對突尼斯人群患心肌梗死的情況開展調查分析后發現，突尼斯心肌梗死患者與其NOS3內含子4a4b多態性存在聯系，其患病者等位基因為4a的概率顯著高于健康的對照組[27]。同時，在妊娠高血壓患者分析中，早期妊娠高血壓患者出現aa的頻率顯著高于對照組，晚期妊娠高血壓中單體b出現的頻率較高[23]。在T-786C多態性位點的個體中，由于其位于基因的啟動子區域，突變有可能會調節NOS3基因的表達。研究發現，在等位基因位置核苷酸為C的個體出現動脈粥樣硬化疾病及冠心病的概率要顯著高于T的個體[28]，TC雜合及CC純合的個體更容易發生偏頭痛[25]，且此多態性與高血壓及心肌梗死等均相關[28]。
由于NOS3的多態性，其突變也會造成多種癌癥的發生。小兒急性淋巴細胞白血病容易復發也與NOS3多態性有密切關系，由于NOS3具有多個單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位點，這為NOS3基因的多種突變提供了極大可能。
2 基于NOS3靶點治療的展望
關于心血管疾病的治療，目前已有一些治療手段通過臨床前動物實驗，也有一些正在臨床試驗中鑒定。以前的治療方法包括直接吸入NO或者用可以釋放NO的藥物來短暫、快速地促進動脈血管舒張。分析NOS3參與心血管疾病的分子機制以及一些信號途徑相關的靶點，或許可以作為相關疾病治療的依據。
首先，氧化應激可以導致血管系統中NO被快速氧化，通過S-谷胱甘肽化、S-亞硝基化等途徑導致NOS3二聚體解離。緩解氧化應激反應可以作為治療內皮功能紊亂的靶點之一。由此可以從以下方面來考慮治療靶點設計：①通過還原劑來中和血管系統中多余的超氧化物，使NO功能恢復正常，起到保護血管的作用；也可以通過抑制S-谷胱甘肽化、S-亞硝基化等還原反應來抑制氧化應激對于NOS3酶系統造成的進一步破壞[29]。②抑制NOS3二聚體解離可成為一個靶點，其中包括抑制BH4的氧化或者補充一定量的BH4，或者補充L-精氨酸的含量，使其保持足夠濃度來參與NOS3二聚體形成，保持其NOS3生成NO的能力，進而保護血管系統[30]。
同時，NOS3基因的表觀遺傳修飾機制也有待深入研究。NOS3基因的多態性尤其是單核苷酸多態性很有可能在NOS3基因啟動子區域產生額外的甲基化位點，使得基因多態性與表觀遺傳變化建立聯系。表觀遺傳學修飾會在轉錄水平調節NOS3基因的表達，進而調控下游NOS3蛋白表達，影響NO的生成，進而參與各種生理病理過程。在某些疾病易感人群中研究人員發現了其NOS3甲基化水平的不同，這一點可以為相關疾病風險預測提供有力工具，以期從源頭上避免疾病的產生。同時，通過定點甲基化或者去甲基化工具來調節NOS3的表達也可作為相關疾病治療可以考慮的因素。
關于NOS3多態性與各類疾病的關系是一個非常值得深入研究的問題。目前的研究還在統計分析階段，由于各個群體基因的不同，也由于每個研究選取的標準不同，研究人員得出的結論大多存在爭議。且由于NOS3多態性與各類疾病關系的具體機制還未闡明，這將是探究心血管疾病發生機制的一個重要研究方向。
3 結語
NOS3在生物體中是至關重要的調節基因，其不僅與高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病及冠心病等疾病相關，還與多種腫瘤、肥胖癥及胎兒宮內生長受限等多種疾病有一定關聯。NOS3蛋白解離、NOS3基因表觀遺傳學修飾及其多態性與各類疾病關系的機制還未闡明，關于NOS3多態性、表觀遺傳機制等與心血管疾病的關系還需要科學家們更深入的研究，同時基于各類調控機制的藥物靶點設計也是未來相關研究發展的方向。
