本文研究了膽囊收縮素(CCK)誘導的急性胰腺炎對ICR小鼠自發性活動自由節律的影響，分析生物節律與炎癥性疾病及急性胰腺炎病理機制的相互關系。通過對全黑狀態下的轉輪甄別活動相和休息相行CCK誘導的急性胰腺炎造模，對比造模后的炎癥程度以及兩組前后周期、相位等節律指標的變化。結果發現相同劑量的急性胰腺炎ICR小鼠模型，休息相造模組比活動相造模組炎癥程度重；且急性胰腺炎ICR小鼠活動節律的周期延長，在休息相造模組尤為明顯。研究表明CCK誘導的急性胰腺炎可影響ICR小鼠的自由活動節律，且自由運轉狀態下不同相位造模時炎癥輕重有明顯區別，為急性胰腺炎重癥化趨勢的病理機制研究提供了可能的線索。
引用本文： 李永紅, 楊小平, 郭盼盼, 劉延友, 嚴洪立, 李率真, 關俊文. 膽囊收縮素誘導的急性胰腺炎對小鼠自由節律的影響研究*. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(1): 115-119. doi: 10.7507/1001-5515.20160021 復制
引言
生物體內多數生理生化過程都存在大約以24小時為周期的變化，即近日節律，使得生物體能更好地適應外界環境改變。近日節律的破壞會造成多種生理功能的失調，對生物體的健康產生極其嚴重的影響。許多研究已經發現近日節律的變化與多種疾病相關。有報道證實炎癥反應的高低與機體內源糖皮質激素分泌的晝夜節律有關[1]。Sadki等[2]報道腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎癥因子水平的增加會影響視交叉上核（suprachiasmatic nucleus,SCN）節律輸出從而加速老化。Cavadini等[3]研究發現炎癥產生的TNF-α通過抑制節律基因的表達引起疲勞。Jaworek等[4]發現蛙皮素誘發的胰腺炎大鼠病情存在近日節律，根據造模時間不同有晝重夜輕現象，與褪黑素濃度調控有關。
急性胰腺炎是臨床常見的急腹癥，其中20%左右屬重癥急性胰腺炎，病情兇險，死亡率很高，其發病機制尚未闡明，導致臨床治療缺乏特異性手段[5]。建立合適的胰腺炎動物模型對研究該病的發病機制是非常必要的，而且有助于開展潛在治療手段的研究[6]。動物的活動具有明顯的節律性，在持續黑暗狀態下的活動節律稱為自由運行節律（free-running rhythm），簡稱自由節律（free rhythm）。自由節律是一種特殊功能狀態的近日節律，在這種狀態下給于相應的刺激，能夠很好地研究機體節律對刺激的反應[7]。膽囊收縮素（cholecystokinin,CCK）有很強的促胰酶釋放作用，在非侵入性實驗性急性胰腺炎方法中，CCK及其類似物雨蛙素超大劑量腹腔注射是目前最為成熟、應用最多的模型[8]，該模型操作簡便、易于復制、重復性好,同時對節律的人為干擾較小。基于此，本研究建立自由運行狀態下的膽囊收縮素誘導急性胰腺炎小鼠模型（cholecystokinin-induced acute pancreatitis,CIP）作為急性胰腺炎動物行為研究平臺，從整體水平研究急性胰腺炎與生物節律的相關性，為今后進一步深入研究打下基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
ICR小鼠（雄性，3周齡，體重18～20 g，清潔級）由四川醫學科學院實驗動物中心提供。
1.1.2 實驗試劑及檢測裝置
