腫瘤多藥耐藥性(MDR)是臨床上腫瘤化療失敗的主要原因，其中由多藥耐藥基因(MDR1)編碼的P-糖蛋白(P-gp)又在MDR發生機制中占重要作用。本實驗設計合成特異性沉默MDR1基因的小干擾RNA（siRNA），協同抗腫瘤藥物紫杉醇(PTX)共同包裹于固體脂質納米粒(SLNs)中，利用基因治療和化學治療的協同作用，以期克服腫瘤多藥耐藥性。實驗包括制備siRNA-紫杉醇固體脂質納米粒(siRNA-PTX-SLNs)；檢測載藥SLNs對腫瘤細胞的增殖抑制作用；測定給藥后PTX的細胞攝取率；采用實時熒光定量PCR和流式細胞法評價siRNA-PTX-SLNs對MDR1表達的沉默作用。結果顯示在耐藥細胞MCF-7/ADR中siRNA-PTX-SLNs能夠顯著提高PTX細胞攝取率，有效沉默MDR1的表達，抑制P-gp的外排作用，促進P-gp底物在細胞的蓄積。因此siRNA-PTX-SLNs可發揮克服腫瘤多藥耐藥性的協同治療作用。
引用本文： 黃蕊, 姚欣宇, 陳媛, 孫遜, 林蕓竹. 小干擾RNA-紫杉醇固體脂質納米粒克服腫瘤多藥耐藥性的體外細胞學研究. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(1): 108-114. doi: 10.7507/1001-5515.20160020 復制
引言
癌癥是嚴重威脅人類生命健康的重大疾病之一，臨床上的治療手段多為手術切除及化學治療。但目前腫瘤的化學治療存在兩大障礙：一是腫瘤水平上的生理結構障礙，即腫瘤組織內無序的血管結構、升高的間質液壓和缺乏淋巴導管等使得藥物很難到達腫瘤組織內部[1-2]；二是細胞水平的多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)障礙，包括藥物外排泵、基因及蛋白水平修復和抑制腫瘤凋亡、化學藥物靶點變化等[3-5]。MDR的產生是多種基因產物共同作用的結果，腫瘤細胞只要對一種化療藥物產生耐藥后會對其他不同結構、不同作用機制和作用靶點的藥物產生交叉耐藥，導致腫瘤化療失敗。根據藥物作用靶點，MDR大體可分為5類，其中由MDR1基因編碼的P-糖蛋白(p-glycoprotein,P-gp)是一種在腫瘤細胞高度表達的跨膜糖蛋白，起藥物外排泵作用，是MDR產生的最重要原因[6]。
小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)是一種小分子RNA分子，能夠誘導細胞內相應的mRNA降解而引起轉錄后基因沉默現象，即RNA干擾(RNA interference,RNAi)。目前已有研究發現siRNA通過脂質體、納米粒等可對癌癥基因產生明顯的沉默效果，并在小鼠體內發現了明顯的腫瘤抑制作用[7-8]。此外，紫杉醇(paclitaxel,PTX)是一種常用的化療藥物，臨床研究表明，PTX對卵巢癌、乳腺癌、肺癌、大腸癌、黑色素瘤等均有很好的療效。
前期實驗中，我們首先設計合成了對MDR1基因具有明顯沉默作用的siRNA[9-10]，利用固體脂質納米粒(solid lipid nanoparticles,SLNs) 作為siRNA及PTX的共同藥物傳遞系統，已經成功制備了同時包裹siRNA和PTX的固體脂質納米粒(siRNA-PTX-SLNs)[11]。本文針對腫瘤的多藥耐藥性，進一步對siRNA-PTX-SLNs的細胞藥效學進行了研究。
1 材料和方法
1.1 材料
大豆磷脂(soybean phosphatidyl choline,SPC)購自上海太偉藥業有限公司。單硬脂酸甘油酯(glyceryl monostearate,GMS)購自成都科龍化工試劑廠。膽固醇(Chol)購自上海伯奧生物科技有限公司。1-(2,3-二油酰基)-N,N,N-三甲胺丙烷甲基硫酸鹽(DOTAP)購自Avanti polar lipids公司。Pluronic F68購自南京威爾公司。紫杉醇購自西安昊軒生物科技有限公司。紫杉醇注射液為重慶太極制藥生產。BCA試劑盒購自Thermo Scientific公司。針對MDR1基因設計構建具有沉默MDR1基因作用的特異性siRNA(5＇-GGAAAAGAAACCAACTGTCdTdT-3＇)購自廣州市銳博生物科技有限公司。RNase A購自美國Sigma公司。Lipofectamine2000(LIPO)商品化脂質轉染試劑購自美國Invitrogen公司。RNA prep pure培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒、TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。SsoFast Eva Green購自美國Bio-Rad公司。MDR1和β-actin上下游引物均由上海生工合成。人乳腺癌細胞MCF-7由本實驗室保存。人乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADR由北京大學呂萬良教授贈送，該細胞系從親代細胞經阿霉素篩選而得，為多藥耐藥細胞系，對PTX具有耐藥性[12-13]。MCF-7和MCF-7/ADR細胞均使用DMEM完全培養基(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)培養于37 ℃的5% CO2培養箱中。
1.2 方法
1.2.1 siRNA-PTX-SLNs的制備
按本實驗室研發方法自行制備siRNA-PTX-SLNs[11]。將150 μL含0.4 mg DOTAP的三氯甲烷溶液、150 μL含1 nmol siRNA的ddH2O和330 μL甲醇充分混合。于25 ℃靜置1 h后，分別加入300 μL三氯甲烷和300 μL ddH2O并混合均勻，于3 000 r/min離心10 min使溶液分層。小心收集下層溶解有DOTAP-siRNA復合物的有機相，加入15 mL乙酸乙酯、3.25 mg GMS、12.95 mg SPC、0.5 mg Chol及0.8 mg PTX。于50 ℃水浴中攪拌10 min。旋轉蒸發除去有機溶劑形成薄膜，加入4 mL水相(5%葡萄糖+0.1% F68)重新分散薄膜，探頭超聲(100 W，20次，每次5 s、間隔7 s)后，即得siRNA-PTX-SLNs。不含siRNA和PTX的空白SLNs以及PTX-SLNs、siRNA-SLNs按相似方法制得。
1.2.2 空白SLNs的細胞毒性研究