引言
心血管疾病包含著內皮功能紊亂、血管新生、血栓形成、血壓升高等一系列病變。成血管化及成血管過程的穩定與否決定著心血管疾病的發生發展狀況。在血管生成過程中，人血管內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS,NOS3)誘導釋放的內皮型一氧化氮(nitric oxide，NO)可以促進血管舒張，參與血管生成的調控。在心血管疾病發展過程中，常常伴有NOS3基因表達受限或促進，從而導致生成NO的量不穩定，進而有可能出現血管內皮功能紊亂，導致動脈粥樣硬化及高血壓等疾病發生。
在哺乳動物中，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)有三種形式：神經型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS，NOS1)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS，NOS2)和NOS3。NOS家族均為二聚體結構，每個多肽鏈含有兩個主要的功能區域，即羰基末端的氧化區域和氨基末端的還原區域[1-2]。它們通過相同的作用途徑來釋放NO，但由于在不同位置表達，在生物體中也分別發揮不同的作用[3]。其中NOS1主要在腦部神經系統中特異性表達，調節各種平滑肌的緊實度，使肌肉松弛[4]。NOS2在正常生物體中幾乎沒有表達，在抵御外來因素入侵時，它才會表現出活性，在巨噬細胞中大量表達生成NO[4]，直接干擾靶細胞的DNA從而致使其斷裂呈碎片[3]。NOS3大部分在內皮細胞中表達，同時在心肌細胞、血小板及腦部某些神經元中也有表達[5]。NOS3的活性受Ca2+濃度的調控，當胞內Ca2+濃度升高時，Ca2+誘導鈣調蛋白與NOS3二聚體結合，促進NOS3活性升高并刺激產生NO[6]。此外，血流剪切力通過使NOS3磷酸化來影響NOS3的功能[7]。在哺乳動物中，NOS3主要通過生成NO參與調節血管生成及抑制血小板凝聚、抑制白細胞黏附等重要生理過程。
NOS3蛋白的解離是造成NO合成不足的主要因素之一，NO的不足引起NO依賴的血管內皮功能紊亂，有可能導致多種病癥的發生。近年來研究發現，NOS3的表觀遺傳學變化及組蛋白轉錄后修飾也與多種疾病的發生有密切關系。也有研究發現，冠心病、中風、心肌梗死、前列腺癌及小兒急性淋巴細胞白血病等多種疾病均與NOS3基因的多態性有一定關聯，其具體機制還未闡明。本文總結了近年來NOS3參與心血管疾病發展過程的相關研究，重點闡述NOS3蛋白解離、NOS3表觀遺傳學變化及基因多態性與疾病發生的關系，進而為相關疾病的治療靶點研究及相應藥物開發提供參考。
1 NOS3參與心血管疾病發展的調控機制
人類的NOS3基因位于染色體7p35-p36區，包括26個外顯子，全長21 kb，其蛋白eNOS大小為135 kD，包含有1 203個氨基酸。在生理條件下，血管中的NO主要被NOS3釋放產生。NOS3受剪切力和血管舒緩激肽及乙酰膽堿等激動劑刺激，釋放NO以促進血管舒張，抑制血小板聚集和黏附，參與內皮祖細胞的活化、平滑肌細胞增殖等調控過程[8]，同時也參與多種疾病的發病及抑制進程。
1.1 NOS3蛋白二聚體解離
