微流體技術可能是解決低溫保存過程中所遇到問題的一種有效方法。本文詳細綜述了微流體技術在細胞膜滲透性、保護劑添加與去除、生物材料玻璃化保存三方面的研究進展, 總結了在低溫保存領域應用微流體技術仍可能存在的問題, 并指出了未來的研究方向。
引用本文： 周楠峰, 楊云, 周新麗. 微流體技術在低溫保存領域的研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(3): 702-706. doi: 10.7507/1001-5515.20150128 復制
引言
1949年，Polge等意外發現加了甘油的精子可以經歷低溫而不死亡，自此人們嘗試通過添加保護劑，使得細胞低溫保存后存活率顯著提高。低溫保護劑可分為滲透型和非滲透型兩種，滲透型低溫保護劑在溶液中易結合水分子，發生水合作用，使溶液的黏性增加，從而弱化了水的結晶過程，達到了保護的目的，常用的有甘油、二甲亞砜、乙二醇等；非滲透型低溫保護劑能溶于水，但不能進入細胞，它使溶液呈過冷狀態，即可在特定溫度下降低溶質(電解質)濃度，從而起到保護作用，常用的有蔗糖、白蛋白、聚乙二醇等。到目前為止，人們通過添加保護劑成功保存的人體細胞和組織主要有：血液及其某些組分、精子、胚胎、骨髓細胞、肝細胞、皮膚、角膜、胰腺組織、甲狀腺旁體等。但是對于復雜細胞、組織的低溫保存，技術還遠不夠成熟，例如人類的卵細胞至今還沒有高效的保存方法，人血管低溫保存后出現功能損傷，以及還未成功地低溫保存人類的器官等。
根據Mazur的“兩因素假說”，造成細胞低溫損傷有兩個獨立的因素：一是細胞內外冰晶形成造成的“冰晶損傷”，另一是高濃度的低溫保護劑產生的高滲透壓差，引起細胞體積的膨脹或收縮，造成的“溶液損傷”。研究者們嘗試多種方法減小細胞低溫損傷，如采用玻璃化保存方法減少冰晶損傷[1]，采用保護劑的分步添加和去除減少溶液損傷[2]等。
微流體技術是指在微觀尺度下控制操作復雜流體的技術(通常是10-9~10-18 L)，由于細胞和其管道寬度大小相當，所以非常容易對細胞進行操作和控制。該技術的發展已經在細胞分析方面表現出重要的應用。例如，細胞培養[3-6]、細胞分選[7-10]、細胞捕獲[11-13]、細胞裂解[14-18]等。這些研究表明微流體技術可以用于控制細胞的運動以及改變細胞周圍環境的濃度，可能是解決低溫保存過程中所遇到問題的一種有效方法。
1 微流體在細胞膜滲透特性研究中的應用
低溫保存方案的制定和優化與所保存細胞的細胞膜滲透特性直接相關，研究細胞膜對水的滲透系數Lp、對低溫保護劑的滲透系數Ps，以及相互作用系數σ，對于確定某種細胞的保護劑添加/去除最佳方案、最佳冷凍/復溫速率，有重要的指導意義。
為了精確地測量細胞膜的滲透特性，人們發明了多種方法來定量觀察細胞對滲透壓的動態反應。其中，停流法、庫爾特計數器法以及擴散腔法等應用較為廣泛。Chen等[19]使用微流體灌輸技術，來測量細胞體積的動態變化，從而確定細胞膜的滲透特性。該裝置的制作材料為聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)，由溫度控制和微流體灌注腔兩部分組成。溫度控制裝置能夠將系統的溫度控制在-20~40℃，微流體灌注腔的高度為20μm，比老鼠樹突細胞的直徑(10~15μm)略大，可限制細胞在微流體灌注腔內呈單層分布。具體操作步驟：首先，將磷酸鹽緩沖鹽水和細胞懸液先后注入灌注腔，然后向灌注腔內注射含有不同濃度硫酸二甲酯的磷酸鹽緩沖鹽水，用CCD攝像機記錄下t分別為-10、0、10、20、35、60 s時細胞體積變化，用Matlab軟件計算圖像中每個細胞的像素點數，從而估算細胞體積。與常規的方法相比，利用該裝置研究細胞膜滲透特性有很多優點：此裝置可以直接用于觀察、追蹤、分析非等滲環境中單個細胞體積的變化，微流體灌注腔可防止細胞有重疊或者移出聚焦平面的情況，且腔內溶液的成分和溫度可以迅速改變，用于研究不同濃度、溫度下細胞膜的滲透性質。