200 μg/kg CCK、抗小鼠TNF-α、抗小鼠白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、酶聯免疫吸附試劑盒（enzyme linked immunosorbent，ELISA）購于R&D公司；4%甲醛、生理鹽水、TMB試劑盒購于武漢博士德生物公司。活動性檢測系統設備包括：含有轉輪的環境條件控制盒（轉輪直徑為15 cm，控制盒大小為45 cm×35 cm×30 cm），安裝紅外線檢測裝置及數據分析系統，安裝自動控制光源，由四川大學時間生物學衛生部重點實驗室設計，成都信息工程大學物理場生物效應及儀器四川高校重點實驗室制作。
1.2 方法
1.2.1 動物預處理
小鼠適應性喂養2周，常規飼料及飲水，飼養環境為清潔級。飼養環境溫度22～25 ℃，濕度55%～65%。控制環境噪音。LD12/12狀態（光照：12 h；黑暗：12 h）2周后進入持續黑暗（double dark,DD)狀態(持續黑暗24 h)。LD12/12狀態于8∶00至20∶00光照，于20∶00至8∶00黑暗。DD狀態的日常飼養和換料：在微弱紅光下3天換食物，7天更換墊料。
1.2.2 小鼠的篩選及分組
對進入DD兩周后的小鼠用活動圖結合活動數據進行Halberg余弦擬合分析，篩選出有節律（Halberg余弦擬合P＜0.05為有節律）的小鼠80只，隨機分成4組，每組20只，分別為休息相對照組（R-Control）、活動相對照組（A-Control）、 休息相模型組（R-CIP）和活動相模型組（A-CIP）。模型組分別在休息相或活動相注射CCK建立胰腺炎動物模型，對照組以生理鹽水為對照。上述每組隨機挑選10只小鼠于造模12 h后采樣，進行胰腺炎生化指標和病理組織學檢測；另外10只繼續DD狀態下輪轉實驗兩周。
1.2.3 胰腺炎造模
模型組給予200 μg/kg CCK腹腔注射三次，間隔1 h[8-9]，對照組用等量的生理鹽水腹腔注射三次，間隔1 h。活動相組為18∶00開始注射，休息相組為6∶00點開始注射。小鼠在造模前節食16 h自由飲水，造模操作在微弱紅光下進行。
1.2.4 胰腺炎生化指標、病理組織學檢測
造模12 h后斷頸眼眶取血2 mL，同時取胰腺放入4%甲醛固定。血液標本送往四川大學華西婦女兒童醫院生化檢驗室檢測血清淀粉酶（amylase,AMY)、脂肪酶(lipase,LIP)。采用雙抗夾心ELISA法檢測TNF-α，加入辣根過氧化物酶標記的抗小鼠TNF-α，加入TMB顯色,小鼠TNF-α的濃度與OD（450 nm）成正比。采用雙抗夾心ABC-ELISA法檢測LI-1β，用抗小鼠IL-1β單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的IL-1β與單抗結合，通過繪制標準曲線求出標本中IL-1β濃度。
胰腺HE染色病理切片的制作：將固定24 h后的胰腺標本取出，石蠟包埋，切片，切片厚度為2 μm，連續4張，行HE染色后送四川大學華西醫院病理科，由同一病理醫師采用單盲法于光鏡下觀察組織病理學改變。胰腺組織半定量積分參照Rongione標準[10]按水腫、炎性細胞浸潤、出血、壞死評分，最重者給4分，正常者0分。
1.2.5 小鼠活動性檢測
環境條件控制盒控制環境溫度為(22±2) ℃，隔離外界噪音和光線，并按實驗設計自動提供光暗循環。紅外線檢測裝置和數據分析系統分別采集和分析數據。自動連續檢測轉輪的轉數，以反映小鼠的活動性。系統每3 min自動記錄1次數據并儲存，然后用活動圖余弦擬合對進入DD兩周后小鼠的活動數據進行近日節律分析。觀察期DD狀態下輪轉實驗數據采集及分析同前，時間為兩周。
