免疫熒光可定性分析細胞內蛋白核轉位現象, NF-κB/p65蛋白核轉位提示NF-κB信號通路的活化, 我們嘗試運用自主研發設計的免疫熒光分析軟件計算熒光圖像中胞核和胞質位置的熒光值變化, 定量分析核轉位情況, 并通過蛋白質免疫印跡法驗證軟件分析結果。應用該軟件分析內毒素誘導0.5、1、2和4 h后原代人臍靜脈內皮細胞的NF-κB信號通路活化, 結果提示2 h為核轉位高峰期, 與蛋白質免疫印跡法驗證結果一致, 表明自主研發的免疫熒光分析軟件可應用于免疫熒光的定量分析。
引用本文： 修敏, 何鳳, 婁遠蕾, 徐露, 熊潔琦, 王平, 劉絲蓀, 郭菲. 免疫熒光檢測核因子-κB活化的定量分析. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(3): 669-674. doi: 10.7507/1001-5515.20150121 復制
引言
NF-κB信號通路在免疫應答、細胞存活和增殖分化等方面發揮重要調控作用，通路的激活表現在細胞內多種蛋白和酶的級聯式反應以及相關基因的轉錄調控[1]。Rogers等[2]在研究一氧化氮對腫瘤壞死因子-α誘導(human umbilical vein endothelial cells, HUVFCs)的NF-κB信號通路的激活過程中發現NF-κB/p65蛋白核轉位“震蕩現象”，NF-κB/p65核轉位作為調控轉錄的始動因素，是我們研究NF-κB信號通路的關鍵。免疫熒光是觀察細胞內蛋白核轉位較直觀的實驗方法[3]，但多限于主觀定性判斷熒光圖片結果，具有自主知識產權的、個性化的熒光定量分析軟件相對缺乏，結合細胞特征而研究設計的熒光分析軟件可以相對定量分析免疫熒光圖像中的核轉位現象，協助探討NF-κB/p65蛋白的核轉位規律。本文將熒光分析軟件應用到免疫熒光圖像的定量及定位分析中，研究內毒素激活原代人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的NF—κB信號通路的時效規律。
1 材料與方法
1.1 主要試劑材料與儀器
新生兒臍帶取自于南昌大學第一附屬醫院婦產科正常足月新生兒，M199培養基購自HyClone公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、0.25%胰酶購自Gibco公司；牛血清白蛋白、II型膠原酶購自索來寶公司；脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(E.coil O55B5)購自Sigma公司；內皮細胞生長復合物(endothelial cell growth supplement, ECGs)購自BD公司；用于免疫熒光實驗的兔抗NF-κB/p65抗體購自中山金橋公司；兔抗VIII相關抗體購自博士德生物；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標記的驢抗兔IgG購自Invitrogen公司；用于Western blot實驗的鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體、鼠抗NF-κB/p65(A)抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的山羊抗鼠IgG均購自Santa Cruz公司；化學發光試劑盒購自Pierce公司。
IX71型熒光顯微鏡為Olympus公司產品；垂直電泳系統及轉印系統、全自動凝膠成像系統均為Bio-Rad公司產品。
所有細胞培養相關實驗用品均經過去熱源處理。
1.2 實驗方法
1.2.1 原代分離培養HUVECs及鑒定
生理鹽水沖洗臍靜脈，消化液(1 :1.01%Ⅱ型膠原酶：0.25%胰酶)充盈臍靜脈，于37℃消化30 min，收集消化液和沖洗液，1 200 r/min離心收集細胞，用含1%青、鏈霉素、100μg/ml ECGs和20% FBS的M199完全培養基重懸細胞并接種于培養瓶，置37℃、5% CO2的孵箱內培養，免疫熒光檢測胞質Ⅷ因子相關抗原以鑒定內皮細胞[4-5]。
1.2.2 免疫熒光染色