之后，Wang等[20]利用上述裝置對昆蟲卵巢細胞膜的滲透性質進行了研究，在25、15、5、-2℃條件下，將昆蟲卵巢細胞從磷酸鹽緩沖溶液中分別轉移到1.0、1.5、2.0 mol/L的甘油溶液中，用CCD攝像機和數字攝像機記錄細胞體積變化。研究發現：在15~25℃之間，Lp值隨著低溫保護劑濃度的增加而急劇降低，并且隨著溫度的降低，細胞膜的Lp值反而增加；Ps值、Elp值、Eps值在所有溫度條件下對于甘油濃度的變化并沒有明顯的改變。
2 微流體在保護劑添加和去除方面的應用
為了減少細胞在低溫保護劑添加/去除過程中的滲透損傷，通常采用一步法和分步法進行保護劑的添加和去除。分步法對細胞的損傷明顯要比一步法小很多，但分步法需要將細胞在不同濃度的溶液間多次轉移，非常容易造成細胞的丟失，對操作人員的熟練程度要求很高；同時保護劑濃度的突然變化會造成細胞體積的突然變化，而且細胞在高濃度低溫保護劑中的暴露時間較長。因此，為了減小保護劑濃度的突然改變對細胞造成的滲透沖擊以及細胞在高濃度保護劑中的毒性損傷，有研究者將微流體技術應用于細胞低溫保護劑的添加與去除，實現了保護劑濃度的連續變化，從而提高了細胞低溫保存的存活率。
2.1 微流體在小體積細胞保護劑去除中的應用
低溫保存的臍帶血、紅細胞等小體積細胞在臨床應用之前需要進行保護劑洗脫，常用采用的方法是離心去除法，但細胞損失率較高，約30%。為解決此類問題，Hubel等[21-22]提出利用微流體裝置實現保護劑的去除，具體方案有兩種：一種是沖洗液和細胞懸液兩股液體在矩形微通道內水平流動，其中上層是沖洗液層，下層是細胞懸液層。流體流動過程中，低溫保護劑由下層向上層擴散，在出口處兩股流體分開，從而達到洗脫的目的；另一種是沖洗液和細胞懸液三股液體在矩形微通道內垂直流動，管道中心是細胞懸液層，兩邊是沖洗液層，流體流動過程中，低溫保護劑由中心向兩邊擴散，在出口處三股流體分開，從而達到洗脫的目的。與水平兩流去除方式相比，垂直三流法流體接觸面積更大，洗脫效率更高，去除率在95%以上。
為研究細胞懸液中低溫保護劑的去除方式，Mata等[23-24]制作了兩入口的微流體低溫保護劑去除裝置，同時進行了兩組實驗。實驗一：用注射泵將磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)和二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)溶液(PBS+10%DMSO)分別從裝置的頂部和底部注入矩形微通道(75 mm×25 mm×0.5 mm)中，進入微通道的兩股流體會被分隔板分離，底層為DMSO溶液，頂層是磷酸鹽緩沖溶液。用CCD、分光光度計測量流體流動過程中的流速和DMSO的濃度。研究表明：流體流速越快、流量分數越大，擴散到頂層的DMSO越少，DMSO的去除率越低。實驗二：將實驗一中的DMSO溶液分別換成細胞體積分數為2%、8%、20%的DMSO溶液(PBS+10%DMSO)，實驗步驟和測量方法與實驗一相同。研究表明：DMSO溶液中體積分數為2%的淋巴細胞不會影響DMSO在溶液中的擴散，流量分數越大，細胞體積分數越小，流速越快，細胞回收率越高。
