為了定量檢測動物源性生物材料中殘留α-Gal抗原含量, 本實驗室建立了M86抗體的ELISA抑制法。用兔血紅細胞制備標準曲線, 以Galα-1, 3-Gal/BSA為固相抗原, 利用特異性抗α-Gal單抗M86與待測物反應, 再取上清液中剩余的M86抗體與固相抗原反應后檢測待測物中α-Gal抗原含量。結果顯示其標準曲線的R2=0.999, 具有很好的相關性; 經α-Gal陽性和陰性材料的驗證證實其具有較好的靈敏性和特異性。利用該方法考察了大鼠組織、動物源性脫細胞生物材料、豬真皮處理前后α-Gal抗原的表達特征。該方法有望成為評價動物源性生物材料及其衍生物α-Gal抗原殘留的一種有效方法。
引用本文： 單永強, 徐麗明, 柯林楠, 陸艷, 邵安良, 章娜, 曾碧新. 動物源性生物材料中殘留α-Gal抗原檢測方法. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(3): 662-668, 679. doi: 10.7507/1001-5515.20150120 復制
引言
已有研究顯示α-半乳糖基抗原(α-1, 3-galactosyle，α-Gal)是動物源性生物材料或異種器官移植超急性免疫排斥反應中的主要靶抗原[1-5]。α-Gal的結構為Galα-1，3-Galβ-1，4-GlcNAc-R，該抗原是半乳糖基與細胞膜上的蛋白或脂結合構成的一組完全性抗原[6]。它表達于除人、猿和古世紀猴外的所有哺乳動物體內，只是種類和個體間表達量有差異[7]。
α-Gal主要受α-1，3半乳糖基轉移酶(α-1, 3-galactosyltransferase, α-GT)及異紅細胞糖苷酯合成酶(isoglobotriosylceramide synthase或isogloboside 3 synthase, iGb3S)調控。由于人體及類人猿、古世紀猴的半乳糖苷轉移酶基因有2個堿基錯位變異而不表達Gal抗原[7-8]，但人腸道菌群持續表達Gal抗原，這種刺激致使人體免疫系統持續產生抗Gal抗體，達到循環免疫球蛋白(IgM和IgA)的1%~3%[9-11]。因此當人體接受含有Gal抗原的生物材料或異種器官移植時，會引起超急性免疫排斥反應及慢性的免疫毒性反應。動物源性生物材料或異種器官移植中Gal抗原的去除成為降低免疫排斥和慢性免疫毒性反應的關鍵。通常情況下，為減少動物源性生物材料的免疫原性，需通過脫細胞工藝以消除殘留的細胞成分及異源性的抗原物質。然而，因為要保證處理過程盡量不影響材料有機結構、超微結構、機械性能及胞外基質支架的生物活性，有些處理并不能完全去除膜碎片等細胞材料殘留物。存在于殘留物中的抗原(如Gal抗原)會引起急性、超急性排斥反應、慢性免疫排斥反應和免疫毒性，進而影響損傷愈合或導致器官移植患者手術失敗，目前急需建立能有效評價動物源性生物材料中Gal抗原含量的方法。
為了證實異源組織中是否含有(或是含有多少)Gal抗原，早在1983年Eckhardta等[12]采用與凝集素聯用的免疫印染法，測定了鼠、兔、豬、牛等動物體內細胞表面α-Gal抗原表位的數量。但由于西非單葉豆凝集素(griffonia simplicifdia-IB4, GS-IB4)特異性不高，若細胞中α-Gal抗原表位含量少，則不能檢出。Mckenzie等[13]用I標記的XNA和GS-IB4與豬動脈血管內皮細胞和淋巴細胞結合，利用放射性自顯影技術確立α-Gal是一組而非一種糖蛋白或糖脂，但是這種方法也不能作為定量檢測。2005年曾令宇等[14]利用激光共聚焦及流式細胞術(flow cytometry, FCM)檢測豬血細胞與FITC—BS IB4的結合，建立了無創、快速半定量檢測豬細胞表面α-Gal的方法。上述方法均局限于細胞水平檢測，至于如何檢測動物源性生物材料中殘留的α-Gal抗原，目前尚無標準化的方法。
Galili等[15]將1988年建立的GS-IB4方法進行了優化，用兔血紅細胞免疫α-1, 3-半乳糖苷轉移酶基因敲除小鼠，提取小鼠脾細胞，使其與雜交瘤細胞融合，分離出單個雜交瘤細胞，再將α-Gal/BSA作為固相抗原，用ELISA法篩選單克隆抗Gal IgM，即M86。對于新鮮組織或去細胞化的組織，M86均適用。Galili等[15]用SP2/0小鼠骨髓瘤細胞和兔血紅細胞作為標準曲線測定動物組織中的Gal抗原數。他們的研究認為，相對于SP2/0小鼠骨髓瘤細胞來說，兔血在4℃時可以保存更久，而且取材方便，所以用兔血做標準曲線更方便實用。利用M86的酶聯免疫抑制法測定細胞或勻漿組織中的α-Gal抗原表位，從而提高了檢測的敏感性和特異性。然而，文獻中報道的方法中無論是采用小鼠骨髓瘤細胞還是兔血紅細胞制備標準曲線，其小鼠骨髓瘤細胞α-Gal抗原表位數的定值只是依據作者既往的早期研究和特定的實驗體系確定的，他人很難溯源。另外，作者是通過IB4確定的小鼠骨髓瘤細胞的抗原數約為1×106/Cell(實際檢測數據為1.2×106/Cell)[7]，用IB4檢測Gal抗原與M86相比靈敏性較低[15]。而兔血紅細胞的抗原數又是依據在同一反應體系中兔血紅細胞的敏感性是小鼠骨髓瘤細胞的2倍，所以定為2×106/Cell[15]，缺乏科學依據。
本實驗室參考文獻中介紹的方法，改進Naso等[16-17]的實驗方案，利用人工合成的Galα-1, 3-Gal/BSA為標準品，為兔血紅細胞的α-1, 3-Gal抗原表位數重新定值；然后以定值后的兔血進行系列倍比稀釋，制作檢測用標準曲線，同時以不含Gal抗原的人胎盤組織作為陰性對照品，大鼠肝組織作為陽性對照品，考察了M86酶聯免疫抑制法檢測動物組織或動物源性生物材料α-Gal抗原的特異性和靈敏性；并以此方法考察了大鼠不同組織中α-Gal抗原的表達特征；同時，將該方法應用于動物源性脫細胞生物材料的α-Gal抗原殘留量檢測。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 試劑與耗材
Costar 96孔板(2592, Corning Costar)；Galα-1，3-Gal/BSA(3-Atom Spacer，NGP0203, Dextra Laboratories Ltd)；α-Gal Epitope(Galα-1，3-Galβ-1，4-GlcNAc-R), mAb(M86, Enzo, ALX-801-090-1, EnzoLifescience)；羊抗鼠IgM-HRP(sc-2064, Santa Cruz Biotechnology, Inc)；1%人血清白蛋白(A8230-1, Sigma)(HAS，用PBS配制)；TMB(SE1005, 北京科悅達生物科技有限公司)；ELISA終止液(SE1006，北京科悅達生物科技有限公司)；木瓜酶(Cat.No.P8150)；PBST洗液(含0.05%吐溫-20的PBS)；抗原稀釋液(pH 9.5的碳酸鹽緩沖液)；抗體稀釋液(PBS)；過氧化氫(30%，分析純)。
1.1.2 實驗動物