將MCF-7和MCF-7/ADR細胞按每孔1×104個細胞的密度接種于96孔培養板中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養24 h。棄去培養基，分別給予100 μL空白SLNs溶液和LIPO溶液(給藥量分別為對應載藥納米粒中siRNA濃度為50、100、200和400 nmol/L時的量)，孵育4 h后，更換為100 μL完全培養基繼續培養48 h。每孔棄去培養基，加入100 μL MTT溶液(培養基稀釋終濃度至0.5 mg/mL)，繼續孵育4 h，小心棄去MTT溶液，加入150 μL DMSO，37 ℃搖床中振搖孵育100 r/min×10 min，于酶聯免疫檢測儀測定波長490 nm處紫外吸收值(ODsample)，同時，以不加藥物處理的細胞組作為對照孔(ODcontrol)，不加細胞的孔為調零孔(ODblank)，每組設5個復孔。按下式計算細胞存活率(cell viability，CV)：CV=(ODsample-ODblank)/(ODcontrol-ODblank)×100%。
1.2.3 siRNA-PTX-SLNs對腫瘤細胞增殖抑制作用的研究
將MCF-7和MCF-7/ADR細胞按每孔1×104個細胞的密度接種于96孔培養板中，于37 ℃、 5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養24 h。棄去培養基，分別給予不同的給藥組，包括游離PTX、游離siRNA、游離siRNA+PTX、PTX-SLNs、siRNA-SLNs、siRNA-PTX-SLNs和siRNA-LIPO組，對應的siRNA濃度為50 nmol/L，PTX濃度為40 μg/mL。孵育4 h后，更換為100 μL完全培養基繼續培養48 h。每孔棄去培養基，加入100 μL MTT溶液(培養基稀釋終濃度至0.5 mg/mL)，繼續孵育4 h，小心棄去MTT溶液，加入150 μL DMSO，37 ℃搖床中振搖孵育100 r/min×10 min，于酶聯免疫檢測儀測定波長490 nm處紫外吸收值，同時以不加藥物處理的細胞組作為對照孔，不加細胞的孔為調零孔，每組設5個復孔。按1.2.2公式計算各組CV。
1.2.4 siRNA-PTX-SLNs的細胞藥效學機制研究
(1)PTX-SLNs在MCF-7/ADR上的攝取研究：將MCF-7/ADR細胞按每孔5×105個細胞的密度接種于6孔培養板中。待細胞生長融合率達到50%左右，分別加入樣品溶液：游離PTX、PTX-SLNs，其中PTX濃度為40 μg/mL。4 h后，除去藥液，清洗并消化細胞，反復凍融獲得細胞裂解樣品。用BCA試劑盒測定樣品蛋白含量，余下樣品甲醇溶解后采用HPLC法檢測PTX含量，HPLC方法如下：Kromasil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：乙腈∶水=55∶45，檢測波長227 nm，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量20 μL按下式計算PTX攝取指數(μg/mg)：PTX攝取指數(μg/mg)=PTX濃度( g/mL)／蛋白質濃度(mg/mL)。
(2)RT-PCR法檢測siRNA-PTX-SLNs對MDR1基因的沉默作用：將MCF-7/ADR細胞按每孔1×105個細胞的密度接種于12孔板中。于37 ℃、 5% CO2、飽和濕度條件下培養24 h，用無血清培養基清洗細胞后，分別加入樣品溶液空白SLNs、游離PTX、游離siRNA、游離siRNA+PTX、PTX-SLNs、siRNA-SLNs及siRNA-PTX-SLNs。以未經處理的MCF-7/ADR的細胞做為陰性對照組，以商品化LIPO制備的siRNA(siRNA-Lipo)做為陽性對照組。相應給藥濃度為siRNA 50 nmol/L，PTX 40 μg/mL孵育4 h后更換新鮮完全培養基，繼續培養48 h。培養完成后收集細胞，用RNA prep pure培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒按說明書提取細胞總RNA，用cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉錄得到cDNA。通過實時熒光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)對樣品中的MDR1基因表達進行定量檢測。采用SsoFast Eva Green按說明書配制PCR反應液，其中MDR1上下游引物序列分別為5′-ATATCAGCAGCCCACATCAT-3′，5′-GAAGCACTGGGATGTCCGGT-3′。在RT-PCR系統上進行PCR反應，反應條件為95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，40 次循環。同時測定β-actin表達量作為內參，通過系統自帶軟件進行定量分析，得到MDR1的相對表達量[14]。
(3)Rhodamine-123排染實驗檢測siRNA-PTX-SLNs對細胞P-gp功能的影響：Rhodamine-123是P-gp底物，通過流式細胞儀檢測Rhodamine-123在細胞中的蓄積可以間接地評價P-gp的功能。將MCF-7/ADR細胞按每孔5×105個細胞的密度接種于6孔培養板中，待細胞生長融合率達到約50%，分別加入樣品溶液空白SLNs、LIPO、游離siRNA、游離PTX、游離siRNA+PTX、PTX-SLNs、siRNA-SLNs、siRNA-PTX-SLNs及siRNA-LIPO。培養4 h后，更換新鮮完全培養基繼續培養48 h后棄去培養基，加入2 mL含有2 μg/mL Rhodamine-123的無血清培養基，繼續培養3 h。棄去Rhodamine-123溶液并用PBS清洗細胞三次，胰酶消化細胞獲得單細胞懸液，再次清洗細胞后用0.5 mL PBS重懸，使用流式細胞儀檢測Rhodamine-123在細胞中的蓄積情況：激發光波長為488 nm，發射光波長大于630 nm。將未作其他處理僅給與Rhodamine-123的MCF-7/ADR細胞組做為參比組，即熒光強度為100%，計算各組相對熒光強度。
2 結果
2.1 空白SLNs的細胞毒性研究
結果如圖 1所示，在MCF-7和MCF-7/ADR細胞中，隨著SLNs的增加，細胞存活率均逐漸降低，說明隨著陽離子脂質材料DOTAP的增加，SLNs的細胞毒性逐漸升高，相同結果在商品化LIPO上也存在。對于耐藥細胞MCF-7/ADR，當空白SLNs和商品化LIPO的量增加到對應的含藥載體的siRNA劑量為400 nmol/L時，兩者均表現出明顯的毒性。而當用量降低至200 nmol/L以下時，兩者均無明顯毒性，因此，該制劑的細胞藥效學研究選取對應siRNA劑量為200 nmol/L作為給藥濃度。此外，在親代細胞MCF-7中，SLNs的用量在對應的含藥載體的siRNA劑量為100 nmol/L以下時，未表現出明顯毒性。
圖1
MTT法檢測空白SLN及LIPO在MCF-7/ADR和MCF-7上的細胞毒性(n=5)
Figure1.