NOS3蛋白二聚體的解離受多種因素的影響。NOS3蛋白中，多個絲氨酸、蘇氨酸位點的磷酸化和二氫葉酸還原酶的降表達直接導致四氫生物喋呤(tetrahydrobiopterin,BH4)的缺乏，從而導致NOS3二聚體解離。另有近期研究發現，氧化應激及S-谷胱甘肽化在NOS3介導的動脈疾病中高頻率出現，氧化應激及S-谷胱甘肽化導致NOS3蛋白解離而致使多種心血管疾病的產生。
內皮細胞響應血流刺激，通過調控NOS3來釋放血管舒張劑NO進而調節血管生成，同時誘導產生的NO也會擴散入血液中抑制血小板聚集和黏附，不僅可以防止血栓形成，同時也阻止了因血小板誘導的生長因子釋放導致的平滑肌細胞增殖及基質的產生[9]。正常生理條件下，NOS3蛋白產生的NO在內皮層功能維持中有重要作用。在血管中，多種酶類包括NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶、解離的NOS3蛋白及線粒體呼吸鏈均會產生活性氧。同時，血管系統中也存在抗氧化系統，包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽氧化酵素及對氧磷酶等來消耗這些活性氧，達到平衡。血液中膽固醇過多會導致血管中NO生物利用率降低，且伴隨游離的活性氧增加，活性氧過多會導致脂蛋白和磷脂的氧化，導致動脈硬化。活性氧的增加會將原有的NO被快速氧化而失活，NO被氧化的產物——過氧亞硝基導致BH4的氧化，而缺少BH4會導致NOS3蛋白二聚體的解離，減少NOS3蛋白誘導的NO生成[10]，從而降低對血管內壁的保護。同時，NOS3蛋白的解離使其不再生成NO而是生成超氧化物O2-，從而導致更加嚴重的內皮功能紊亂，引起動脈粥樣硬化及高脂血癥等[11]。
在正常血管中，伴隨著L-精氨酸和BH4的消耗以及精氨酸甲基化水平的提高，NOS3解偶聯會引起氧化應激反應。在細胞信號和適應過程中存在一種可逆的蛋白質修飾——硫醇類蛋白質發生S-谷胱甘肽化。研究發現NOS3的S-谷胱甘肽化會可逆性地降低NOS3的活性。在NOS3功能維持中有兩個高度保守的半胱氨酸殘基(與FMN的和與FAD的結合域)是不可或缺的，這兩個位點對于NOS3的氧化還原功能調節至關重要，S-谷胱甘肽化通過這兩個半胱氨酸殘基來調節NOS3的功能。高血壓患者的血管中由于儲存了大量的硫醇類特異性還原劑，導致內皮細胞中的NOS3的 S-谷胱甘肽化提高。NOS3的S-谷胱甘肽化提高進而導致NO合成的不足同時伴有過氧化物O2-的過度生成，導致內皮依賴的血管舒張受損，進一步導致炎性反應、內皮受損等一系列心血管疾病的產生。研究人員在患有高血壓病癥的大鼠血管進行免疫組化實驗，發現大量的S-谷胱甘肽與NOS3一起被共定位在內皮層，而正常的大鼠血管中僅有少量的S-谷胱甘肽，在體證實了高血壓發展過程中NOS3被S-谷胱甘肽化，進而調節細胞信號轉導、內皮功能及血管舒張等過程[12]。此外，其他還原劑也能通過其他途徑如S-亞硝基化作用等還原NOS3，參與調控高血壓發病的病理過程。
1.2 NOS3基因的表觀遺傳修飾
NOS3的表達部分由表觀遺傳學修飾調控，包括基因啟動子區域的甲基化及組蛋白乙酰化等。眾所周知，基因的DNA甲基化程度決定了基因的轉錄水平，甲基化程度越高，其mRNA水平的表達越低。在NOS3低表達的細胞中，NOS3啟動子區域呈現高度甲基化狀態，而在NOS3高表達的細胞類型中，NOS3啟動子區域幾乎全部為去甲基化狀態。體外實驗表明，NOS3基因在未分化的早期內皮祖細胞及CD34+造血祖細胞和中期成血管細胞中呈高度甲基化，而在分化的內皮細胞[臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)及微血管內皮細胞等]中呈極低甲基化[13]，通過去甲基化可以提高NOS3低表達的細胞中NOS3的表達情況[14]。某些NOS3甲基化水平異常與心血管疾病發生有密切關系。