SD雄性大鼠，SPF級，體重約250 g；新西蘭大白兔，SPF級，雄性，體重約2.5 kg；所有動物購自中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源中心，生產許可證號：SCXK(京)2005-0004，使用許可證號：SCXK(京)2006-0004。每3只大鼠飼養在不銹鋼絲籠具內，自由進食、進水。每日監控室溫和相對濕度。室溫控制在20～25℃范圍。相對濕度控制在30%～70%范圍。光照采用自動定時計控制12 h光照、12 h黑暗。檢疫飼養至少3 d后，進行實驗。所有動物實驗符合國家科學技術委員會發布施行的《實驗動物管理條例》和國家有關法律、法規要求。
1.1.3 實驗樣品
豬脫細胞真皮基質(Lot.No.: Z20130111001；北京桀亞萊福生物技術有限責任公司提供；產品規格：10 cm×10 cm；生產日期：2013年01月11日；有效日期至2015年01月10日；滅菌方式：Co60輻照滅菌)；動物組織取自上述購買的大鼠。未脫細胞豬真皮及脫細胞豬真皮組織由第四軍醫大學金巖課題組提供。
1.2 方法
1.2.1 樣品制備
組織取材：取3只SD雄性大鼠，用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)深度麻醉，“U”型切開腹部，取下大鼠的肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟。在PBS中漂洗后裝入EP管中，-20℃保存。人胎盤組織由成都青山利康藥業有限公司提供，為新鮮組織，4℃保存。
組織或材料預處理：用電子天平精確稱量大鼠組織及人胎盤組織或者動物源性脫細胞生物材料，用無菌眼科手術剪將其剪成1～3 mm細小組織塊后進行低溫勻漿，再用2.8 mg/L的木瓜酶溶液對組織及生物材料進行消化(60℃水浴箱中消化100 min)。待消化完全后，置于100℃沸水中10 min，或者加入過氧化氫(30%，分析純)2μL終止消化，然后進行系列倍比稀釋。
標準曲線樣品制備：于兔耳中動脈采血，細胞計數板計數后進行10倍稀釋，再配制系列兔血紅細胞懸液，濃度分別為：5×106、2.5×106、1.25×106、6.25×105、3.125×105、1.562 5×105個/mL。
1.2.2 實驗步驟
固相抗原包被：用pH 9.5的碳酸鹽緩沖液將Galα-1, 3-Gal稀釋到工作濃度(50 ng/mL，25 ng/mL)，加入96孔酶標板，100μL/孔，4℃過夜(18 h)包被；棄去包被液，用PBST洗滌3次，拍干；加1% HSA封閉，200μL/孔。37℃封閉2 h，棄去封閉液，用PBST洗滌3次，拍干。
M86抗體反應：將兔血和組織系列稀釋液與等體積1 :50稀釋的M86混勻(終濃度為1 :100)，置于37℃溫育2 h(緩慢搖動)，然后4℃, 14 340 g離心30 min，取上清液(含M86剩余抗體)備用。
固相抗原-M86剩余抗體反應：將含有M86剩余抗體的上清液加入96孔板(100μL/孔)，于37℃反應90 min后，用PBST洗滌3次，拍干。
酶標抗體反應：加入羊抗鼠HRP(1 :1 000)抗體，100μL/孔，于37℃反應90 min，用PBST洗滌3次，拍干。
顯色反應：加入TMB顯色底物，100μL/孔，室溫顯色15 min，加終止液100μL/孔，采用酶標儀在450 nm處測定吸光度值。
1.2.3 檢測結果計算
(1)兔血紅細胞α-Gal抗原數定值：
根據Galα-1, 3-Gal/BSA質量=BSA含量(已經蛋白質測定驗證)，BSA分子量：M=66.33 kD，BSA單位質量分子數：N=9.08×1018個/g；因此，單位質量Galα-1, 3-Gal/BSA中BSA分子數：9.08×1018個/g；根據每個Galα-1, 3-Gal/BSA中BSA分子含有的Gal抗原殘基數約20個(來自產品信息)，因此得到單位質量Galα-1, 3-Gal/BSA中Gal抗原殘基數=1.816×1020個/g。以Galα-1, 3-Gal/BSA為標準曲線，確定每個兔血紅細胞中的抗原數即為定值實驗。
根據相同反應體系中同時建立的Galα-1, 3-Gal/BSA標準曲線，計算得到的其在M86抗體50%結合抑制時所對應的α-Gal抗原數；對比兔血紅細胞的M86抗體50 %結合抑制時所對應的細胞數，推算出每個兔血紅細胞所含α-Gal抗原數，以“個/Cell”表示。具體公式如下：
| $每個兔血紅細胞中Gal抗原數\left({個/{\rm{cell}}} \right)=\left({a{\rm{ \times }}b} \right)\left({c{\rm{ \times }}d} \right) $ |
其中，a為Galα-1, 3-Gal/BSA在M86 50%結合抑制時的質量(μg)；b為單位質量Galα-1, 3-Gal/BSA中Gal抗原殘基數(1.816×1020個/g)；c為兔血紅細胞在M86 50%結合抑制時的濃度(個/mL)；d為兔血紅細胞在反應中的體積(mL)。
(2)樣品檢測：
用兔血紅細胞作為標準曲線樣品，根據相同反應體系中同時建立的標準曲線，計算得到的兔血紅細胞在M86抗體50%結合抑制時所對應的α-Gal抗原數；對比測試組織或材料的M86抗體50%結合抑制時所對應的質量，推算出測試組織或材料所含α-Gal抗原數，以“個/mg”或者“個/μg”(組織)表示。具體公式如下：
| $單位組織中Gal抗原數\left({個/{\rm{mg或個/}}\mu {\rm{g}}} \right)=\left({{a_1}{\rm{ \times }}{b_1}} \right)\left({{c_1}{\rm{ \times }}{d_1}} \right) $ |
其中，a1為兔血紅細胞在M86 50%結合抑制時的細胞數；b1為每個兔血紅細胞中所含的α-Gal抗原數；c1為組織或材料在M86 50%結合抑制時的濃度(μg/mL)；d1為組織或材料在反應中的體積(mL)。
2 結果
2.1 Galα-1, 3-Gal/BSA抗原包被濃度的考察
為了考察合適的固相抗原包被濃度，根據預實驗的結果選擇50 ng/mL和25 ng/mL兩個濃度的Galα-1, 3-Gal/BSA橫向加入96孔板進行包被，再以1 :2.5的M86稀釋比例開始，進行系列倍比稀釋7個濃度，分別以棋盤形式縱向加入96孔板中50 ng/mL和25 ng/mL的包被板中(100μL/孔)。如表 1所示，在以50 ng/mL Galα-1, 3-Gal/BSA包被，M86抗體稀釋比例為1 :2.5和1 :5時，其OD值基本一致，即達到飽和水平；在M86抗體稀釋比例為1 :40和1 :80時，其OD值在1.5～2.0之間，仍能保持較高的反應值；而在25 ng/mL的固相抗原包被行內，M86抗體稀釋比例為1 :40以下才能保證一定反應的OD值，需要的抗體量較大。為了能夠保證在前后兩次反應過程中抗原抗體充分結合，又能節約抗體的使用量，確定50 ng/mL Galα-1, 3-Gal/BSA作為最佳包被濃度進行包被。
表1
棋盤法確定適宜Galα-1, 3-Gal/BSA抗原包被濃度
Table1.