為了提高細胞懸浮液中DMSO的去除效率，Hanna等[25]制作了垂直三流的微流體裝置，中心流是DMSO溶液，兩邊流是磷酸鹽緩沖溶液，垂直流動過程中DMSO從中心流向兩邊的沖洗流中擴散。研究發現：DMSO溶液中DMSO的濃度隨著(1/Pe)×(L/D)值的增加而減小，對于一個給定的(1/Pe)×(L/D)值，DMSO的去除率隨著流量分數的增加而減小。與水平兩流相比，垂直三流增加了流體的接觸面積，有利于DMSO的擴散，提高了裝置的性能，裝置長度為原先的1/4，流速為原先的4倍。但是要達到較大處理量和95%的去除率，仍需要采用多級串聯的方式。
受三入口式細胞保護劑去除裝置的啟發，Song等[26]制作了尺寸為長1.5 m×寬100μm×高100μm的三入口式微流體低溫保護劑添加裝置，細胞流從中間入口進入，保護劑從兩邊入口進入，隨著細胞在通道內流動，保護劑逐漸向中心擴散，實現了沿著通道方向保護劑濃度的連續改變。用一步法和微流體法分別對肝細胞進行低溫保護劑[2 mol/L丙二醇(propylene glycol，PROH)]的添加，然后用相同的方法在-80℃進行低溫保存，之后在37℃水浴中復溫，結果顯示：與一步法相比，使用微流體法對肝細胞進行低溫保護劑的加載，細胞的存活率提高了15%。對于更高濃度的低溫保護劑3 mol/L PROH，采用一步法、兩步法(1.5 mol/L)和微流體法進行添加，結果表明：利用微流體法處理肝細胞，肝細胞的存活率比一步法高25%，比兩步法高10%。因此，使用微流體法添加低溫保護劑，能夠實現低溫保護劑濃度的連續變化，減小低溫保護劑對細胞造成的滲透損傷，提高細胞的存活率。
2.2 微流體在大體積細胞保護劑添加中的應用
對于大體積細胞低溫保護劑的添加與去除, 如卵母細胞, 上述微流體裝置并不合適，因為卵母細胞體積較大，直徑大于100μm。在臨床上多是單個細胞操作，其在微流體通道內的流動、滲透等行為不同于小體積細胞，因此，有研究者針對微流體應用于卵母細胞低溫保存進行了研究。
Heo等[27]制作了應用于卵母細胞低溫保護劑添加的微流體裝置。該裝置包括溶液混合通道、卵母細胞操作腔、細胞進出通道等，混合通道長2 cm，卵母細胞操作腔的尺寸為長900μm×寬600μm×高200μm。實驗的具體步驟：首先將卵母細胞加入到卵母細胞操作腔內，然后通過兩個獨立工作的注射泵，分別將基礎液和1.5 mol/L PROH溶液注入微流體通道內，兩股流體在混合通道內擴散混合，充分混合后的保護劑溶液流經卵母細胞操作腔，對卵母細胞進行低溫保護劑的連續添加。實驗中用CCD攝像機每3 s記錄一次細胞狀態，用體積和橫截面積的關系計算每一點上細胞的體積。研究發現：該系統能在15 min內實現卵母細胞低溫保護劑的完全添加，且細胞體積變化小于10%。通過檢測卵母細胞的形態變化，包括卵母細胞的形態和顏色、透明帶的完整性等，發現卵母細胞的發育能力沒有受到破壞。
3 微流體在生物材料玻璃化保存中的應用
玻璃化保存已被廣泛地用于各種生物材料的低溫保存中，常用的玻璃化保存方法有：微液滴法、冷凍環法、Cryotop法等，但是上述方法生物材料直接與液氮接觸，液氮在生物材料的表面蒸發時，形成一層氣膜，減小了生物材料與液氮之間的換熱系數，不利于快速降溫，且液氮內潛在的污染源會對生物材料造成污染。近年來，有研究者將微流體技術用于玻璃化低溫保存，通過減小添加到細胞表面的低溫保護劑的體積，提高傳熱系數等，達到超快速的降復溫速率。