1.3 統計方法
采用SPSS13.0和明尼蘇達大學Halberg余弦分析包統計軟件進行處理，計量資料用均數±標準差(
2 結果
2.1 不同時相造模對炎癥程度的影響
2.1.1 淀粉酶、脂肪酶比較
R-CIP組淀粉酶、脂肪酶均明顯高于對照組（P值均＜0.01），A-CIP組淀粉酶、脂肪酶亦明顯高于對照組（P值均＜0.05)；不同相位造模，R-CIP組的淀粉酶、脂肪酶均明顯高于A-CIP組（P值均＜0.05)，R-Control與A-Control比較則沒有明顯差別（P值均＞0.05），如圖 1所示。
圖1
R-Control、A-Control、R-CIP組及A-CIP淀粉酶、脂肪酶比較（與對照組比較，＊
＊
2.1.2 胰腺病理評分比較
如表 1所示，R-CIP組水腫、炎癥浸潤、出血、壞死、總積分明顯高于對照組（P值均＜0.01），A-CIP組亦明顯高于對照組（P值均＜0.05）；而不同相位造模，R-CIP組的水腫、炎癥浸潤、總積分均明顯高于A-CIP組（P值均＜0.05），R-Control組與A-Control組比較則沒有明顯差別（P值均＞0.05）。
表1
各組胰腺病理評分的比較（2.1.3 血清炎性介質TNF-α、LI-1β比較
R-CIP組的TNF-α、LI-1β濃度均明顯高于對照組（P值均＜0.01），A-CIP組亦明顯高于對照組（P值均＜0.05）；不同相位造模，A-CIP組的TNF-α、LI-1β濃度明顯低于R-CIP組（P值均＜0.05），R-Control組與A-Control組比較則沒有明顯差別（P值均＞0.05），如圖 2所示。
圖2
對照組、R-CIP組及A-CIP治療組炎性介質比較（與對照組比較，＊
＊
2.2 不同時相造模對活動節律的影響
2.2.1 輪轉活動圖
小鼠活動性檢測結果如圖 3所示。
圖3
小鼠輪轉活動圖
Figure3.
Rotation activity diagram of mise
圖 3(a)、(b)分別為A-CIP、R-CIP造模組的代表小鼠活動圖，從圖中可直觀看出注射CCK前，其始動點均規律往左移動即前移，而注射后其始動點均不同程度的往右移動即后移，這提示其活動周期延長。其中圖 3(a)有3天左右其始動點沒有像造模前第二天相對第一天前移的情況，這提示其活動周期等于或大于24 h，從第五天開始始動點恢復前移。圖 3(b)有4天左右其始動點往右移動亦即后移，這提示其活動周期大于24 h，從第六天開始始動點恢復前移。可見R-CIP組比A-CIP組后移的程度及時間更為明顯。
圖 3(c)、(d)分別為A-Control組、R-Control的代表小鼠活動圖，從圖中可直觀看出注射生理鹽水后，其始動點仍然左移即往前移動，與注射前比較沒有明顯差異。
2.2.2 活動周期數據比較
如表 2所示，R-CIP組及A-CIP組在造模后5天內用Halberg余弦擬合計算出周期為（24.36±0.16） h及（24.00±0.18） h，均超過24 h，高于造模前5天和造模后第6~10天（P值均＜0.01），且R-CIP組造模后5天內相對造模前5天周期的延長比A-CIP組更為顯著（P＜0.05），而R-Control組及A-Control組三個階段的周期沒有明顯差異（P值均＞0.05）。
表2
造模組與對照組周期數據對比（h,3 討論
近年來關于炎癥因子影響近日節律的國外文獻越來越多,但直接針對急性胰腺炎與生物節律相互影響的研究仍鮮有報道。波蘭科學家Jaworek等[4]發現蛙皮素誘發的胰腺炎大鼠病情存在近日節律，造模時間不同有晝重夜輕現象。本團隊的前期研究發現左旋精氨酸(與CCK類似的胰腺炎造模藥物)可降低大鼠胰腺腺泡細胞AR42J細胞節律基因Per1的表達[11]。