Checkerboard assay to determine the appropriate coating concentration of Galα-1, 3-Gal/BSA
2.2 M86抗體適宜稀釋比例的考察
為了確定適宜的M86抗體濃度，在已確定的Galα-1, 3-Gal/BSA固相抗原最佳包被濃度(50 ng/mL)條件下，設定M86為1 :60、1 :80和1 :100三個稀釋濃度，利用ELISA抑制法考察其與標準曲線樣品兔血細胞反應后，剩余抗體再與固相抗原反應的抑制率曲線。其結果如圖 1所示，根據非線性擬合結果可知，M86終稀釋比例為1 :60時，R2=0.973；M86終稀釋比例為1 :80時，R2=0.998；M86終稀釋比例為1 :100時，R2=0.993；結合表 1結果、文獻數據[15-16, 18]及試劑有效應用性考慮，選取M86終稀釋比例為1 :100作為適宜的抗體反應濃度。
圖1
不同稀釋比例M86抗體與兔血紅細胞結合抑制曲線
Figure1.
Inhibition curve of different diluted M86 binding with red cells of rabbit
2.3 組織或生物材料制備時木瓜酶失活條件考察
為使組織或動物源性生物材料中的Gal抗原充分暴露，本實驗采用木瓜酶法消化組織。但在實驗過程中發現，如果木瓜酶不能有效地失活，在后續的抗原抗體反應中會破壞抗原或者抗體，繼而使反應的OD值降低，呈現出假陽性的結果。鑒于此，本實驗室對木瓜酶的失活方式進行了考察，分別采用沸水浴加熱和過氧化氫方法失活木瓜酶，結果顯示，100%反應對照組M86與固相抗原反應的OD值為1.458；木瓜酶組(未做失活處理)OD值為0.137，與100%反應對照組相比有顯著性差異；木瓜酶過氧化氫失活組1μL和2μL組OD值分別為1.439和1.451，與100%反應對照組沒有顯著性差異；而加熱失活組OD值即使在20分鐘組仍然低于1.4，提示可能由于木瓜酶沒有被完全失活，從而影響了抗原-抗體反應效率。有文獻也報道過加熱不能使木瓜酶100%失活。因此，本研究選擇過氧化氫法失活木瓜酶。
2.4 兔血紅細胞標準曲線
根據文獻報告，兔血紅細胞具有穩定表達的α-Gal抗原，且與M86抗體特異性結合，在M86特異性ELISA抑制實驗中具有良好的相關性[15-16]，故選用兔血紅細胞作為標準曲線樣品。通過利用人工合成的Galα-1, 3-Gal/BSA為標準品，為兔血紅細胞的α-1, 3-Gal抗原表位數重新定值，確定了每個兔血紅細胞中Gal抗原數約為2.73×107個(實驗資料未顯示)。
以系列稀釋的兔血紅細胞濃度為橫坐標，M86的相對結合抑制率為縱坐標建立標準曲線，采用非線性擬合，如圖 2所示。其中，縱坐標數據為：以終濃度為1 :100的M86/PBS稀釋液直接與包被板中的固相抗原反應的OD值為100，表示為a；再以測試物抗原/M86抗體反應后的剩余M86抗體與α-Gal/BSA固相抗原結合反應的OD值表示為b，則相對抑制率為：b/a*100，以%表示。從標準曲線中得到擬合公式y=-115.886 9·exp(-x/17.446 48)+107.344，R2=0.992。通過該公式求得M86在50%結合抑制時所對應的兔血紅細胞數約為1.227×105個，每個兔血紅細胞中Gal抗原數通過定值實驗確定，約為2.73×107個，因此，兔血紅細胞在本反應體系中，在M86抗體50%結合抑制時所對應的Gal抗原數為3.35×1012個。
圖2
M86抗體與系列稀釋的兔血紅細胞結合抑制曲線
Figure2.
Inhibition curve of M86 binding with series of rabbit red blood cells
2.5 M86抗體ELISA抑制法特異性考察
由于人的組織是不表達Gal抗原的，所以選用人胎盤組織作為陰性對照，考察木瓜酶的失活效果和M86抗體ELISA抑制法的特異性。用木瓜酶消化人胎盤組織，配制濃度為5 mg/mL和0.312 5 mg/mL；再用過氧化氫失活木瓜酶后與M86抗體反應，置于37℃溫育2 h(緩慢搖動)，然后4℃、14 340 g離心30 min；取上清液加入已包被Gal固相抗原的96孔板測定剩余M86抗體與固相抗原反應的OD值，分別為1.246和1.391，只加1 :100 M86/PBS的對照組與已包被Gal固相抗原反應的OD值為1.382。實驗組與對照組結果無明顯差異，證實人胎盤組織中不含Gal抗原，顯示該方法具有高度的特異性。
2.6 M86抗體ELISA抑制法敏感性考察
α-Gal抗原主要表達在血管內皮細胞，因此，選擇肝臟組織作為陽性對照組織，考察M86抗體ELISA抑制法的敏感性。結果如圖 3(a)所示，以系列肝組織反應濃度為橫坐標，M86結合抑制率為縱坐標建立結合抑制曲線，采用非線性擬合，由圖 3(a)可得到大鼠肝臟與M86結合關系公式：y=-119.1·exp(-x/0.75)+102.4, R2=0.993，由此得出大鼠肝臟50%結合抑制時所對應的質量為61.4μg，最低反應濃度為0.25 mg/mL。該結果顯示，本研究所建立的方法可以檢測25μg肝組織中所含有的α-Gal抗原。再根據上述相同反應體系中同時建立的標準曲線，計算得到的兔血紅細胞在M86抗體50%結合抑制時所對應的α-Gal抗原數為3.35×1012個，對比同一實驗體系中大鼠肝臟組織的M86抗體50%結合抑制時所對應的質量，推算出大鼠肝臟組織所含α-Gal抗原數為5.46×1013個/mg組織(濕重)。
圖3
大鼠組織M86結合抑制曲線
Figure3.