Li等[28]制作了一種可控溫的微流體裝置，該裝置主要由PDMS模塊和玻璃芯片兩部分組成。PDMS模塊在上，玻璃芯片在下，中間有一層200 nm用作電絕緣的SiO2；PDMS上有微流體管道和微腔，微流體管道的尺寸為寬80μm×深50μm，微腔的尺寸為長1 480μm×寬1 200μm×深50μm；玻璃芯片上有微加熱器和溫度傳感器，微加熱器為雙螺旋結構，使得微腔里的溫度分布更均勻。用上述裝置進行對比實驗，具體操作步驟：用微量移液器分別向兩塊相同芯片的微腔注射0.3μL已制備好的酵母菌細胞懸液，將兩芯片放于液氮蒸汽環境中，一芯片不做任何控溫處理，另一芯片手動控制微加熱器的功率，使得微腔的溫度保持在-20~-40℃之間，持續3 min，然后關閉微加熱器，20 min后，將兩裝置放在室溫下復溫。用消毒去離子水注射微腔，重復10次，收集微腔中的樣品溶液，然后以1∶103、1∶104、1∶105的比率對收集到的樣本進行稀釋，取50μL樣品溶液，在30℃條件下培養兩天，通過計算菌落數測定酵母菌細胞的成活率。結果顯示：沒有溫度控制的保存方法，細胞的存活率僅為27%，而有溫度控制的芯片保存方法，細胞的存活率約為74%，細胞的存活率有很大提高。但相比于傳統保存方法，細胞存活率并沒有提高，仍需要繼續探索研究。
Zou等[29]提出了一種在不使用低溫保護劑的情況下超快速低溫保存少量精子的微流體裝置。該裝置主要包括精子入口、精子存儲管道、精子出口三部分。為了優化裝置尺寸，設計了10、50、100μm三種管道高度，管道寬度均為10μm，管道長度均為5 cm。實驗的具體步驟是首先在顯微鏡視野下用微注射器將精子樣品注入芯片內的精子存儲管道，當精子充滿整個存儲管道時停止注射。用銀紙將整個芯片包好投入到液氮中。低溫保存72 h后取出，復溫后，將芯片中的精子移到組織培養盤中，對其活性、發育能力、頂體和DNA完整性進行測試。結果表明：10μm高的微管道PDMS芯片與傳統保存方法相比無明顯差異，可以用于在無低溫保護劑條件下少量精子的超快速低溫保存。上述基于微流體芯片的低溫保存方法與傳統的低溫保存方法相比，有以下優勢：①由于管道高度僅為10μm，使得流體體積小且精確，達到5×10-3μL，有較大的比表面積，升降溫速率較快。②不需要使用低溫保護劑，可以避免低溫保護劑對細胞造成的毒性損傷，同時簡化了復溫程序，省去了低溫保護劑的洗脫步驟。
為了提高低溫保存降溫過程中的傳熱系數，Zhou等[30]提出了一種用于玻璃化保存的新型微流體系統。該裝置主要由兩層銅片和一個生物材料固定框組成，生物材料固定框位于兩層銅片之間，構成一個微腔。銅片表面蝕刻有微管道陣列，允許流體在其中流動，提高系統外部的換熱系數。針對不同厚度的生物材料，固定框的高度可靈活調節，使得該系統在保存不同的樣品時具有良好的靈活性。基于所提出的理論模型，研究了傳熱系數和芯片厚度對于冷卻速率的影響，模擬結果表明：當傳熱系數高于1×104 W/(m2·k)時，冷卻速率將大于4 000℃/min，在使用高濃度低溫保護劑的情形下，這樣的冷卻速率可以實現生物材料的完全玻璃化。同時，減小樣品的厚度，可增大比表面積，從而大大地提升冷卻速率，當樣品厚度為50μm時，系統的降溫速率有可能達到1×106℃/min。該微流體裝置的優勢是能夠顯著增加樣品的比表面積，有效地提高傳熱系數，從而提高降溫速率，實現生物材料的玻璃化保存。
4 總結與展望
目前，微流體技術已經廣泛應用于細胞膜滲透特性研究、保護劑添加和去除以及生物材料的玻璃化保存，可能會為未來低溫保存的發展提供新途徑和新思路。但仍存在著很多不足：①關于微流體通道內混合流動時速度場、濃度場的變化規律并不是非常明確，并且細胞內保護劑濃度、細胞在保護劑中的暴露時間、細胞體積改變量對細胞低溫保存存活率、發育潛能的影響之間的耦合關系也不得而知；②在大量小體積細胞低溫保護劑的去除方面，受重力作用的影響，細胞容易在微通道底層聚集，導致保護劑的去除效率降低，且聚集的細胞容易堵塞微通道；③在低溫保存領域，由于微流體芯片的制作材料多為有機高分子聚合物(PDMS、聚乙烯、聚丙烯等)，其較大的熱質量和較小的熱導率限制了傳熱效率，與傳統方法相比，細胞存活率并沒有較大的提升。