Cell toxicity of MCF-7/ADR and MCF-7 after treated with blank SLNs and LIPO (n=5) detected using MTT
2.2 siRNA-PTX-SLNs對腫瘤細胞增殖抑制作用的研究
根據空白SLNs細胞毒性實驗結果，本部分研究中給藥劑量對應為siRNA濃度為50 nmol/L，PTX濃度為40 μg/mL，以排除空白SLNs以及LIPO載體毒性干擾。給藥后腫瘤細胞的增殖抑制結果如圖 2所示。在MCF-7和MCF-7/ADR兩種細胞中，游離siRNA、siRNA-SLNs和siRNA-LIPO均未表現出明顯細胞抑制作用，其細胞存活率均在95%以上，說明在此給藥劑量下，載體本身以及siRNA均無腫瘤細胞抑制作用。相反，除在MCF-7/ADR細胞上的游離PTX組未表現出明顯細胞抑制作用以外，其余含PTX的給藥組在MCF-7和MCF-7/ADR兩種細胞中均表現出不同程度的細胞抑制作用，其中使用SLNs作為載體的PTX-SLNs組和siRNA-PTX-SLNs組的細胞增殖抑制作用顯著高于無載體的游離PTX組和游離siRNA+PTX組(P＜0.05)。更重要的是，在耐藥細胞株MCF-7/ADR中，siRNA-PTX-SLNs的腫瘤細胞抑制作用顯著高于PTX-SLNs組(P＜0.05)，而在親代細胞株MCF-7中，兩組的腫瘤細胞增殖抑制作用未表現出明顯統計學的差異。
圖2
MTT法測定不同給藥組對耐藥細胞MCF-7/ADR和親代細胞MCF-7的增殖抑制作用(n=5)
Figure2.
Inhibitory function to cell viability of MCF-7/ADR and MCF-7 detected using MTT after treated by different preparations (n=5)
2.3 siRNA-PTX-SLNs的細胞藥效學機制研究
2.3.1 PTX-SLNs在MCF-7/ADR上的攝取研究
結果顯示，PTX-SLNs組的PTX攝取指數顯著高于游離PTX組(PTX攝取指數分別為7.07 μg/mg和3.63 μg/mg，P＜0.05)，此結果同腫瘤細胞增殖抑制實驗結果一致。
2.3.2 RT-PCR法檢測siRNA-PTX-SLNs對MDR1基因的沉默作用
本部分采用RT-PCR檢測法對siRNA-PTX-SLNs的MDR1基因沉默作用進行研究。結果如圖 3所示，與未處理組相比，游離PTX組及游離PTX+siRNA組表現出更低的MDR1 mRNA表達水平(P＜0.05)，然而游離siRNA組未表現出明顯差異。此外，以SLNs及LIPO作為載體的PTX-SLNs組、siRNA-SLNs組、siRNA-Lipo組及siRNA-PTX-SLNs組的MDR1mRNA表達水平顯著低于其他所有組(P＜0.05)，其中siRNA-PTX-SLNs組更優于PTX-siRNA組和siRNA-SLNs組(P＜0.05)。
圖3
RT-PCR檢測不同給藥組對耐藥細胞MCF-7/ADR的MDR1沉默作用(n=3)
Figure3.
Quantitative real-time PCR for MDR1 in MCF7/ADR cells showing inhibited expression of MDR1 by siRNA delivered with SLNs (n=3)
2.3.3 Rhodamine-123排染實驗檢測siRNA-PTX-SLNs對細胞P-gp功能的影響
流式細胞檢測結果如圖 4所示，以未處理的MCF-7/ADR細胞為參比，空白SLNs組和LIPO組的相對熒光強度均接近100%，可排除空白SLNs及LIPO對Rhodamine-123在細胞內熒光強度的影響；此外，游離siRNA組也未明顯提高Rhodamine-123在細胞內的相對熒光強度。其余組別均顯著提高了Rhodamine-123在細胞內的相對熒光強度(P＜0.05)，其中也包括游離PTX組、游離siRNA+PTX組及PTX-SLNs組。采用載體傳遞的siRNA組，包括siRNA-SLNs組、siRNA-PTX-SLNs和siRNA-LIPO組均能顯著性提高相對熒光強度(P＜0.05)，更重要的是，與siRNA-SLNs組和PTX-SLNs組相比，siRNA-PTX-SLNs組效率最高(P＜0.05)，最為接近siRNA-LIPO組的效率，這與前述RT-PCR法測定結果相一致。
圖4
流式細胞檢測不同給藥組對Rhodamine-123在細胞中蓄積的影響(n=3)
中文注解
Figure4. Treatment by siRNA loaded with SLNs enhanced Rhodamine-123 accumulation in MCF-7/ADR cells (n=3)英文注解
3 討論
腫瘤細胞接觸抗腫瘤藥物后，對該藥物以及與該藥物化學結構和作用機制不同的其他藥物均可能產生交叉耐藥，這種現象被稱為MDR。MDR已成為臨床上腫瘤化療失敗的主要原因[15]，形成機制復雜，其中MDR1編碼的P-gp在MDR發生機制中起著極為重要的作用[16-17]。目前，國內外研究者針對腫瘤MDR，尤其是針對P-gp所介導的腫瘤MDR已研發了多種治療方法，然而其中多數方法缺乏特異性和安全性，因此在臨床的研究和應用中存在一定的局限性。siRNA是一種長度在21~23 bp的雙鏈RNA分子，可用于誘導基因沉默，即常見的RNA干擾技術，其優點在于設計方便，序列可控，具有高效、特異的基因沉默作用。但siRNA在應用中也存在嚴重的缺陷，即極易被RNA酶降解，且其親水性大分子的性質使其不易透過細胞膜，因此單獨的siRNA給藥后效果并不理想，在臨床的應用中存在障礙。此外，作為臨床上廣為應用的一線抗癌藥物，PTX在MDR機制的研究中應用也十分廣泛，但其水溶性極差的性質也限制了PTX在臨床上的應用。