Inhibition curves of M86 binding with rat tissues
2.7 大鼠組織α-Gal抗原表達
利用上述所建立的方法，考察了大鼠主要臟器組織中α-Gal抗原表達情況，如圖 3所示。單位質量動物組織所含有的α-Gal抗原數分別為：大鼠心臟組織，約5.69×1012個/mg；大鼠脾臟組織，約1.14×1014個/mg；大鼠肺臟組織，約2.12×1014個/mg；大鼠腎臟組織，約8.52×1014個/mg。
2.8 脫細胞生物材料及豬真皮脫細胞處理前后α-Gal抗原表達
利用上述同樣的方法檢測豬脫細胞真皮基質的Gal抗原數約3.62×1014個/mg，如圖 4所示。為比較分析加工處理(脫細胞)前后動物源性生物材料中α-Gal抗原的含量變化，我們測定了豬真皮脫細胞處理前后殘留α-Gal抗原的含量。未處理(脫細胞前)豬真皮中Gal抗原含量約為1.34×1013個/mg, 經脫細胞處理后的豬真皮基質中Gal抗原含量約為5.16×1012個/mg，豬真皮經過脫細胞處理后α-Gal抗原含量減少了1/2以上，差異有統計學意義(P＜0.05)。
圖4
脫細胞真皮基質及豬真皮脫細胞處理前后Gal抗原含量
Figure4.
Expression of a-Gal epitopes in the porcine acellular dermal matrix and porcine dermal before and after decellular treatment
3 討論
本研究中用兔血紅細胞作標準曲線，優化和驗證了應用M86 ELISA抑制法特異性地定量檢測組織中的Gal抗原實驗方法。而且，為了科學準確地確定每個兔血細胞所含的Gal抗原數，采用人工合成的Galα-1, 3-Gal/BSA為標準品，為兔血紅細胞的α-1, 3-Gal抗原表位數重新定值。在本實驗體系中所確定的兔血紅細胞所含Gal抗原數(2.73×107個/cell)遠遠高于Galili等的研究(1×106個/cell)，說明本方法更靈敏。文獻中報道利用M86檢測a-Gal的ELISA抑制法檢測限為5×104～5×107/細胞[15]，本研究中的結果顯示，在本實驗室建立的檢測體系中最低能夠檢測25μg大鼠肝組織中所含有的α-Gal抗原。對比大鼠肝臟組織的M86抗體50%結合抑制時所對應的質量，推算出大鼠肝臟組織所含α-Gal抗原數為5.46×1013個/mg組織(濕重)。從大鼠各臟器組織Gal抗原表達的檢測結果(圖 3)可以看出，本研究所得到的大鼠各臟器組織的Gal抗原表達趨勢與文獻報道相似，本研究的檢測結果為：腎臟＞肺臟＞脾臟＞肝臟＞心臟(大鼠)；文獻報道的結果為：腎臟＞肝臟(C57BL/6小鼠)[15]，肺臟＞心臟＞肝臟＞腎臟(小鼠)[18], 腎臟＞肺臟＞肝臟＞心臟(豬)[18]。但與文獻報道相比，本文所敘述的方法能夠檢測到更多的Gal抗原，具有更高的靈敏性。
從圖 4中可看出，經脫細胞處理的豬皮中Gal抗原的含量比處理前明顯降低，說明該法能夠反映組織中α-Gal抗原的相對含量，這也在一定程度上佐證了該方法的準確性。雖然有些產品，如：豬脫細胞真皮基質已經經過脫細胞處理，但仍可檢測出其中較高的Gal抗原含量。像真皮這樣致密的組織，即使用最嚴格的加工方法也不可能完全去除所有細胞[19]，至于Gal抗原含量降低到多少時才不會引發超急性免疫排斥反應，或者慢性的免疫排斥反應才能滿足臨床安全應用，還有待于進一步求索驗證。
用M86抗體ELISA抑制法檢測Gal抗原時，需要充分保證實驗體系有足夠的靈敏性，證實能夠檢測到微量或者痕量的殘留Gal抗原；而且除了驗證其靈敏度之外，還應該考慮如何排除實驗中出現的假陽性。在應用M86抗體ELISA抑制法檢測組織或者脫細胞生物材料中Gal抗原時，需使組織或者脫細胞生物材料中的Gal抗原充分暴露。Naso等[16-17]、Galili等[15]及Tanemura等[18]的文獻中利用該方法在對樣品的前處理時采用了組織勻漿或者木瓜酶消化來暴露Gal抗原。木瓜酶消化法可以保證組織或者脫細胞生物材料中殘留α-Gal抗原的充分暴露。然而，木瓜酶如果不能在發揮了分解細胞外基質作用之后立即有效地失活，則會破壞抗原或者抗體而顯著地影響后續的抗原抗體反應，造成假陽性。Naso等[16]采用100℃加熱5 min的方式失活木瓜酶，然而，本研究在對木瓜酶失活方法的考察中發現單純的加熱滅活不能達到木瓜酶的100%失活，會因此出現假陽性的結果；而采用1～2μL過氧化氫可以有效地使木瓜酶失活，且不影響后續的抗原抗體反應(已經驗證過，資料未提供)。既往文獻[17]中沒有設定陰性對照組，所以無法知道是否存在假陽性的結果。本研究使用了人的胎盤組織作為陰性對照，因為既往科學研究已經證實人體是不表達α-Gal抗原的，這樣可以監測實驗結果是否具有足夠的特異性，有效地排除假陽性結果。
在評價脫細胞生物材料的殘留Gal抗原時除了設置必要的陽性對照和陰性對照以證明實驗體系有足夠的靈敏性和特異性之外，還可同時測定同種動物組織脫細胞處理前的Gal抗原表達量，對比分析脫細胞處理后Gal抗原的減少百分比，從而判斷殘留抗原的程度。
4 結論
本研究初步建立了評價動物組織或動物源性生物材料中殘留Gal抗原的方法，即：M86 ELISA抑制法。該方法具有較高的靈敏性和優異的特異性，能夠克服直接ELISA法特異性不強的缺點，快速檢測出組織中α-Gal抗原的含量。在應用中將該法進一步優化并進行標準化后，有望成為動物源性脫細胞生物材料α-Gal抗原殘留量檢測的有效方法。從而為動物源性生物材料研發中的質量控制、注冊前的安全性評價和科學監管提供技術支持。
引言
已有研究顯示α-半乳糖基抗原(α-1, 3-galactosyle，α-Gal)是動物源性生物材料或異種器官移植超急性免疫排斥反應中的主要靶抗原[1-5]。α-Gal的結構為Galα-1，3-Galβ-1，4-GlcNAc-R，該抗原是半乳糖基與細胞膜上的蛋白或脂結合構成的一組完全性抗原[6]。它表達于除人、猿和古世紀猴外的所有哺乳動物體內，只是種類和個體間表達量有差異[7]。