本實驗通過輪轉活動圖和Halberg余弦擬合計算得出的周期數據表明CIP模型組的周期延長，進一步分析發現有趣的現象，休息相造模組比活動相造模組前后周期的變化更為明顯。分析血清淀粉酶、脂肪酶、胰腺病理評分、TNF-α和IL-1β等急性胰腺炎炎癥程度的指標，顯示急性胰腺炎ICR小鼠模型中，休息相造模組比活動相造模組炎癥程度重。這提示急性胰腺炎可影響小鼠自由活動節律使其節律紊亂、周期延長；而且，不同時相造模小鼠的炎癥程度和周期延長情況均有明顯差別，休息相造模組比活動相造模組炎癥程度重、周期延長更加明顯。
時間生物學研究認為自由運行狀態下休息相為嚙齒類動物的主觀白天，活動相是主觀夜晚，有文獻表明晝伏夜行的嚙齒類動物白天節律基因及相關激素的表達低于夜晚。SCN是哺乳動物近日節律調節中樞系統，產生和調節睡眠-覺醒、激素、代謝和生殖等眾多生物節律。CCK是一種腦腸肽，時間生物學對CCK、生長抑素（somatostatin，SS）等腦腸肽及受體在SCN的分布和在節律整合、輸出的作用論述頗多[12]。CCK分布于體內的消化、神經、免疫及生殖等系統，并通過激素或神經遞質參與其功能、代謝的調節，具有重要的生理意義[13]。Mühlbauer等[14]報道鐘基因Per1、Per2、Bmal1、Cry1、Tim (timeless) and Clock及鐘控基因Dbp and Rev-erbalpha在小鼠胰腺有較強的表達，并據此推測胰腺存在近日節律振蕩器。結合上述文獻、我們的前期發現及本次實驗結果，認為急性胰腺炎與小鼠自由活動節律之間存在雙相聯系,急性胰腺炎可造成生物節律紊亂，同時生物節律會反作用影響急性胰腺炎炎癥程度，這可能是節律基因及相關激素的表達與急性胰腺炎發生、發展的內在機制相關，提示急性胰腺炎狀態下胰腺外周近日節律振蕩器與近日節律中樞鐘SCN二者間存在相互關聯。
盡管急性胰腺炎發病機制復雜，但歸根到底是胰酶的激活與自身消化引起的急性炎癥事件，本質上屬應激反應，其結果是導致機體內環境失調。生物節律尤其近日節律與維持機體穩態有著密切的聯系，自由節律是一種特殊的功能狀態，在這種狀態下動物完全沒有受到任何授時因子的影響，處在一種基礎狀態。當動物處于自由節律狀態時，動物的節律中樞和各個外周震蕩器保持最高程度的一致，沒有假面效應等其它節律現象的發生，其節律表現最為單純。基于以上觀點，我們選擇建立自由運行狀態下的急性胰腺炎小鼠模型，以動物行為學觀察作為研究急性胰腺炎與生物節律相互影響的切入點，借助時間生物學的理論和方法對急性胰腺炎發病機制甚至診斷治療的研究帶來新思路并力圖新突破。
引言
生物體內多數生理生化過程都存在大約以24小時為周期的變化，即近日節律，使得生物體能更好地適應外界環境改變。近日節律的破壞會造成多種生理功能的失調，對生物體的健康產生極其嚴重的影響。許多研究已經發現近日節律的變化與多種疾病相關。有報道證實炎癥反應的高低與機體內源糖皮質激素分泌的晝夜節律有關[1]。Sadki等[2]報道腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎癥因子水平的增加會影響視交叉上核（suprachiasmatic nucleus,SCN）節律輸出從而加速老化。Cavadini等[3]研究發現炎癥產生的TNF-α通過抑制節律基因的表達引起疲勞。Jaworek等[4]發現蛙皮素誘發的胰腺炎大鼠病情存在近日節律，根據造模時間不同有晝重夜輕現象，與褪黑素濃度調控有關。