近期研究表明，小兒阻塞性睡眠呼吸綜合征患者中可出現內皮功能紊亂現象，而這一現象是由NOS3表達的降低導致的，進一步研究發現，該表達降低是通過-171位CpG位點的甲基化造成的[15]。研究人員分別測定了正常胎兒和宮內生長受限胎兒的臍動脈內皮細胞(human umbilical artery endothelial cells,HUAEC)和HUVEC中NOS3的甲基化狀態。發現與正常懷孕的對照組相比，患病胎兒的HUAEC中NOS3蛋白和mRNA水平表達均增加，HUVEC中NOS3蛋白和mRNA水平表達均降低。患病胎兒HUAEC中NOS3甲基化程度較對照組降低，患病胎兒HUVEC中NOS3甲基化程度較對照組升高，且CpG-352位點甲基化在患病胎兒的HUAEC中表達低于對照組，但在其HUVEC中CpG-352位點甲基化水平高于對照組[16]。此外，研究表明，NOS3甲基化狀態與肥胖癥也有一定聯系，且胎兒時期的NOS3甲基化狀態與未成年時期的骨密度也有一定關聯[15, 17-18]。
在NOS3啟動子區域有多個組蛋白修飾位點，不同的組蛋白修飾導致不同細胞類型中特異性的DNA轉錄水平，進而來調控不同類型細胞中NOS3的表達。NOS3的內皮特異性表達被細胞特異性的組蛋白修飾所調控，在NOS3基因啟動子區域檢測到了大量的組蛋白修飾位點，它們均與NOS3轉錄調控有關。缺氧狀態下，細胞中組蛋白脫乙酰酶Jmjd3表達升高，導致NOS3組蛋白乙酰化降低進而抑制NOS3基因的表達，造成內皮功能紊亂[13]。研究人員構建了新生兒持續性肺動脈高壓大鼠模型，通過染色體免疫共沉淀發現，在患者發病過程中伴隨著NOS3表達變化，而此變化是通過表觀遺傳學機制來調控的。患病組中組蛋白H3和組蛋白H4的乙酰化水平顯著高于對照組[19]。Won等[20]通過在小鼠中開展ChIP實驗，發現DJ-1/park7可以通過調控NOS3中-138和-291啟動子區域的乙酰化來改變NOS3的表達，進一步調節血管舒張及血壓。
1.3 NOS3基因多態性
1998年，NOS3的一些多態性位點被科學家所發現，經后續研究表明，多種疾病的發生發展與NOS3基因的多態性密切相關。在NOS3基因中目前已發現多個多態性位點，包括外顯子7中G894T(rs1799983)突變，內含子4位置有27 bp的可變數目串聯重復區域(NOS3的4a4b多態性)(rs61722009)，啟動子區域的T-786C突變(rs2070744)和內含子23的G/T突變等。其中外顯子7中的G894T突變使其編碼的氨基酸序列發生改變(Glu298-Asp)，研究人員分別對三種形式(GG，GT和TT)的個體進行了統計分析，研究表明，此突變有可能與冠心病、中風、心肌梗死及前列腺癌[21-22]等相關。在對妊娠高血壓患者的研究中，發現晚期妊娠高血壓患病者中894TT頻率明顯高于正常對照組[23]，對中國大陸漢族孕婦的研究中也發現妊娠高血壓患者中298Asp等位基因頻率明顯降低[24]。也有研究發現，894GT和TT人群體重指數(body mass index,BMI)也較GG人群偏高[25]。另外，內含子4a4b多態性在所有人種的糖尿病患者中均存在[26]。