SLNs是近年發展起來的新一代亞微粒給藥系統，通常采用生物可降解的類脂作為材料，粒徑在10~1000 nm之間，具有低毒性、高載藥量、緩釋以及靶向性等優點[18]。作為一種納米級給藥體系，通過增強滲透與滯留效應(enhanced permeability and retention effect，PR)可被動到達腫瘤組織內部，從而提高藥物在腫瘤細胞內濃度，降低在正常細胞內濃度，克服腫瘤組織水平上的物理障礙，達到高效低毒的目的[19-20]。當藥物到達腫瘤細胞后，即將面臨的便是細胞水平的MDR。為此，在本研究中，我們設計制備了同時包裹可特異性沉默MDR1基因的siRNA與PTX的SLNs藥物傳遞體系siRNA-PTX-SLNs，利用SLNs的性質克服腫瘤組織水平上的障礙，再利用siRNA特異性沉默MDR1基因，以對抗細胞水平上MDR，進而發揮對腫瘤細胞的協同抑制作用[21-22]。實驗結果顯示，在細胞毒性實驗中，僅當空白SLNs用量非常大時才表現出一定的細胞毒性作用，證實該材料具有一定的安全性。在腫瘤細胞增殖抑制實驗中，SLNs作為載體的藥物組比相應游離藥物組的細胞增殖抑制作用顯著提高，一方面說明SLNs能夠提高siRNA的穩定性，并促進siRNA的攝取和基因沉默作用，另一方面說明SLNs也能促進PTX的細胞攝取及其抗腫瘤作用。此外，腫瘤細胞增殖抑制實驗中還發現在耐藥細胞MCF-7/ADR中siRNA和PTX共給藥可以發揮協同作用，而在親代細胞MCF-7中，siRNA和PTX共給藥并未產生更優的抑制作用。由此說明siRNA-PTX-SLNs具有克服腫瘤多藥耐藥性的作用，其機制可能與siRNA下調MDR1的表達有關。PTX的攝取實驗中，PTX-SLNs可以高效地將所包載PTX傳遞進入細胞中，原因可能為陽性脂質DOTAP可以與帶負電荷的細胞表面發生相互作用而更容易進入細胞，進而提高PTX的細胞傳遞效率，增加細胞內藥物濃度，發揮抑制腫瘤細胞作用。通過比較不同給藥組對MDR1基因的沉默作用，結果發現單獨使用siRNA對耐藥細胞中的MDR1表達量基本沒有影響，說明游離siRNA易降解，未能發揮下調作用，但游離PTX組較游離siRNA組表現出更低的MDR1 mRNA表達水平(P＜0.05)，表明PTX具有一定的MDR1表達抑制作用。而使用SLNs包載siRNA時，由于提高siRNA的穩定性和細胞傳遞效率，能夠顯著沉默MDR1的表達。其中siRNA-PTX-SLNs表現出更優的MDR1基因沉默效率，且與siRNA-LIPO的結果相近。眾所周知，LIPO是一種多用途轉染試劑，可在各種貼壁和懸浮細胞系中提供高效轉染，還可以利用LIPO進行基于siRNA的基因表達研究，常作為評價siRNA傳遞系統效率的金標準，在基因沉默實驗中通過高效的轉染可以得到極高的基因沉默水平。因此，本研究構建的siRNA-PTX-SLNs具有與siRNA-LIPO相近的基因沉默效率，這一結果說明該共給藥體系也具有優秀的傳遞siRNA進入細胞發揮特異性基因沉默作用的能力。MDR1基因的沉默作用可導致腫瘤細胞中具有外排藥泵功能的P-gp表達量顯著降低，本實驗采用的Rhodamine-123是一種膜電位敏感的親脂性陽離子熒光材料，能夠快速通過細胞膜，同時還是一種特異性極強的P-gp底物，已有很多研究通過檢測Rhodamine-123在細胞內蓄積的情況，間接反映細胞膜上P-gp水平[23-24]。在Rhodamine-123排染實驗中，給藥組的相對熒光強度越高，表示Rhodamine-123被外排出細胞的量越少，即P-gp功能下降，說明MDR1基因表達下調，這一結果與各給藥組的MDR1基因沉默實驗一致。其中siRNA本身不穩定易被降解，且難以進入細胞發揮沉默作用，因此未顯著提高Rhodamine-123的蓄積，而游離PTX組、游離siRNA+PTX組及PTX-SLNs組的結果說明PTX會促進Rhodamine-123在細胞中的蓄積，采用載體傳遞的siRNA組均能顯著性提高相對熒光強度(P＜0.05)，說明siRNA在載體的幫助下可以進入細胞發揮MDR1沉默作用，從而減少P-gp對Rhodamine-123的外排；此外，同樣作為P-gp底物的抗腫瘤藥物PTX在與MDR1基因特異性siRNA共給藥時，由于MDR1的表達下調而外排減少，提高了PTX在腫瘤細胞中的蓄積，進而發揮更優的腫瘤抑制作用。綜上所述，在MCF-7/ADR細胞上進行的藥效學實驗表明，本研究構建的MDR1特異性siRNA和PTX共給藥體系siRNA-PTX-SLNs，與其他給藥組相比具有更強的MDR1基因沉默作用，能夠抑制P-gp功能，可有效克服腫瘤的多藥耐藥性。
本研究制備的siRNA-PTX-SLNs，一方面利用SLNs的優勢，提高siRNA穩定性及PTX的水溶性，繞開腫瘤水平的生理結構障礙，通過陽性脂質材料促進藥物的細胞攝取；一方面通過siRNA及PTX的共給藥，在細胞學水平上沉默MDR1基因表達，從而抑制藥物外排，促進藥物在腫瘤細胞內積累，達到更好的腫瘤抑制作用。實驗結果顯示其在耐藥腫瘤細胞株中具有明顯的腫瘤抑制作用，說明該給藥體系能通過以上藥理機制，有效克服腫瘤的多藥耐藥性，為以后腫瘤多藥耐藥治療和研究提供了良好的思路，具有重要的意義和廣泛的應用前景。
引言
癌癥是嚴重威脅人類生命健康的重大疾病之一，臨床上的治療手段多為手術切除及化學治療。但目前腫瘤的化學治療存在兩大障礙：一是腫瘤水平上的生理結構障礙，即腫瘤組織內無序的血管結構、升高的間質液壓和缺乏淋巴導管等使得藥物很難到達腫瘤組織內部[1-2]；二是細胞水平的多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)障礙，包括藥物外排泵、基因及蛋白水平修復和抑制腫瘤凋亡、化學藥物靶點變化等[3-5]。MDR的產生是多種基因產物共同作用的結果，腫瘤細胞只要對一種化療藥物產生耐藥后會對其他不同結構、不同作用機制和作用靶點的藥物產生交叉耐藥，導致腫瘤化療失敗。根據藥物作用靶點，MDR大體可分為5類，其中由MDR1基因編碼的P-糖蛋白(p-glycoprotein,P-gp)是一種在腫瘤細胞高度表達的跨膜糖蛋白，起藥物外排泵作用，是MDR產生的最重要原因[6]。