α-Gal主要受α-1，3半乳糖基轉移酶(α-1, 3-galactosyltransferase, α-GT)及異紅細胞糖苷酯合成酶(isoglobotriosylceramide synthase或isogloboside 3 synthase, iGb3S)調控。由于人體及類人猿、古世紀猴的半乳糖苷轉移酶基因有2個堿基錯位變異而不表達Gal抗原[7-8]，但人腸道菌群持續表達Gal抗原，這種刺激致使人體免疫系統持續產生抗Gal抗體，達到循環免疫球蛋白(IgM和IgA)的1%~3%[9-11]。因此當人體接受含有Gal抗原的生物材料或異種器官移植時，會引起超急性免疫排斥反應及慢性的免疫毒性反應。動物源性生物材料或異種器官移植中Gal抗原的去除成為降低免疫排斥和慢性免疫毒性反應的關鍵。通常情況下，為減少動物源性生物材料的免疫原性，需通過脫細胞工藝以消除殘留的細胞成分及異源性的抗原物質。然而，因為要保證處理過程盡量不影響材料有機結構、超微結構、機械性能及胞外基質支架的生物活性，有些處理并不能完全去除膜碎片等細胞材料殘留物。存在于殘留物中的抗原(如Gal抗原)會引起急性、超急性排斥反應、慢性免疫排斥反應和免疫毒性，進而影響損傷愈合或導致器官移植患者手術失敗，目前急需建立能有效評價動物源性生物材料中Gal抗原含量的方法。
為了證實異源組織中是否含有(或是含有多少)Gal抗原，早在1983年Eckhardta等[12]采用與凝集素聯用的免疫印染法，測定了鼠、兔、豬、牛等動物體內細胞表面α-Gal抗原表位的數量。但由于西非單葉豆凝集素(griffonia simplicifdia-IB4, GS-IB4)特異性不高，若細胞中α-Gal抗原表位含量少，則不能檢出。Mckenzie等[13]用I標記的XNA和GS-IB4與豬動脈血管內皮細胞和淋巴細胞結合，利用放射性自顯影技術確立α-Gal是一組而非一種糖蛋白或糖脂，但是這種方法也不能作為定量檢測。2005年曾令宇等[14]利用激光共聚焦及流式細胞術(flow cytometry, FCM)檢測豬血細胞與FITC—BS IB4的結合，建立了無創、快速半定量檢測豬細胞表面α-Gal的方法。上述方法均局限于細胞水平檢測，至于如何檢測動物源性生物材料中殘留的α-Gal抗原，目前尚無標準化的方法。
Galili等[15]將1988年建立的GS-IB4方法進行了優化，用兔血紅細胞免疫α-1, 3-半乳糖苷轉移酶基因敲除小鼠，提取小鼠脾細胞，使其與雜交瘤細胞融合，分離出單個雜交瘤細胞，再將α-Gal/BSA作為固相抗原，用ELISA法篩選單克隆抗Gal IgM，即M86。對于新鮮組織或去細胞化的組織，M86均適用。Galili等[15]用SP2/0小鼠骨髓瘤細胞和兔血紅細胞作為標準曲線測定動物組織中的Gal抗原數。他們的研究認為，相對于SP2/0小鼠骨髓瘤細胞來說，兔血在4℃時可以保存更久，而且取材方便，所以用兔血做標準曲線更方便實用。利用M86的酶聯免疫抑制法測定細胞或勻漿組織中的α-Gal抗原表位，從而提高了檢測的敏感性和特異性。然而，文獻中報道的方法中無論是采用小鼠骨髓瘤細胞還是兔血紅細胞制備標準曲線，其小鼠骨髓瘤細胞α-Gal抗原表位數的定值只是依據作者既往的早期研究和特定的實驗體系確定的，他人很難溯源。另外，作者是通過IB4確定的小鼠骨髓瘤細胞的抗原數約為1×106/Cell(實際檢測數據為1.2×106/Cell)[7]，用IB4檢測Gal抗原與M86相比靈敏性較低[15]。而兔血紅細胞的抗原數又是依據在同一反應體系中兔血紅細胞的敏感性是小鼠骨髓瘤細胞的2倍，所以定為2×106/Cell[15]，缺乏科學依據。
本實驗室參考文獻中介紹的方法，改進Naso等[16-17]的實驗方案，利用人工合成的Galα-1, 3-Gal/BSA為標準品，為兔血紅細胞的α-1, 3-Gal抗原表位數重新定值；然后以定值后的兔血進行系列倍比稀釋，制作檢測用標準曲線，同時以不含Gal抗原的人胎盤組織作為陰性對照品，大鼠肝組織作為陽性對照品，考察了M86酶聯免疫抑制法檢測動物組織或動物源性生物材料α-Gal抗原的特異性和靈敏性；并以此方法考察了大鼠不同組織中α-Gal抗原的表達特征；同時，將該方法應用于動物源性脫細胞生物材料的α-Gal抗原殘留量檢測。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 試劑與耗材
Costar 96孔板(2592, Corning Costar)；Galα-1，3-Gal/BSA(3-Atom Spacer，NGP0203, Dextra Laboratories Ltd)；α-Gal Epitope(Galα-1，3-Galβ-1，4-GlcNAc-R), mAb(M86, Enzo, ALX-801-090-1, EnzoLifescience)；羊抗鼠IgM-HRP(sc-2064, Santa Cruz Biotechnology, Inc)；1%人血清白蛋白(A8230-1, Sigma)(HAS，用PBS配制)；TMB(SE1005, 北京科悅達生物科技有限公司)；ELISA終止液(SE1006，北京科悅達生物科技有限公司)；木瓜酶(Cat.No.P8150)；PBST洗液(含0.05%吐溫-20的PBS)；抗原稀釋液(pH 9.5的碳酸鹽緩沖液)；抗體稀釋液(PBS)；過氧化氫(30%，分析純)。
1.1.2 實驗動物
SD雄性大鼠，SPF級，體重約250 g；新西蘭大白兔，SPF級，雄性，體重約2.5 kg；所有動物購自中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源中心，生產許可證號：SCXK(京)2005-0004，使用許可證號：SCXK(京)2006-0004。每3只大鼠飼養在不銹鋼絲籠具內，自由進食、進水。每日監控室溫和相對濕度。室溫控制在20～25℃范圍。相對濕度控制在30%～70%范圍。光照采用自動定時計控制12 h光照、12 h黑暗。檢疫飼養至少3 d后，進行實驗。所有動物實驗符合國家科學技術委員會發布施行的《實驗動物管理條例》和國家有關法律、法規要求。
1.1.3 實驗樣品
豬脫細胞真皮基質(Lot.No.: Z20130111001；北京桀亞萊福生物技術有限責任公司提供；產品規格：10 cm×10 cm；生產日期：2013年01月11日；有效日期至2015年01月10日；滅菌方式：Co60輻照滅菌)；動物組織取自上述購買的大鼠。未脫細胞豬真皮及脫細胞豬真皮組織由第四軍醫大學金巖課題組提供。