細胞消化傳代，種入24孔板爬片。待細胞貼壁后取均勻分布的單層細胞爬片隨機分為6組，分別予LPS(1μg/mL)處理0.5、1、2、4 h；空白對照組無LPS處理；陰性對照組無LPS處理和一抗處理。各組處理后予4%多聚甲醛4℃固定爬片10 min，0.5% TritonX-100透化處理10 min，1%牛血清白蛋白37℃封閉30 min。行細胞免疫熒光染色，分別滴加一抗(兔抗NF-κB/p65單克隆抗體，1 :50稀釋，陰性對照不加一抗)4℃過夜，次日取出37℃孵育1 h，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)洗滌三次后滴加二抗(FITC標記的驢抗兔IgG，1 000倍稀釋)37℃孵育1 h，PBS洗滌三次，4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)復染2 min，PBS洗滌后用50%甘油封片。各組于熒光顯微鏡同一曝光條件(FITC曝光時間1/2.8 s，ISO 1600)下觀察結果并拍照。各實驗組均設三個復孔爬片。
1.2.3 免疫熒光圖片收集、軟件分析
該自主研發的軟件是基于VC++6.0開發平臺實現的具有菜單式圖像界面的系統，主要功能模塊包括以下四個部分，如圖 1所示：①圖像獲取：熒光顯微鏡下每組隨機取5張照片獲取圖片信息，添加圖像到主程序中。②圖像預處理：通過灰度化、二值化、均值濾波、膨脹和腐蝕等操作處理圖像，減少圖像噪聲。③圖像分割：提取細胞核二值圖像進行距離變換，將像素點位置信息轉化為灰度信息[6]，并提取出能代表各個細胞的“種子點”[7]，將種子點圖與細胞二值圖結合找到細胞圖中各個細胞的所在位置并重構細胞距離圖，最后利用“模擬浸沒”的方法實現分水嶺分割[8]，采用同樣的分割方法進行粘連細胞核的分割，最后通過二值圖像的四連通域方法，完成各細胞的標號。④參數提取：分別計算各個細胞和細胞核的面積及熒光強度，在得到的細胞熒光強度和細胞核熒光強度的基礎上，計算得到細胞質的熒光強度，從而得到胞核與胞質的熒光強度比。其中，每個細胞的面積等于對應標號的總像素點個數，而細胞的熒光強度等于對應標號的像素點灰度總值除以細胞面積。同理得到細胞核的各個參數。細胞質熒光強度=(細胞熒光強度-細胞核熒光強度)/(細胞面積-細胞核面積)。
圖1
免疫熒光分析軟件設計模塊
Figure1.
Design module of immuno-fluorescence analysis software
1.2.4 Western blot驗證NF-κB/p65蛋白表達變化
原代HUVECs隨機分為5組，分別予LPS(1μg/mL)處理0.5、1、2、4 h；空白對照組(0 h組)無LPS處理。分別提取各組總蛋白和胞質、胞核蛋白，于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移至硝酸纖維膜上，室溫下5 %牛奶封閉1 h，加入鼠抗NF-κB/p65(A)抗體(一抗，稀釋比為1 :250)和HRP標記山羊抗鼠IgG(二抗，稀釋比1 :2 000)，內參為鼠抗GAPDH抗體(稀釋比為1 :500)。一抗加入后于4℃孵育過夜。洗滌后加入相應的二抗室溫孵育2 h。洗滌后應用化學發光液于全自動凝膠成像系統檢測雜交信號，Image J 1.44p軟件定量分析比較條帶結果。
1.3 統計學處理
數據采用SPSS 17.0軟件分析, 用
2 實驗結果分析
2.1 HUVECs形態與鑒定
原代HUVECs生長呈典型鋪路石樣排列[見圖 2(a)]，Ⅷ因子相關抗原鑒定[見圖 2(b)]陽性，與陰性對照組[見圖 2(c)]相比，原代HUVECs細胞質中可見高強度的綠色熒光，胞核內熒光極弱。
圖2
原代HUVECs的細胞形態與分離鑒定
(a)光鏡下原代HUVECs形態；(b)熒光顯微鏡下Ⅷ因子鑒定內皮細胞；(c)陰性對照
Figure2. Morphology and identification of primary HUVECs(a) morphology of primary HUVECs under light microscope; (b) primary HUVECs identification with factorⅧunder fluorescence microscope; (c) negative control
2.2 免疫熒光染色法檢測LPS誘導HUVECs的核因子-κB激活
如圖 3所示，熒光鏡下HUVECs于爬片上多聚團生長，每張爬片在熒光顯微鏡(40×)下隨機選取5個不重疊視野觀察，結果提示：與空白對照組相比，LPS各組隨刺激時間增加整體熒光強度逐漸增加，胞核內熒光逐漸聚集，整體熒光強度于4 h達高峰，核轉位現象在2 h組和4 h組較顯著。而在未添加NF-κB/p65(A)一抗的陰性對照組中未見FITC綠色熒光，可排除二抗非特異性結合對實驗的干擾。
圖3
熒光顯微鏡下觀察LPS刺激原代HUVECs后NF-κB/p65蛋白在細胞中的表達和定位
Figure3.