急性胰腺炎是臨床常見的急腹癥，其中20%左右屬重癥急性胰腺炎，病情兇險，死亡率很高，其發病機制尚未闡明，導致臨床治療缺乏特異性手段[5]。建立合適的胰腺炎動物模型對研究該病的發病機制是非常必要的，而且有助于開展潛在治療手段的研究[6]。動物的活動具有明顯的節律性，在持續黑暗狀態下的活動節律稱為自由運行節律（free-running rhythm），簡稱自由節律（free rhythm）。自由節律是一種特殊功能狀態的近日節律，在這種狀態下給于相應的刺激，能夠很好地研究機體節律對刺激的反應[7]。膽囊收縮素（cholecystokinin,CCK）有很強的促胰酶釋放作用，在非侵入性實驗性急性胰腺炎方法中，CCK及其類似物雨蛙素超大劑量腹腔注射是目前最為成熟、應用最多的模型[8]，該模型操作簡便、易于復制、重復性好,同時對節律的人為干擾較小。基于此，本研究建立自由運行狀態下的膽囊收縮素誘導急性胰腺炎小鼠模型（cholecystokinin-induced acute pancreatitis,CIP）作為急性胰腺炎動物行為研究平臺，從整體水平研究急性胰腺炎與生物節律的相關性，為今后進一步深入研究打下基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
ICR小鼠（雄性，3周齡，體重18～20 g，清潔級）由四川醫學科學院實驗動物中心提供。
1.1.2 實驗試劑及檢測裝置
200 μg/kg CCK、抗小鼠TNF-α、抗小鼠白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、酶聯免疫吸附試劑盒（enzyme linked immunosorbent，ELISA）購于R&D公司；4%甲醛、生理鹽水、TMB試劑盒購于武漢博士德生物公司。活動性檢測系統設備包括：含有轉輪的環境條件控制盒（轉輪直徑為15 cm，控制盒大小為45 cm×35 cm×30 cm），安裝紅外線檢測裝置及數據分析系統，安裝自動控制光源，由四川大學時間生物學衛生部重點實驗室設計，成都信息工程大學物理場生物效應及儀器四川高校重點實驗室制作。
1.2 方法
1.2.1 動物預處理
小鼠適應性喂養2周，常規飼料及飲水，飼養環境為清潔級。飼養環境溫度22～25 ℃，濕度55%～65%。控制環境噪音。LD12/12狀態（光照：12 h；黑暗：12 h）2周后進入持續黑暗（double dark,DD)狀態(持續黑暗24 h)。LD12/12狀態于8∶00至20∶00光照，于20∶00至8∶00黑暗。DD狀態的日常飼養和換料：在微弱紅光下3天換食物，7天更換墊料。
1.2.2 小鼠的篩選及分組
對進入DD兩周后的小鼠用活動圖結合活動數據進行Halberg余弦擬合分析，篩選出有節律（Halberg余弦擬合P＜0.05為有節律）的小鼠80只，隨機分成4組，每組20只，分別為休息相對照組（R-Control）、活動相對照組（A-Control）、 休息相模型組（R-CIP）和活動相模型組（A-CIP）。模型組分別在休息相或活動相注射CCK建立胰腺炎動物模型，對照組以生理鹽水為對照。上述每組隨機挑選10只小鼠于造模12 h后采樣，進行胰腺炎生化指標和病理組織學檢測；另外10只繼續DD狀態下輪轉實驗兩周。
1.2.3 胰腺炎造模
模型組給予200 μg/kg CCK腹腔注射三次，間隔1 h[8-9]，對照組用等量的生理鹽水腹腔注射三次，間隔1 h。活動相組為18∶00開始注射，休息相組為6∶00點開始注射。小鼠在造模前節食16 h自由飲水，造模操作在微弱紅光下進行。