1.2 方法
1.2.1 樣品制備
組織取材：取3只SD雄性大鼠，用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)深度麻醉，“U”型切開腹部，取下大鼠的肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟。在PBS中漂洗后裝入EP管中，-20℃保存。人胎盤組織由成都青山利康藥業有限公司提供，為新鮮組織，4℃保存。
組織或材料預處理：用電子天平精確稱量大鼠組織及人胎盤組織或者動物源性脫細胞生物材料，用無菌眼科手術剪將其剪成1～3 mm細小組織塊后進行低溫勻漿，再用2.8 mg/L的木瓜酶溶液對組織及生物材料進行消化(60℃水浴箱中消化100 min)。待消化完全后，置于100℃沸水中10 min，或者加入過氧化氫(30%，分析純)2μL終止消化，然后進行系列倍比稀釋。
標準曲線樣品制備：于兔耳中動脈采血，細胞計數板計數后進行10倍稀釋，再配制系列兔血紅細胞懸液，濃度分別為：5×106、2.5×106、1.25×106、6.25×105、3.125×105、1.562 5×105個/mL。
1.2.2 實驗步驟
固相抗原包被：用pH 9.5的碳酸鹽緩沖液將Galα-1, 3-Gal稀釋到工作濃度(50 ng/mL，25 ng/mL)，加入96孔酶標板，100μL/孔，4℃過夜(18 h)包被；棄去包被液，用PBST洗滌3次，拍干；加1% HSA封閉，200μL/孔。37℃封閉2 h，棄去封閉液，用PBST洗滌3次，拍干。
M86抗體反應：將兔血和組織系列稀釋液與等體積1 :50稀釋的M86混勻(終濃度為1 :100)，置于37℃溫育2 h(緩慢搖動)，然后4℃, 14 340 g離心30 min，取上清液(含M86剩余抗體)備用。
固相抗原-M86剩余抗體反應：將含有M86剩余抗體的上清液加入96孔板(100μL/孔)，于37℃反應90 min后，用PBST洗滌3次，拍干。
酶標抗體反應：加入羊抗鼠HRP(1 :1 000)抗體，100μL/孔，于37℃反應90 min，用PBST洗滌3次，拍干。
顯色反應：加入TMB顯色底物，100μL/孔，室溫顯色15 min，加終止液100μL/孔，采用酶標儀在450 nm處測定吸光度值。
1.2.3 檢測結果計算
(1)兔血紅細胞α-Gal抗原數定值：
根據Galα-1, 3-Gal/BSA質量=BSA含量(已經蛋白質測定驗證)，BSA分子量：M=66.33 kD，BSA單位質量分子數：N=9.08×1018個/g；因此，單位質量Galα-1, 3-Gal/BSA中BSA分子數：9.08×1018個/g；根據每個Galα-1, 3-Gal/BSA中BSA分子含有的Gal抗原殘基數約20個(來自產品信息)，因此得到單位質量Galα-1, 3-Gal/BSA中Gal抗原殘基數=1.816×1020個/g。以Galα-1, 3-Gal/BSA為標準曲線，確定每個兔血紅細胞中的抗原數即為定值實驗。
根據相同反應體系中同時建立的Galα-1, 3-Gal/BSA標準曲線，計算得到的其在M86抗體50%結合抑制時所對應的α-Gal抗原數；對比兔血紅細胞的M86抗體50 %結合抑制時所對應的細胞數，推算出每個兔血紅細胞所含α-Gal抗原數，以“個/Cell”表示。具體公式如下：
| $每個兔血紅細胞中Gal抗原數\left({個/{\rm{cell}}} \right)=\left({a{\rm{ \times }}b} \right)\left({c{\rm{ \times }}d} \right) $ |
其中，a為Galα-1, 3-Gal/BSA在M86 50%結合抑制時的質量(μg)；b為單位質量Galα-1, 3-Gal/BSA中Gal抗原殘基數(1.816×1020個/g)；c為兔血紅細胞在M86 50%結合抑制時的濃度(個/mL)；d為兔血紅細胞在反應中的體積(mL)。
(2)樣品檢測：
用兔血紅細胞作為標準曲線樣品，根據相同反應體系中同時建立的標準曲線，計算得到的兔血紅細胞在M86抗體50%結合抑制時所對應的α-Gal抗原數；對比測試組織或材料的M86抗體50%結合抑制時所對應的質量，推算出測試組織或材料所含α-Gal抗原數，以“個/mg”或者“個/μg”(組織)表示。具體公式如下：
| $單位組織中Gal抗原數\left({個/{\rm{mg或個/}}\mu {\rm{g}}} \right)=\left({{a_1}{\rm{ \times }}{b_1}} \right)\left({{c_1}{\rm{ \times }}{d_1}} \right) $ |
其中，a1為兔血紅細胞在M86 50%結合抑制時的細胞數；b1為每個兔血紅細胞中所含的α-Gal抗原數；c1為組織或材料在M86 50%結合抑制時的濃度(μg/mL)；d1為組織或材料在反應中的體積(mL)。
2 結果
2.1 Galα-1, 3-Gal/BSA抗原包被濃度的考察
為了考察合適的固相抗原包被濃度，根據預實驗的結果選擇50 ng/mL和25 ng/mL兩個濃度的Galα-1, 3-Gal/BSA橫向加入96孔板進行包被，再以1 :2.5的M86稀釋比例開始，進行系列倍比稀釋7個濃度，分別以棋盤形式縱向加入96孔板中50 ng/mL和25 ng/mL的包被板中(100μL/孔)。如表 1所示，在以50 ng/mL Galα-1, 3-Gal/BSA包被，M86抗體稀釋比例為1 :2.5和1 :5時，其OD值基本一致，即達到飽和水平；在M86抗體稀釋比例為1 :40和1 :80時，其OD值在1.5～2.0之間，仍能保持較高的反應值；而在25 ng/mL的固相抗原包被行內，M86抗體稀釋比例為1 :40以下才能保證一定反應的OD值，需要的抗體量較大。為了能夠保證在前后兩次反應過程中抗原抗體充分結合，又能節約抗體的使用量，確定50 ng/mL Galα-1, 3-Gal/BSA作為最佳包被濃度進行包被。
表1
棋盤法確定適宜Galα-1, 3-Gal/BSA抗原包被濃度
Table1.