引言
1949年，Polge等意外發現加了甘油的精子可以經歷低溫而不死亡，自此人們嘗試通過添加保護劑，使得細胞低溫保存后存活率顯著提高。低溫保護劑可分為滲透型和非滲透型兩種，滲透型低溫保護劑在溶液中易結合水分子，發生水合作用，使溶液的黏性增加，從而弱化了水的結晶過程，達到了保護的目的，常用的有甘油、二甲亞砜、乙二醇等；非滲透型低溫保護劑能溶于水，但不能進入細胞，它使溶液呈過冷狀態，即可在特定溫度下降低溶質(電解質)濃度，從而起到保護作用，常用的有蔗糖、白蛋白、聚乙二醇等。到目前為止，人們通過添加保護劑成功保存的人體細胞和組織主要有：血液及其某些組分、精子、胚胎、骨髓細胞、肝細胞、皮膚、角膜、胰腺組織、甲狀腺旁體等。但是對于復雜細胞、組織的低溫保存，技術還遠不夠成熟，例如人類的卵細胞至今還沒有高效的保存方法，人血管低溫保存后出現功能損傷，以及還未成功地低溫保存人類的器官等。
根據Mazur的“兩因素假說”，造成細胞低溫損傷有兩個獨立的因素：一是細胞內外冰晶形成造成的“冰晶損傷”，另一是高濃度的低溫保護劑產生的高滲透壓差，引起細胞體積的膨脹或收縮，造成的“溶液損傷”。研究者們嘗試多種方法減小細胞低溫損傷，如采用玻璃化保存方法減少冰晶損傷[1]，采用保護劑的分步添加和去除減少溶液損傷[2]等。
微流體技術是指在微觀尺度下控制操作復雜流體的技術(通常是10-9~10-18 L)，由于細胞和其管道寬度大小相當，所以非常容易對細胞進行操作和控制。該技術的發展已經在細胞分析方面表現出重要的應用。例如，細胞培養[3-6]、細胞分選[7-10]、細胞捕獲[11-13]、細胞裂解[14-18]等。這些研究表明微流體技術可以用于控制細胞的運動以及改變細胞周圍環境的濃度，可能是解決低溫保存過程中所遇到問題的一種有效方法。
1 微流體在細胞膜滲透特性研究中的應用
低溫保存方案的制定和優化與所保存細胞的細胞膜滲透特性直接相關，研究細胞膜對水的滲透系數Lp、對低溫保護劑的滲透系數Ps，以及相互作用系數σ，對于確定某種細胞的保護劑添加/去除最佳方案、最佳冷凍/復溫速率，有重要的指導意義。
為了精確地測量細胞膜的滲透特性，人們發明了多種方法來定量觀察細胞對滲透壓的動態反應。其中，停流法、庫爾特計數器法以及擴散腔法等應用較為廣泛。Chen等[19]使用微流體灌輸技術，來測量細胞體積的動態變化，從而確定細胞膜的滲透特性。該裝置的制作材料為聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)，由溫度控制和微流體灌注腔兩部分組成。溫度控制裝置能夠將系統的溫度控制在-20~40℃，微流體灌注腔的高度為20μm，比老鼠樹突細胞的直徑(10~15μm)略大，可限制細胞在微流體灌注腔內呈單層分布。具體操作步驟：首先，將磷酸鹽緩沖鹽水和細胞懸液先后注入灌注腔，然后向灌注腔內注射含有不同濃度硫酸二甲酯的磷酸鹽緩沖鹽水，用CCD攝像機記錄下t分別為-10、0、10、20、35、60 s時細胞體積變化，用Matlab軟件計算圖像中每個細胞的像素點數，從而估算細胞體積。與常規的方法相比，利用該裝置研究細胞膜滲透特性有很多優點：此裝置可以直接用于觀察、追蹤、分析非等滲環境中單個細胞體積的變化，微流體灌注腔可防止細胞有重疊或者移出聚焦平面的情況，且腔內溶液的成分和溫度可以迅速改變，用于研究不同濃度、溫度下細胞膜的滲透性質。