小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)是一種小分子RNA分子，能夠誘導細胞內相應的mRNA降解而引起轉錄后基因沉默現象，即RNA干擾(RNA interference,RNAi)。目前已有研究發現siRNA通過脂質體、納米粒等可對癌癥基因產生明顯的沉默效果，并在小鼠體內發現了明顯的腫瘤抑制作用[7-8]。此外，紫杉醇(paclitaxel,PTX)是一種常用的化療藥物，臨床研究表明，PTX對卵巢癌、乳腺癌、肺癌、大腸癌、黑色素瘤等均有很好的療效。
前期實驗中，我們首先設計合成了對MDR1基因具有明顯沉默作用的siRNA[9-10]，利用固體脂質納米粒(solid lipid nanoparticles,SLNs) 作為siRNA及PTX的共同藥物傳遞系統，已經成功制備了同時包裹siRNA和PTX的固體脂質納米粒(siRNA-PTX-SLNs)[11]。本文針對腫瘤的多藥耐藥性，進一步對siRNA-PTX-SLNs的細胞藥效學進行了研究。
1 材料和方法
1.1 材料
大豆磷脂(soybean phosphatidyl choline,SPC)購自上海太偉藥業有限公司。單硬脂酸甘油酯(glyceryl monostearate,GMS)購自成都科龍化工試劑廠。膽固醇(Chol)購自上海伯奧生物科技有限公司。1-(2,3-二油酰基)-N,N,N-三甲胺丙烷甲基硫酸鹽(DOTAP)購自Avanti polar lipids公司。Pluronic F68購自南京威爾公司。紫杉醇購自西安昊軒生物科技有限公司。紫杉醇注射液為重慶太極制藥生產。BCA試劑盒購自Thermo Scientific公司。針對MDR1基因設計構建具有沉默MDR1基因作用的特異性siRNA(5＇-GGAAAAGAAACCAACTGTCdTdT-3＇)購自廣州市銳博生物科技有限公司。RNase A購自美國Sigma公司。Lipofectamine2000(LIPO)商品化脂質轉染試劑購自美國Invitrogen公司。RNA prep pure培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒、TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。SsoFast Eva Green購自美國Bio-Rad公司。MDR1和β-actin上下游引物均由上海生工合成。人乳腺癌細胞MCF-7由本實驗室保存。人乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADR由北京大學呂萬良教授贈送，該細胞系從親代細胞經阿霉素篩選而得，為多藥耐藥細胞系，對PTX具有耐藥性[12-13]。MCF-7和MCF-7/ADR細胞均使用DMEM完全培養基(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)培養于37 ℃的5% CO2培養箱中。
1.2 方法
1.2.1 siRNA-PTX-SLNs的制備
按本實驗室研發方法自行制備siRNA-PTX-SLNs[11]。將150 μL含0.4 mg DOTAP的三氯甲烷溶液、150 μL含1 nmol siRNA的ddH2O和330 μL甲醇充分混合。于25 ℃靜置1 h后，分別加入300 μL三氯甲烷和300 μL ddH2O并混合均勻，于3 000 r/min離心10 min使溶液分層。小心收集下層溶解有DOTAP-siRNA復合物的有機相，加入15 mL乙酸乙酯、3.25 mg GMS、12.95 mg SPC、0.5 mg Chol及0.8 mg PTX。于50 ℃水浴中攪拌10 min。旋轉蒸發除去有機溶劑形成薄膜，加入4 mL水相(5%葡萄糖+0.1% F68)重新分散薄膜，探頭超聲(100 W，20次，每次5 s、間隔7 s)后，即得siRNA-PTX-SLNs。不含siRNA和PTX的空白SLNs以及PTX-SLNs、siRNA-SLNs按相似方法制得。
1.2.2 空白SLNs的細胞毒性研究
將MCF-7和MCF-7/ADR細胞按每孔1×104個細胞的密度接種于96孔培養板中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養24 h。棄去培養基，分別給予100 μL空白SLNs溶液和LIPO溶液(給藥量分別為對應載藥納米粒中siRNA濃度為50、100、200和400 nmol/L時的量)，孵育4 h后，更換為100 μL完全培養基繼續培養48 h。每孔棄去培養基，加入100 μL MTT溶液(培養基稀釋終濃度至0.5 mg/mL)，繼續孵育4 h，小心棄去MTT溶液，加入150 μL DMSO，37 ℃搖床中振搖孵育100 r/min×10 min，于酶聯免疫檢測儀測定波長490 nm處紫外吸收值(ODsample)，同時，以不加藥物處理的細胞組作為對照孔(ODcontrol)，不加細胞的孔為調零孔(ODblank)，每組設5個復孔。按下式計算細胞存活率(cell viability，CV)：CV=(ODsample-ODblank)/(ODcontrol-ODblank)×100%。
1.2.3 siRNA-PTX-SLNs對腫瘤細胞增殖抑制作用的研究