1.2.4 胰腺炎生化指標、病理組織學檢測
造模12 h后斷頸眼眶取血2 mL，同時取胰腺放入4%甲醛固定。血液標本送往四川大學華西婦女兒童醫院生化檢驗室檢測血清淀粉酶（amylase,AMY)、脂肪酶(lipase,LIP)。采用雙抗夾心ELISA法檢測TNF-α，加入辣根過氧化物酶標記的抗小鼠TNF-α，加入TMB顯色,小鼠TNF-α的濃度與OD（450 nm）成正比。采用雙抗夾心ABC-ELISA法檢測LI-1β，用抗小鼠IL-1β單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的IL-1β與單抗結合，通過繪制標準曲線求出標本中IL-1β濃度。
胰腺HE染色病理切片的制作：將固定24 h后的胰腺標本取出，石蠟包埋，切片，切片厚度為2 μm，連續4張，行HE染色后送四川大學華西醫院病理科，由同一病理醫師采用單盲法于光鏡下觀察組織病理學改變。胰腺組織半定量積分參照Rongione標準[10]按水腫、炎性細胞浸潤、出血、壞死評分，最重者給4分，正常者0分。
1.2.5 小鼠活動性檢測
環境條件控制盒控制環境溫度為(22±2) ℃，隔離外界噪音和光線，并按實驗設計自動提供光暗循環。紅外線檢測裝置和數據分析系統分別采集和分析數據。自動連續檢測轉輪的轉數，以反映小鼠的活動性。系統每3 min自動記錄1次數據并儲存，然后用活動圖余弦擬合對進入DD兩周后小鼠的活動數據進行近日節律分析。觀察期DD狀態下輪轉實驗數據采集及分析同前，時間為兩周。
1.3 統計方法
采用SPSS13.0和明尼蘇達大學Halberg余弦分析包統計軟件進行處理，計量資料用均數±標準差(
2 結果
2.1 不同時相造模對炎癥程度的影響
2.1.1 淀粉酶、脂肪酶比較
R-CIP組淀粉酶、脂肪酶均明顯高于對照組（P值均＜0.01），A-CIP組淀粉酶、脂肪酶亦明顯高于對照組（P值均＜0.05)；不同相位造模，R-CIP組的淀粉酶、脂肪酶均明顯高于A-CIP組（P值均＜0.05)，R-Control與A-Control比較則沒有明顯差別（P值均＞0.05），如圖 1所示。
圖1
R-Control、A-Control、R-CIP組及A-CIP淀粉酶、脂肪酶比較（與對照組比較，＊
＊
2.1.2 胰腺病理評分比較
如表 1所示，R-CIP組水腫、炎癥浸潤、出血、壞死、總積分明顯高于對照組（P值均＜0.01），A-CIP組亦明顯高于對照組（P值均＜0.05）；而不同相位造模，R-CIP組的水腫、炎癥浸潤、總積分均明顯高于A-CIP組（P值均＜0.05），R-Control組與A-Control組比較則沒有明顯差別（P值均＞0.05）。
表1
各組胰腺病理評分的比較（2.1.3 血清炎性介質TNF-α、LI-1β比較
R-CIP組的TNF-α、LI-1β濃度均明顯高于對照組（P值均＜0.01），A-CIP組亦明顯高于對照組（P值均＜0.05）；不同相位造模，A-CIP組的TNF-α、LI-1β濃度明顯低于R-CIP組（P值均＜0.05），R-Control組與A-Control組比較則沒有明顯差別（P值均＞0.05），如圖 2所示。
圖2
對照組、R-CIP組及A-CIP治療組炎性介質比較（與對照組比較，＊
＊
2.2 不同時相造模對活動節律的影響
2.2.1 輪轉活動圖
小鼠活動性檢測結果如圖 3所示。
圖3
小鼠輪轉活動圖
Figure3.