之后，Wang等[20]利用上述裝置對昆蟲卵巢細胞膜的滲透性質進行了研究，在25、15、5、-2℃條件下，將昆蟲卵巢細胞從磷酸鹽緩沖溶液中分別轉移到1.0、1.5、2.0 mol/L的甘油溶液中，用CCD攝像機和數字攝像機記錄細胞體積變化。研究發現：在15~25℃之間，Lp值隨著低溫保護劑濃度的增加而急劇降低，并且隨著溫度的降低，細胞膜的Lp值反而增加；Ps值、Elp值、Eps值在所有溫度條件下對于甘油濃度的變化并沒有明顯的改變。
2 微流體在保護劑添加和去除方面的應用
為了減少細胞在低溫保護劑添加/去除過程中的滲透損傷，通常采用一步法和分步法進行保護劑的添加和去除。分步法對細胞的損傷明顯要比一步法小很多，但分步法需要將細胞在不同濃度的溶液間多次轉移，非常容易造成細胞的丟失，對操作人員的熟練程度要求很高；同時保護劑濃度的突然變化會造成細胞體積的突然變化，而且細胞在高濃度低溫保護劑中的暴露時間較長。因此，為了減小保護劑濃度的突然改變對細胞造成的滲透沖擊以及細胞在高濃度保護劑中的毒性損傷，有研究者將微流體技術應用于細胞低溫保護劑的添加與去除，實現了保護劑濃度的連續變化，從而提高了細胞低溫保存的存活率。
2.1 微流體在小體積細胞保護劑去除中的應用
低溫保存的臍帶血、紅細胞等小體積細胞在臨床應用之前需要進行保護劑洗脫，常用采用的方法是離心去除法，但細胞損失率較高，約30%。為解決此類問題，Hubel等[21-22]提出利用微流體裝置實現保護劑的去除，具體方案有兩種：一種是沖洗液和細胞懸液兩股液體在矩形微通道內水平流動，其中上層是沖洗液層，下層是細胞懸液層。流體流動過程中，低溫保護劑由下層向上層擴散，在出口處兩股流體分開，從而達到洗脫的目的；另一種是沖洗液和細胞懸液三股液體在矩形微通道內垂直流動，管道中心是細胞懸液層，兩邊是沖洗液層，流體流動過程中，低溫保護劑由中心向兩邊擴散，在出口處三股流體分開，從而達到洗脫的目的。與水平兩流去除方式相比，垂直三流法流體接觸面積更大，洗脫效率更高，去除率在95%以上。
為研究細胞懸液中低溫保護劑的去除方式，Mata等[23-24]制作了兩入口的微流體低溫保護劑去除裝置，同時進行了兩組實驗。實驗一：用注射泵將磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)和二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)溶液(PBS+10%DMSO)分別從裝置的頂部和底部注入矩形微通道(75 mm×25 mm×0.5 mm)中，進入微通道的兩股流體會被分隔板分離，底層為DMSO溶液，頂層是磷酸鹽緩沖溶液。用CCD、分光光度計測量流體流動過程中的流速和DMSO的濃度。研究表明：流體流速越快、流量分數越大，擴散到頂層的DMSO越少，DMSO的去除率越低。實驗二：將實驗一中的DMSO溶液分別換成細胞體積分數為2%、8%、20%的DMSO溶液(PBS+10%DMSO)，實驗步驟和測量方法與實驗一相同。研究表明：DMSO溶液中體積分數為2%的淋巴細胞不會影響DMSO在溶液中的擴散，流量分數越大，細胞體積分數越小，流速越快，細胞回收率越高。
為了提高細胞懸浮液中DMSO的去除效率，Hanna等[25]制作了垂直三流的微流體裝置，中心流是DMSO溶液，兩邊流是磷酸鹽緩沖溶液，垂直流動過程中DMSO從中心流向兩邊的沖洗流中擴散。研究發現：DMSO溶液中DMSO的濃度隨著(1/Pe)×(L/D)值的增加而減小，對于一個給定的(1/Pe)×(L/D)值，DMSO的去除率隨著流量分數的增加而減小。與水平兩流相比，垂直三流增加了流體的接觸面積，有利于DMSO的擴散，提高了裝置的性能，裝置長度為原先的1/4，流速為原先的4倍。但是要達到較大處理量和95%的去除率，仍需要采用多級串聯的方式。