將MCF-7和MCF-7/ADR細胞按每孔1×104個細胞的密度接種于96孔培養板中，于37 ℃、 5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養24 h。棄去培養基，分別給予不同的給藥組，包括游離PTX、游離siRNA、游離siRNA+PTX、PTX-SLNs、siRNA-SLNs、siRNA-PTX-SLNs和siRNA-LIPO組，對應的siRNA濃度為50 nmol/L，PTX濃度為40 μg/mL。孵育4 h后，更換為100 μL完全培養基繼續培養48 h。每孔棄去培養基，加入100 μL MTT溶液(培養基稀釋終濃度至0.5 mg/mL)，繼續孵育4 h，小心棄去MTT溶液，加入150 μL DMSO，37 ℃搖床中振搖孵育100 r/min×10 min，于酶聯免疫檢測儀測定波長490 nm處紫外吸收值，同時以不加藥物處理的細胞組作為對照孔，不加細胞的孔為調零孔，每組設5個復孔。按1.2.2公式計算各組CV。
1.2.4 siRNA-PTX-SLNs的細胞藥效學機制研究
(1)PTX-SLNs在MCF-7/ADR上的攝取研究：將MCF-7/ADR細胞按每孔5×105個細胞的密度接種于6孔培養板中。待細胞生長融合率達到50%左右，分別加入樣品溶液：游離PTX、PTX-SLNs，其中PTX濃度為40 μg/mL。4 h后，除去藥液，清洗并消化細胞，反復凍融獲得細胞裂解樣品。用BCA試劑盒測定樣品蛋白含量，余下樣品甲醇溶解后采用HPLC法檢測PTX含量，HPLC方法如下：Kromasil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：乙腈∶水=55∶45，檢測波長227 nm，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量20 μL按下式計算PTX攝取指數(μg/mg)：PTX攝取指數(μg/mg)=PTX濃度( g/mL)／蛋白質濃度(mg/mL)。
(2)RT-PCR法檢測siRNA-PTX-SLNs對MDR1基因的沉默作用：將MCF-7/ADR細胞按每孔1×105個細胞的密度接種于12孔板中。于37 ℃、 5% CO2、飽和濕度條件下培養24 h，用無血清培養基清洗細胞后，分別加入樣品溶液空白SLNs、游離PTX、游離siRNA、游離siRNA+PTX、PTX-SLNs、siRNA-SLNs及siRNA-PTX-SLNs。以未經處理的MCF-7/ADR的細胞做為陰性對照組，以商品化LIPO制備的siRNA(siRNA-Lipo)做為陽性對照組。相應給藥濃度為siRNA 50 nmol/L，PTX 40 μg/mL孵育4 h后更換新鮮完全培養基，繼續培養48 h。培養完成后收集細胞，用RNA prep pure培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒按說明書提取細胞總RNA，用cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉錄得到cDNA。通過實時熒光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)對樣品中的MDR1基因表達進行定量檢測。采用SsoFast Eva Green按說明書配制PCR反應液，其中MDR1上下游引物序列分別為5′-ATATCAGCAGCCCACATCAT-3′，5′-GAAGCACTGGGATGTCCGGT-3′。在RT-PCR系統上進行PCR反應，反應條件為95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，40 次循環。同時測定β-actin表達量作為內參，通過系統自帶軟件進行定量分析，得到MDR1的相對表達量[14]。
(3)Rhodamine-123排染實驗檢測siRNA-PTX-SLNs對細胞P-gp功能的影響：Rhodamine-123是P-gp底物，通過流式細胞儀檢測Rhodamine-123在細胞中的蓄積可以間接地評價P-gp的功能。將MCF-7/ADR細胞按每孔5×105個細胞的密度接種于6孔培養板中，待細胞生長融合率達到約50%，分別加入樣品溶液空白SLNs、LIPO、游離siRNA、游離PTX、游離siRNA+PTX、PTX-SLNs、siRNA-SLNs、siRNA-PTX-SLNs及siRNA-LIPO。培養4 h后，更換新鮮完全培養基繼續培養48 h后棄去培養基，加入2 mL含有2 μg/mL Rhodamine-123的無血清培養基，繼續培養3 h。棄去Rhodamine-123溶液并用PBS清洗細胞三次，胰酶消化細胞獲得單細胞懸液，再次清洗細胞后用0.5 mL PBS重懸，使用流式細胞儀檢測Rhodamine-123在細胞中的蓄積情況：激發光波長為488 nm，發射光波長大于630 nm。將未作其他處理僅給與Rhodamine-123的MCF-7/ADR細胞組做為參比組，即熒光強度為100%，計算各組相對熒光強度。
2 結果
2.1 空白SLNs的細胞毒性研究
結果如圖 1所示，在MCF-7和MCF-7/ADR細胞中，隨著SLNs的增加，細胞存活率均逐漸降低，說明隨著陽離子脂質材料DOTAP的增加，SLNs的細胞毒性逐漸升高，相同結果在商品化LIPO上也存在。對于耐藥細胞MCF-7/ADR，當空白SLNs和商品化LIPO的量增加到對應的含藥載體的siRNA劑量為400 nmol/L時，兩者均表現出明顯的毒性。而當用量降低至200 nmol/L以下時，兩者均無明顯毒性，因此，該制劑的細胞藥效學研究選取對應siRNA劑量為200 nmol/L作為給藥濃度。此外，在親代細胞MCF-7中，SLNs的用量在對應的含藥載體的siRNA劑量為100 nmol/L以下時，未表現出明顯毒性。
圖1
MTT法檢測空白SLN及LIPO在MCF-7/ADR和MCF-7上的細胞毒性(n=5)
Figure1.