在對突尼斯人群患心肌梗死的情況開展調查分析后發現，突尼斯心肌梗死患者與其NOS3內含子4a4b多態性存在聯系，其患病者等位基因為4a的概率顯著高于健康的對照組[27]。同時，在妊娠高血壓患者分析中，早期妊娠高血壓患者出現aa的頻率顯著高于對照組，晚期妊娠高血壓中單體b出現的頻率較高[23]。在T-786C多態性位點的個體中，由于其位于基因的啟動子區域，突變有可能會調節NOS3基因的表達。研究發現，在等位基因位置核苷酸為C的個體出現動脈粥樣硬化疾病及冠心病的概率要顯著高于T的個體[28]，TC雜合及CC純合的個體更容易發生偏頭痛[25]，且此多態性與高血壓及心肌梗死等均相關[28]。
由于NOS3的多態性，其突變也會造成多種癌癥的發生。小兒急性淋巴細胞白血病容易復發也與NOS3多態性有密切關系，由于NOS3具有多個單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位點，這為NOS3基因的多種突變提供了極大可能。
2 基于NOS3靶點治療的展望
關于心血管疾病的治療，目前已有一些治療手段通過臨床前動物實驗，也有一些正在臨床試驗中鑒定。以前的治療方法包括直接吸入NO或者用可以釋放NO的藥物來短暫、快速地促進動脈血管舒張。分析NOS3參與心血管疾病的分子機制以及一些信號途徑相關的靶點，或許可以作為相關疾病治療的依據。
首先，氧化應激可以導致血管系統中NO被快速氧化，通過S-谷胱甘肽化、S-亞硝基化等途徑導致NOS3二聚體解離。緩解氧化應激反應可以作為治療內皮功能紊亂的靶點之一。由此可以從以下方面來考慮治療靶點設計：①通過還原劑來中和血管系統中多余的超氧化物，使NO功能恢復正常，起到保護血管的作用；也可以通過抑制S-谷胱甘肽化、S-亞硝基化等還原反應來抑制氧化應激對于NOS3酶系統造成的進一步破壞[29]。②抑制NOS3二聚體解離可成為一個靶點，其中包括抑制BH4的氧化或者補充一定量的BH4，或者補充L-精氨酸的含量，使其保持足夠濃度來參與NOS3二聚體形成，保持其NOS3生成NO的能力，進而保護血管系統[30]。
同時，NOS3基因的表觀遺傳修飾機制也有待深入研究。NOS3基因的多態性尤其是單核苷酸多態性很有可能在NOS3基因啟動子區域產生額外的甲基化位點，使得基因多態性與表觀遺傳變化建立聯系。表觀遺傳學修飾會在轉錄水平調節NOS3基因的表達，進而調控下游NOS3蛋白表達，影響NO的生成，進而參與各種生理病理過程。在某些疾病易感人群中研究人員發現了其NOS3甲基化水平的不同，這一點可以為相關疾病風險預測提供有力工具，以期從源頭上避免疾病的產生。同時，通過定點甲基化或者去甲基化工具來調節NOS3的表達也可作為相關疾病治療可以考慮的因素。
關于NOS3多態性與各類疾病的關系是一個非常值得深入研究的問題。目前的研究還在統計分析階段，由于各個群體基因的不同，也由于每個研究選取的標準不同，研究人員得出的結論大多存在爭議。且由于NOS3多態性與各類疾病關系的具體機制還未闡明，這將是探究心血管疾病發生機制的一個重要研究方向。
3 結語
NOS3在生物體中是至關重要的調節基因，其不僅與高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病及冠心病等疾病相關，還與多種腫瘤、肥胖癥及胎兒宮內生長受限等多種疾病有一定關聯。NOS3蛋白解離、NOS3基因表觀遺傳學修飾及其多態性與各類疾病關系的機制還未闡明，關于NOS3多態性、表觀遺傳機制等與心血管疾病的關系還需要科學家們更深入的研究，同時基于各類調控機制的藥物靶點設計也是未來相關研究發展的方向。