Rotation activity diagram of mise
圖 3(a)、(b)分別為A-CIP、R-CIP造模組的代表小鼠活動圖，從圖中可直觀看出注射CCK前，其始動點均規律往左移動即前移，而注射后其始動點均不同程度的往右移動即后移，這提示其活動周期延長。其中圖 3(a)有3天左右其始動點沒有像造模前第二天相對第一天前移的情況，這提示其活動周期等于或大于24 h，從第五天開始始動點恢復前移。圖 3(b)有4天左右其始動點往右移動亦即后移，這提示其活動周期大于24 h，從第六天開始始動點恢復前移。可見R-CIP組比A-CIP組后移的程度及時間更為明顯。
圖 3(c)、(d)分別為A-Control組、R-Control的代表小鼠活動圖，從圖中可直觀看出注射生理鹽水后，其始動點仍然左移即往前移動，與注射前比較沒有明顯差異。
2.2.2 活動周期數據比較
如表 2所示，R-CIP組及A-CIP組在造模后5天內用Halberg余弦擬合計算出周期為（24.36±0.16） h及（24.00±0.18） h，均超過24 h，高于造模前5天和造模后第6~10天（P值均＜0.01），且R-CIP組造模后5天內相對造模前5天周期的延長比A-CIP組更為顯著（P＜0.05），而R-Control組及A-Control組三個階段的周期沒有明顯差異（P值均＞0.05）。
表2
造模組與對照組周期數據對比（h,3 討論
近年來關于炎癥因子影響近日節律的國外文獻越來越多,但直接針對急性胰腺炎與生物節律相互影響的研究仍鮮有報道。波蘭科學家Jaworek等[4]發現蛙皮素誘發的胰腺炎大鼠病情存在近日節律，造模時間不同有晝重夜輕現象。本團隊的前期研究發現左旋精氨酸(與CCK類似的胰腺炎造模藥物)可降低大鼠胰腺腺泡細胞AR42J細胞節律基因Per1的表達[11]。
本實驗通過輪轉活動圖和Halberg余弦擬合計算得出的周期數據表明CIP模型組的周期延長，進一步分析發現有趣的現象，休息相造模組比活動相造模組前后周期的變化更為明顯。分析血清淀粉酶、脂肪酶、胰腺病理評分、TNF-α和IL-1β等急性胰腺炎炎癥程度的指標，顯示急性胰腺炎ICR小鼠模型中，休息相造模組比活動相造模組炎癥程度重。這提示急性胰腺炎可影響小鼠自由活動節律使其節律紊亂、周期延長；而且，不同時相造模小鼠的炎癥程度和周期延長情況均有明顯差別，休息相造模組比活動相造模組炎癥程度重、周期延長更加明顯。
時間生物學研究認為自由運行狀態下休息相為嚙齒類動物的主觀白天，活動相是主觀夜晚，有文獻表明晝伏夜行的嚙齒類動物白天節律基因及相關激素的表達低于夜晚。SCN是哺乳動物近日節律調節中樞系統，產生和調節睡眠-覺醒、激素、代謝和生殖等眾多生物節律。CCK是一種腦腸肽，時間生物學對CCK、生長抑素（somatostatin，SS）等腦腸肽及受體在SCN的分布和在節律整合、輸出的作用論述頗多[12]。CCK分布于體內的消化、神經、免疫及生殖等系統，并通過激素或神經遞質參與其功能、代謝的調節，具有重要的生理意義[13]。Mühlbauer等[14]報道鐘基因Per1、Per2、Bmal1、Cry1、Tim (timeless) and Clock及鐘控基因Dbp and Rev-erbalpha在小鼠胰腺有較強的表達，并據此推測胰腺存在近日節律振蕩器。結合上述文獻、我們的前期發現及本次實驗結果，認為急性胰腺炎與小鼠自由活動節律之間存在雙相聯系,急性胰腺炎可造成生物節律紊亂，同時生物節律會反作用影響急性胰腺炎炎癥程度，這可能是節律基因及相關激素的表達與急性胰腺炎發生、發展的內在機制相關，提示急性胰腺炎狀態下胰腺外周近日節律振蕩器與近日節律中樞鐘SCN二者間存在相互關聯。
盡管急性胰腺炎發病機制復雜，但歸根到底是胰酶的激活與自身消化引起的急性炎癥事件，本質上屬應激反應，其結果是導致機體內環境失調。生物節律尤其近日節律與維持機體穩態有著密切的聯系，自由節律是一種特殊的功能狀態，在這種狀態下動物完全沒有受到任何授時因子的影響，處在一種基礎狀態。當動物處于自由節律狀態時，動物的節律中樞和各個外周震蕩器保持最高程度的一致，沒有假面效應等其它節律現象的發生，其節律表現最為單純。基于以上觀點，我們選擇建立自由運行狀態下的急性胰腺炎小鼠模型，以動物行為學觀察作為研究急性胰腺炎與生物節律相互影響的切入點，借助時間生物學的理論和方法對急性胰腺炎發病機制甚至診斷治療的研究帶來新思路并力圖新突破。