Cell toxicity of MCF-7/ADR and MCF-7 after treated with blank SLNs and LIPO (n=5) detected using MTT
2.2 siRNA-PTX-SLNs對腫瘤細胞增殖抑制作用的研究
根據空白SLNs細胞毒性實驗結果，本部分研究中給藥劑量對應為siRNA濃度為50 nmol/L，PTX濃度為40 μg/mL，以排除空白SLNs以及LIPO載體毒性干擾。給藥后腫瘤細胞的增殖抑制結果如圖 2所示。在MCF-7和MCF-7/ADR兩種細胞中，游離siRNA、siRNA-SLNs和siRNA-LIPO均未表現出明顯細胞抑制作用，其細胞存活率均在95%以上，說明在此給藥劑量下，載體本身以及siRNA均無腫瘤細胞抑制作用。相反，除在MCF-7/ADR細胞上的游離PTX組未表現出明顯細胞抑制作用以外，其余含PTX的給藥組在MCF-7和MCF-7/ADR兩種細胞中均表現出不同程度的細胞抑制作用，其中使用SLNs作為載體的PTX-SLNs組和siRNA-PTX-SLNs組的細胞增殖抑制作用顯著高于無載體的游離PTX組和游離siRNA+PTX組(P＜0.05)。更重要的是，在耐藥細胞株MCF-7/ADR中，siRNA-PTX-SLNs的腫瘤細胞抑制作用顯著高于PTX-SLNs組(P＜0.05)，而在親代細胞株MCF-7中，兩組的腫瘤細胞增殖抑制作用未表現出明顯統計學的差異。
圖2
MTT法測定不同給藥組對耐藥細胞MCF-7/ADR和親代細胞MCF-7的增殖抑制作用(n=5)
Figure2.
Inhibitory function to cell viability of MCF-7/ADR and MCF-7 detected using MTT after treated by different preparations (n=5)
2.3 siRNA-PTX-SLNs的細胞藥效學機制研究
2.3.1 PTX-SLNs在MCF-7/ADR上的攝取研究
結果顯示，PTX-SLNs組的PTX攝取指數顯著高于游離PTX組(PTX攝取指數分別為7.07 μg/mg和3.63 μg/mg，P＜0.05)，此結果同腫瘤細胞增殖抑制實驗結果一致。
2.3.2 RT-PCR法檢測siRNA-PTX-SLNs對MDR1基因的沉默作用
本部分采用RT-PCR檢測法對siRNA-PTX-SLNs的MDR1基因沉默作用進行研究。結果如圖 3所示，與未處理組相比，游離PTX組及游離PTX+siRNA組表現出更低的MDR1 mRNA表達水平(P＜0.05)，然而游離siRNA組未表現出明顯差異。此外，以SLNs及LIPO作為載體的PTX-SLNs組、siRNA-SLNs組、siRNA-Lipo組及siRNA-PTX-SLNs組的MDR1mRNA表達水平顯著低于其他所有組(P＜0.05)，其中siRNA-PTX-SLNs組更優于PTX-siRNA組和siRNA-SLNs組(P＜0.05)。
圖3
RT-PCR檢測不同給藥組對耐藥細胞MCF-7/ADR的MDR1沉默作用(n=3)
Figure3.
Quantitative real-time PCR for MDR1 in MCF7/ADR cells showing inhibited expression of MDR1 by siRNA delivered with SLNs (n=3)
2.3.3 Rhodamine-123排染實驗檢測siRNA-PTX-SLNs對細胞P-gp功能的影響
流式細胞檢測結果如圖 4所示，以未處理的MCF-7/ADR細胞為參比，空白SLNs組和LIPO組的相對熒光強度均接近100%，可排除空白SLNs及LIPO對Rhodamine-123在細胞內熒光強度的影響；此外，游離siRNA組也未明顯提高Rhodamine-123在細胞內的相對熒光強度。其余組別均顯著提高了Rhodamine-123在細胞內的相對熒光強度(P＜0.05)，其中也包括游離PTX組、游離siRNA+PTX組及PTX-SLNs組。采用載體傳遞的siRNA組，包括siRNA-SLNs組、siRNA-PTX-SLNs和siRNA-LIPO組均能顯著性提高相對熒光強度(P＜0.05)，更重要的是，與siRNA-SLNs組和PTX-SLNs組相比，siRNA-PTX-SLNs組效率最高(P＜0.05)，最為接近siRNA-LIPO組的效率，這與前述RT-PCR法測定結果相一致。
圖4
流式細胞檢測不同給藥組對Rhodamine-123在細胞中蓄積的影響(n=3)
中文注解
Figure4. Treatment by siRNA loaded with SLNs enhanced Rhodamine-123 accumulation in MCF-7/ADR cells (n=3)英文注解
3 討論
腫瘤細胞接觸抗腫瘤藥物后，對該藥物以及與該藥物化學結構和作用機制不同的其他藥物均可能產生交叉耐藥，這種現象被稱為MDR。MDR已成為臨床上腫瘤化療失敗的主要原因[15]，形成機制復雜，其中MDR1編碼的P-gp在MDR發生機制中起著極為重要的作用[16-17]。目前，國內外研究者針對腫瘤MDR，尤其是針對P-gp所介導的腫瘤MDR已研發了多種治療方法，然而其中多數方法缺乏特異性和安全性，因此在臨床的研究和應用中存在一定的局限性。siRNA是一種長度在21~23 bp的雙鏈RNA分子，可用于誘導基因沉默，即常見的RNA干擾技術，其優點在于設計方便，序列可控，具有高效、特異的基因沉默作用。但siRNA在應用中也存在嚴重的缺陷，即極易被RNA酶降解，且其親水性大分子的性質使其不易透過細胞膜，因此單獨的siRNA給藥后效果并不理想，在臨床的應用中存在障礙。此外，作為臨床上廣為應用的一線抗癌藥物，PTX在MDR機制的研究中應用也十分廣泛，但其水溶性極差的性質也限制了PTX在臨床上的應用。