受三入口式細胞保護劑去除裝置的啟發，Song等[26]制作了尺寸為長1.5 m×寬100μm×高100μm的三入口式微流體低溫保護劑添加裝置，細胞流從中間入口進入，保護劑從兩邊入口進入，隨著細胞在通道內流動，保護劑逐漸向中心擴散，實現了沿著通道方向保護劑濃度的連續改變。用一步法和微流體法分別對肝細胞進行低溫保護劑[2 mol/L丙二醇(propylene glycol，PROH)]的添加，然后用相同的方法在-80℃進行低溫保存，之后在37℃水浴中復溫，結果顯示：與一步法相比，使用微流體法對肝細胞進行低溫保護劑的加載，細胞的存活率提高了15%。對于更高濃度的低溫保護劑3 mol/L PROH，采用一步法、兩步法(1.5 mol/L)和微流體法進行添加，結果表明：利用微流體法處理肝細胞，肝細胞的存活率比一步法高25%，比兩步法高10%。因此，使用微流體法添加低溫保護劑，能夠實現低溫保護劑濃度的連續變化，減小低溫保護劑對細胞造成的滲透損傷，提高細胞的存活率。
2.2 微流體在大體積細胞保護劑添加中的應用
對于大體積細胞低溫保護劑的添加與去除, 如卵母細胞, 上述微流體裝置并不合適，因為卵母細胞體積較大，直徑大于100μm。在臨床上多是單個細胞操作，其在微流體通道內的流動、滲透等行為不同于小體積細胞，因此，有研究者針對微流體應用于卵母細胞低溫保存進行了研究。
Heo等[27]制作了應用于卵母細胞低溫保護劑添加的微流體裝置。該裝置包括溶液混合通道、卵母細胞操作腔、細胞進出通道等，混合通道長2 cm，卵母細胞操作腔的尺寸為長900μm×寬600μm×高200μm。實驗的具體步驟：首先將卵母細胞加入到卵母細胞操作腔內，然后通過兩個獨立工作的注射泵，分別將基礎液和1.5 mol/L PROH溶液注入微流體通道內，兩股流體在混合通道內擴散混合，充分混合后的保護劑溶液流經卵母細胞操作腔，對卵母細胞進行低溫保護劑的連續添加。實驗中用CCD攝像機每3 s記錄一次細胞狀態，用體積和橫截面積的關系計算每一點上細胞的體積。研究發現：該系統能在15 min內實現卵母細胞低溫保護劑的完全添加，且細胞體積變化小于10%。通過檢測卵母細胞的形態變化，包括卵母細胞的形態和顏色、透明帶的完整性等，發現卵母細胞的發育能力沒有受到破壞。
3 微流體在生物材料玻璃化保存中的應用
玻璃化保存已被廣泛地用于各種生物材料的低溫保存中，常用的玻璃化保存方法有：微液滴法、冷凍環法、Cryotop法等，但是上述方法生物材料直接與液氮接觸，液氮在生物材料的表面蒸發時，形成一層氣膜，減小了生物材料與液氮之間的換熱系數，不利于快速降溫，且液氮內潛在的污染源會對生物材料造成污染。近年來，有研究者將微流體技術用于玻璃化低溫保存，通過減小添加到細胞表面的低溫保護劑的體積，提高傳熱系數等，達到超快速的降復溫速率。
Li等[28]制作了一種可控溫的微流體裝置，該裝置主要由PDMS模塊和玻璃芯片兩部分組成。PDMS模塊在上，玻璃芯片在下，中間有一層200 nm用作電絕緣的SiO2；PDMS上有微流體管道和微腔，微流體管道的尺寸為寬80μm×深50μm，微腔的尺寸為長1 480μm×寬1 200μm×深50μm；玻璃芯片上有微加熱器和溫度傳感器，微加熱器為雙螺旋結構，使得微腔里的溫度分布更均勻。