Checkerboard assay to determine the appropriate coating concentration of Galα-1, 3-Gal/BSA
2.2 M86抗體適宜稀釋比例的考察
為了確定適宜的M86抗體濃度，在已確定的Galα-1, 3-Gal/BSA固相抗原最佳包被濃度(50 ng/mL)條件下，設定M86為1 :60、1 :80和1 :100三個稀釋濃度，利用ELISA抑制法考察其與標準曲線樣品兔血細胞反應后，剩余抗體再與固相抗原反應的抑制率曲線。其結果如圖 1所示，根據非線性擬合結果可知，M86終稀釋比例為1 :60時，R2=0.973；M86終稀釋比例為1 :80時，R2=0.998；M86終稀釋比例為1 :100時，R2=0.993；結合表 1結果、文獻數據[15-16, 18]及試劑有效應用性考慮，選取M86終稀釋比例為1 :100作為適宜的抗體反應濃度。
圖1
不同稀釋比例M86抗體與兔血紅細胞結合抑制曲線
Figure1.
Inhibition curve of different diluted M86 binding with red cells of rabbit
2.3 組織或生物材料制備時木瓜酶失活條件考察
為使組織或動物源性生物材料中的Gal抗原充分暴露，本實驗采用木瓜酶法消化組織。但在實驗過程中發現，如果木瓜酶不能有效地失活，在后續的抗原抗體反應中會破壞抗原或者抗體，繼而使反應的OD值降低，呈現出假陽性的結果。鑒于此，本實驗室對木瓜酶的失活方式進行了考察，分別采用沸水浴加熱和過氧化氫方法失活木瓜酶，結果顯示，100%反應對照組M86與固相抗原反應的OD值為1.458；木瓜酶組(未做失活處理)OD值為0.137，與100%反應對照組相比有顯著性差異；木瓜酶過氧化氫失活組1μL和2μL組OD值分別為1.439和1.451，與100%反應對照組沒有顯著性差異；而加熱失活組OD值即使在20分鐘組仍然低于1.4，提示可能由于木瓜酶沒有被完全失活，從而影響了抗原-抗體反應效率。有文獻也報道過加熱不能使木瓜酶100%失活。因此，本研究選擇過氧化氫法失活木瓜酶。
2.4 兔血紅細胞標準曲線
根據文獻報告，兔血紅細胞具有穩定表達的α-Gal抗原，且與M86抗體特異性結合，在M86特異性ELISA抑制實驗中具有良好的相關性[15-16]，故選用兔血紅細胞作為標準曲線樣品。通過利用人工合成的Galα-1, 3-Gal/BSA為標準品，為兔血紅細胞的α-1, 3-Gal抗原表位數重新定值，確定了每個兔血紅細胞中Gal抗原數約為2.73×107個(實驗資料未顯示)。
以系列稀釋的兔血紅細胞濃度為橫坐標，M86的相對結合抑制率為縱坐標建立標準曲線，采用非線性擬合，如圖 2所示。其中，縱坐標數據為：以終濃度為1 :100的M86/PBS稀釋液直接與包被板中的固相抗原反應的OD值為100，表示為a；再以測試物抗原/M86抗體反應后的剩余M86抗體與α-Gal/BSA固相抗原結合反應的OD值表示為b，則相對抑制率為：b/a*100，以%表示。從標準曲線中得到擬合公式y=-115.886 9·exp(-x/17.446 48)+107.344，R2=0.992。通過該公式求得M86在50%結合抑制時所對應的兔血紅細胞數約為1.227×105個，每個兔血紅細胞中Gal抗原數通過定值實驗確定，約為2.73×107個，因此，兔血紅細胞在本反應體系中，在M86抗體50%結合抑制時所對應的Gal抗原數為3.35×1012個。
圖2
M86抗體與系列稀釋的兔血紅細胞結合抑制曲線
Figure2.
Inhibition curve of M86 binding with series of rabbit red blood cells
2.5 M86抗體ELISA抑制法特異性考察
由于人的組織是不表達Gal抗原的，所以選用人胎盤組織作為陰性對照，考察木瓜酶的失活效果和M86抗體ELISA抑制法的特異性。用木瓜酶消化人胎盤組織，配制濃度為5 mg/mL和0.312 5 mg/mL；再用過氧化氫失活木瓜酶后與M86抗體反應，置于37℃溫育2 h(緩慢搖動)，然后4℃、14 340 g離心30 min；取上清液加入已包被Gal固相抗原的96孔板測定剩余M86抗體與固相抗原反應的OD值，分別為1.246和1.391，只加1 :100 M86/PBS的對照組與已包被Gal固相抗原反應的OD值為1.382。實驗組與對照組結果無明顯差異，證實人胎盤組織中不含Gal抗原，顯示該方法具有高度的特異性。
2.6 M86抗體ELISA抑制法敏感性考察
α-Gal抗原主要表達在血管內皮細胞，因此，選擇肝臟組織作為陽性對照組織，考察M86抗體ELISA抑制法的敏感性。結果如圖 3(a)所示，以系列肝組織反應濃度為橫坐標，M86結合抑制率為縱坐標建立結合抑制曲線，采用非線性擬合，由圖 3(a)可得到大鼠肝臟與M86結合關系公式：y=-119.1·exp(-x/0.75)+102.4, R2=0.993，由此得出大鼠肝臟50%結合抑制時所對應的質量為61.4μg，最低反應濃度為0.25 mg/mL。該結果顯示，本研究所建立的方法可以檢測25μg肝組織中所含有的α-Gal抗原。再根據上述相同反應體系中同時建立的標準曲線，計算得到的兔血紅細胞在M86抗體50%結合抑制時所對應的α-Gal抗原數為3.35×1012個，對比同一實驗體系中大鼠肝臟組織的M86抗體50%結合抑制時所對應的質量，推算出大鼠肝臟組織所含α-Gal抗原數為5.46×1013個/mg組織(濕重)。
圖3
大鼠組織M86結合抑制曲線
Figure3.