SLNs是近年發展起來的新一代亞微粒給藥系統，通常采用生物可降解的類脂作為材料，粒徑在10~1000 nm之間，具有低毒性、高載藥量、緩釋以及靶向性等優點[18]。作為一種納米級給藥體系，通過增強滲透與滯留效應(enhanced permeability and retention effect，PR)可被動到達腫瘤組織內部，從而提高藥物在腫瘤細胞內濃度，降低在正常細胞內濃度，克服腫瘤組織水平上的物理障礙，達到高效低毒的目的[19-20]。當藥物到達腫瘤細胞后，即將面臨的便是細胞水平的MDR。為此，在本研究中，我們設計制備了同時包裹可特異性沉默MDR1基因的siRNA與PTX的SLNs藥物傳遞體系siRNA-PTX-SLNs，利用SLNs的性質克服腫瘤組織水平上的障礙，再利用siRNA特異性沉默MDR1基因，以對抗細胞水平上MDR，進而發揮對腫瘤細胞的協同抑制作用[21-22]。實驗結果顯示，在細胞毒性實驗中，僅當空白SLNs用量非常大時才表現出一定的細胞毒性作用，證實該材料具有一定的安全性。在腫瘤細胞增殖抑制實驗中，SLNs作為載體的藥物組比相應游離藥物組的細胞增殖抑制作用顯著提高，一方面說明SLNs能夠提高siRNA的穩定性，并促進siRNA的攝取和基因沉默作用，另一方面說明SLNs也能促進PTX的細胞攝取及其抗腫瘤作用。此外，腫瘤細胞增殖抑制實驗中還發現在耐藥細胞MCF-7/ADR中siRNA和PTX共給藥可以發揮協同作用，而在親代細胞MCF-7中，siRNA和PTX共給藥并未產生更優的抑制作用。由此說明siRNA-PTX-SLNs具有克服腫瘤多藥耐藥性的作用，其機制可能與siRNA下調MDR1的表達有關。PTX的攝取實驗中，PTX-SLNs可以高效地將所包載PTX傳遞進入細胞中，原因可能為陽性脂質DOTAP可以與帶負電荷的細胞表面發生相互作用而更容易進入細胞，進而提高PTX的細胞傳遞效率，增加細胞內藥物濃度，發揮抑制腫瘤細胞作用。通過比較不同給藥組對MDR1基因的沉默作用，結果發現單獨使用siRNA對耐藥細胞中的MDR1表達量基本沒有影響，說明游離siRNA易降解，未能發揮下調作用，但游離PTX組較游離siRNA組表現出更低的MDR1 mRNA表達水平(P＜0.05)，表明PTX具有一定的MDR1表達抑制作用。而使用SLNs包載siRNA時，由于提高siRNA的穩定性和細胞傳遞效率，能夠顯著沉默MDR1的表達。其中siRNA-PTX-SLNs表現出更優的MDR1基因沉默效率，且與siRNA-LIPO的結果相近。眾所周知，LIPO是一種多用途轉染試劑，可在各種貼壁和懸浮細胞系中提供高效轉染，還可以利用LIPO進行基于siRNA的基因表達研究，常作為評價siRNA傳遞系統效率的金標準，在基因沉默實驗中通過高效的轉染可以得到極高的基因沉默水平。因此，本研究構建的siRNA-PTX-SLNs具有與siRNA-LIPO相近的基因沉默效率，這一結果說明該共給藥體系也具有優秀的傳遞siRNA進入細胞發揮特異性基因沉默作用的能力。MDR1基因的沉默作用可導致腫瘤細胞中具有外排藥泵功能的P-gp表達量顯著降低，本實驗采用的Rhodamine-123是一種膜電位敏感的親脂性陽離子熒光材料，能夠快速通過細胞膜，同時還是一種特異性極強的P-gp底物，已有很多研究通過檢測Rhodamine-123在細胞內蓄積的情況，間接反映細胞膜上P-gp水平[23-24]。在Rhodamine-123排染實驗中，給藥組的相對熒光強度越高，表示Rhodamine-123被外排出細胞的量越少，即P-gp功能下降，說明MDR1基因表達下調，這一結果與各給藥組的MDR1基因沉默實驗一致。其中siRNA本身不穩定易被降解，且難以進入細胞發揮沉默作用，因此未顯著提高Rhodamine-123的蓄積，而游離PTX組、游離siRNA+PTX組及PTX-SLNs組的結果說明PTX會促進Rhodamine-123在細胞中的蓄積，采用載體傳遞的siRNA組均能顯著性提高相對熒光強度(P＜0.05)，說明siRNA在載體的幫助下可以進入細胞發揮MDR1沉默作用，從而減少P-gp對Rhodamine-123的外排；此外，同樣作為P-gp底物的抗腫瘤藥物PTX在與MDR1基因特異性siRNA共給藥時，由于MDR1的表達下調而外排減少，提高了PTX在腫瘤細胞中的蓄積，進而發揮更優的腫瘤抑制作用。綜上所述，在MCF-7/ADR細胞上進行的藥效學實驗表明，本研究構建的MDR1特異性siRNA和PTX共給藥體系siRNA-PTX-SLNs，與其他給藥組相比具有更強的MDR1基因沉默作用，能夠抑制P-gp功能，可有效克服腫瘤的多藥耐藥性。
本研究制備的siRNA-PTX-SLNs，一方面利用SLNs的優勢，提高siRNA穩定性及PTX的水溶性，繞開腫瘤水平的生理結構障礙，通過陽性脂質材料促進藥物的細胞攝取；一方面通過siRNA及PTX的共給藥，在細胞學水平上沉默MDR1基因表達，從而抑制藥物外排，促進藥物在腫瘤細胞內積累，達到更好的腫瘤抑制作用。實驗結果顯示其在耐藥腫瘤細胞株中具有明顯的腫瘤抑制作用，說明該給藥體系能通過以上藥理機制，有效克服腫瘤的多藥耐藥性，為以后腫瘤多藥耐藥治療和研究提供了良好的思路，具有重要的意義和廣泛的應用前景。