用上述裝置進行對比實驗，具體操作步驟：用微量移液器分別向兩塊相同芯片的微腔注射0.3μL已制備好的酵母菌細胞懸液，將兩芯片放于液氮蒸汽環境中，一芯片不做任何控溫處理，另一芯片手動控制微加熱器的功率，使得微腔的溫度保持在-20~-40℃之間，持續3 min，然后關閉微加熱器，20 min后，將兩裝置放在室溫下復溫。用消毒去離子水注射微腔，重復10次，收集微腔中的樣品溶液，然后以1∶103、1∶104、1∶105的比率對收集到的樣本進行稀釋，取50μL樣品溶液，在30℃條件下培養兩天，通過計算菌落數測定酵母菌細胞的成活率。結果顯示：沒有溫度控制的保存方法，細胞的存活率僅為27%，而有溫度控制的芯片保存方法，細胞的存活率約為74%，細胞的存活率有很大提高。但相比于傳統保存方法，細胞存活率并沒有提高，仍需要繼續探索研究。
Zou等[29]提出了一種在不使用低溫保護劑的情況下超快速低溫保存少量精子的微流體裝置。該裝置主要包括精子入口、精子存儲管道、精子出口三部分。為了優化裝置尺寸，設計了10、50、100μm三種管道高度，管道寬度均為10μm，管道長度均為5 cm。實驗的具體步驟是首先在顯微鏡視野下用微注射器將精子樣品注入芯片內的精子存儲管道，當精子充滿整個存儲管道時停止注射。用銀紙將整個芯片包好投入到液氮中。低溫保存72 h后取出，復溫后，將芯片中的精子移到組織培養盤中，對其活性、發育能力、頂體和DNA完整性進行測試。結果表明：10μm高的微管道PDMS芯片與傳統保存方法相比無明顯差異，可以用于在無低溫保護劑條件下少量精子的超快速低溫保存。上述基于微流體芯片的低溫保存方法與傳統的低溫保存方法相比，有以下優勢：①由于管道高度僅為10μm，使得流體體積小且精確，達到5×10-3μL，有較大的比表面積，升降溫速率較快。②不需要使用低溫保護劑，可以避免低溫保護劑對細胞造成的毒性損傷，同時簡化了復溫程序，省去了低溫保護劑的洗脫步驟。
為了提高低溫保存降溫過程中的傳熱系數，Zhou等[30]提出了一種用于玻璃化保存的新型微流體系統。該裝置主要由兩層銅片和一個生物材料固定框組成，生物材料固定框位于兩層銅片之間，構成一個微腔。銅片表面蝕刻有微管道陣列，允許流體在其中流動，提高系統外部的換熱系數。針對不同厚度的生物材料，固定框的高度可靈活調節，使得該系統在保存不同的樣品時具有良好的靈活性。基于所提出的理論模型，研究了傳熱系數和芯片厚度對于冷卻速率的影響，模擬結果表明：當傳熱系數高于1×104 W/(m2·k)時，冷卻速率將大于4 000℃/min，在使用高濃度低溫保護劑的情形下，這樣的冷卻速率可以實現生物材料的完全玻璃化。同時，減小樣品的厚度，可增大比表面積，從而大大地提升冷卻速率，當樣品厚度為50μm時，系統的降溫速率有可能達到1×106℃/min。該微流體裝置的優勢是能夠顯著增加樣品的比表面積，有效地提高傳熱系數，從而提高降溫速率，實現生物材料的玻璃化保存。
4 總結與展望
目前，微流體技術已經廣泛應用于細胞膜滲透特性研究、保護劑添加和去除以及生物材料的玻璃化保存，可能會為未來低溫保存的發展提供新途徑和新思路。但仍存在著很多不足：①關于微流體通道內混合流動時速度場、濃度場的變化規律并不是非常明確，并且細胞內保護劑濃度、細胞在保護劑中的暴露時間、細胞體積改變量對細胞低溫保存存活率、發育潛能的影響之間的耦合關系也不得而知；②在大量小體積細胞低溫保護劑的去除方面，受重力作用的影響，細胞容易在微通道底層聚集，導致保護劑的去除效率降低，且聚集的細胞容易堵塞微通道；③在低溫保存領域，由于微流體芯片的制作材料多為有機高分子聚合物(PDMS、聚乙烯、聚丙烯等)，其較大的熱質量和較小的熱導率限制了傳熱效率，與傳統方法相比，細胞存活率并沒有較大的提升。