Inhibition curves of M86 binding with rat tissues
2.7 大鼠組織α-Gal抗原表達
利用上述所建立的方法，考察了大鼠主要臟器組織中α-Gal抗原表達情況，如圖 3所示。單位質量動物組織所含有的α-Gal抗原數分別為：大鼠心臟組織，約5.69×1012個/mg；大鼠脾臟組織，約1.14×1014個/mg；大鼠肺臟組織，約2.12×1014個/mg；大鼠腎臟組織，約8.52×1014個/mg。
2.8 脫細胞生物材料及豬真皮脫細胞處理前后α-Gal抗原表達
利用上述同樣的方法檢測豬脫細胞真皮基質的Gal抗原數約3.62×1014個/mg，如圖 4所示。為比較分析加工處理(脫細胞)前后動物源性生物材料中α-Gal抗原的含量變化，我們測定了豬真皮脫細胞處理前后殘留α-Gal抗原的含量。未處理(脫細胞前)豬真皮中Gal抗原含量約為1.34×1013個/mg, 經脫細胞處理后的豬真皮基質中Gal抗原含量約為5.16×1012個/mg，豬真皮經過脫細胞處理后α-Gal抗原含量減少了1/2以上，差異有統計學意義(P＜0.05)。
圖4
脫細胞真皮基質及豬真皮脫細胞處理前后Gal抗原含量
Figure4.
Expression of a-Gal epitopes in the porcine acellular dermal matrix and porcine dermal before and after decellular treatment
3 討論
本研究中用兔血紅細胞作標準曲線，優化和驗證了應用M86 ELISA抑制法特異性地定量檢測組織中的Gal抗原實驗方法。而且，為了科學準確地確定每個兔血細胞所含的Gal抗原數，采用人工合成的Galα-1, 3-Gal/BSA為標準品，為兔血紅細胞的α-1, 3-Gal抗原表位數重新定值。在本實驗體系中所確定的兔血紅細胞所含Gal抗原數(2.73×107個/cell)遠遠高于Galili等的研究(1×106個/cell)，說明本方法更靈敏。文獻中報道利用M86檢測a-Gal的ELISA抑制法檢測限為5×104～5×107/細胞[15]，本研究中的結果顯示，在本實驗室建立的檢測體系中最低能夠檢測25μg大鼠肝組織中所含有的α-Gal抗原。對比大鼠肝臟組織的M86抗體50%結合抑制時所對應的質量，推算出大鼠肝臟組織所含α-Gal抗原數為5.46×1013個/mg組織(濕重)。從大鼠各臟器組織Gal抗原表達的檢測結果(圖 3)可以看出，本研究所得到的大鼠各臟器組織的Gal抗原表達趨勢與文獻報道相似，本研究的檢測結果為：腎臟＞肺臟＞脾臟＞肝臟＞心臟(大鼠)；文獻報道的結果為：腎臟＞肝臟(C57BL/6小鼠)[15]，肺臟＞心臟＞肝臟＞腎臟(小鼠)[18], 腎臟＞肺臟＞肝臟＞心臟(豬)[18]。但與文獻報道相比，本文所敘述的方法能夠檢測到更多的Gal抗原，具有更高的靈敏性。
從圖 4中可看出，經脫細胞處理的豬皮中Gal抗原的含量比處理前明顯降低，說明該法能夠反映組織中α-Gal抗原的相對含量，這也在一定程度上佐證了該方法的準確性。雖然有些產品，如：豬脫細胞真皮基質已經經過脫細胞處理，但仍可檢測出其中較高的Gal抗原含量。像真皮這樣致密的組織，即使用最嚴格的加工方法也不可能完全去除所有細胞[19]，至于Gal抗原含量降低到多少時才不會引發超急性免疫排斥反應，或者慢性的免疫排斥反應才能滿足臨床安全應用，還有待于進一步求索驗證。
用M86抗體ELISA抑制法檢測Gal抗原時，需要充分保證實驗體系有足夠的靈敏性，證實能夠檢測到微量或者痕量的殘留Gal抗原；而且除了驗證其靈敏度之外，還應該考慮如何排除實驗中出現的假陽性。在應用M86抗體ELISA抑制法檢測組織或者脫細胞生物材料中Gal抗原時，需使組織或者脫細胞生物材料中的Gal抗原充分暴露。Naso等[16-17]、Galili等[15]及Tanemura等[18]的文獻中利用該方法在對樣品的前處理時采用了組織勻漿或者木瓜酶消化來暴露Gal抗原。木瓜酶消化法可以保證組織或者脫細胞生物材料中殘留α-Gal抗原的充分暴露。然而，木瓜酶如果不能在發揮了分解細胞外基質作用之后立即有效地失活，則會破壞抗原或者抗體而顯著地影響后續的抗原抗體反應，造成假陽性。Naso等[16]采用100℃加熱5 min的方式失活木瓜酶，然而，本研究在對木瓜酶失活方法的考察中發現單純的加熱滅活不能達到木瓜酶的100%失活，會因此出現假陽性的結果；而采用1～2μL過氧化氫可以有效地使木瓜酶失活，且不影響后續的抗原抗體反應(已經驗證過，資料未提供)。既往文獻[17]中沒有設定陰性對照組，所以無法知道是否存在假陽性的結果。本研究使用了人的胎盤組織作為陰性對照，因為既往科學研究已經證實人體是不表達α-Gal抗原的，這樣可以監測實驗結果是否具有足夠的特異性，有效地排除假陽性結果。
在評價脫細胞生物材料的殘留Gal抗原時除了設置必要的陽性對照和陰性對照以證明實驗體系有足夠的靈敏性和特異性之外，還可同時測定同種動物組織脫細胞處理前的Gal抗原表達量，對比分析脫細胞處理后Gal抗原的減少百分比，從而判斷殘留抗原的程度。
4 結論
本研究初步建立了評價動物組織或動物源性生物材料中殘留Gal抗原的方法，即：M86 ELISA抑制法。該方法具有較高的靈敏性和優異的特異性，能夠克服直接ELISA法特異性不強的缺點，快速檢測出組織中α-Gal抗原的含量。在應用中將該法進一步優化并進行標準化后，有望成為動物源性脫細胞生物材料α-Gal抗原殘留量檢測的有效方法。從而為動物源性生物材料研發中的質量控制、注冊前的安全性評價和科學監管提供技術支持。