Localization and expression of NF-κB/p65 in HUVECs stimulated with LPS observed under fluorescence microscope
2.3 免疫熒光軟件分析熒光圖像檢測NF-κB/p65蛋白的核轉位現象
如表 1所示，LPS刺激后各組總熒光強度逐漸增強，4 h組總熒光值最高，1 h、2 h和4 h組總熒光值與空白對照組相比均有顯著差異(P＜0.01)；胞核/胞質熒光比值2 h組最高，與空白對照組相比具有顯著性差異(P＜0.01)。
表1
免疫熒光分析軟件檢測熒光值結果
Table1.
Fluorescence value of each group determined by fluorescence analysis software
2.4 Western blot檢驗NF-κB/p65蛋白表達變化
如圖 4(a)所示，與空白對照組(0 h組)相比，總NF-κB/p65蛋白隨著LPS刺激時間延長表達逐漸升高，4 h為表達高峰；胞核、胞質NF-κB/p65蛋白表達也隨LPS刺激時間延長逐漸增加。圖 5(b)的Image J分析結果顯示：總蛋白表達上調，1 h和4 h與空白對照組相比具有顯著性差異(P＜0.01)，胞質、胞核蛋白條帶比照其各自對應內參后，胞核/胞質比值于2 h組明顯高于空白對照組，且具有顯著性差異(P＜0.01)。
圖4
LPS刺激HUVECs后NF-κB/p65蛋白的表達變化
(a) Western blot檢測各組NF-κB/p65蛋白的表達；(b)Image J軟件分析Western blot實驗結果(* *各實驗組0.5 h組、1 h組、2 h組、4 h組分別與空白對照組0 h組比較,
(a) expression of NF-κB/p65 detected by Western blot; (b) results of Western blot analyzed by Image J (* *group 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h compared with group 0 h respectively,
3 討論與結論
免疫熒光是觀察細胞內蛋白核轉位現象最直觀的方法，但主要通過主觀定性判斷熒光結果，難以量化分析。既往有電泳遷移率實驗(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)半定量方法檢測NF-κB核轉位，但實驗步驟繁多復雜，需要使用放射性同位素及大量細胞，因此分析原代細胞顯得尤為困難[9-11]。也有研究應用激光共聚焦顯微鏡定量分析細胞內目標熒光蛋白變化[12]，但鑒于實驗條件的限制，我們希望在運用現有普通熒光顯微鏡的基礎上，尋求科學的圖像分析軟件，為免疫熒光的定量分析提供更可靠的依據。目前市場上圖像分析軟件頗多：有關研究運用MetaMorph軟件計算熒光素標記的p65蛋白的總熒光密度值的分布，并結合NF-κB活性試劑盒輔助分析核轉位特征[2]，事實上NF-κB活性試劑盒即是EMSA和酶聯免疫原理的結合，但其實驗成本高且無法同時分析胞質與胞核蛋白表達關系；Noursadeghi等[13]的研究中運用Image J定量分析巨噬細胞熒光圖片，但巨噬細胞多分散單個分布，而HUVECs常呈鋪路石樣緊密排列生長，準確分割成片細胞圖像存在困難；此外，也有相關研究結合應用軟件Simple PCI、Imagepro-Plus 6.0和Image J半定量分析細胞骨架蛋白免疫熒光圖像，成功分割提取單個細胞[14]，通過比較細胞骨架分形維數觀察微管蛋白表達變化，但多軟件圖像處理過程相對復雜，且參數的選取直接影響實驗結果，所以對于難以分割的成片HUVECs熒光圖像，胞質胞核參數的獨立提取和定位還難以實現。
因此我們嘗試設計VC++6.0為平臺的免疫熒光分析軟件，考慮HUVECs的生長特性采用基于“種子點”優化的分水嶺分割算法，實現成片生長的細胞的有效分離；同時通過胞核DAPI藍色熒光較精確定位胞核位置，以實現對圖片中細胞個數、面積、圓度因子、灰度均值、熒光強度等參數的獨立提取，通過上述方法得到的細胞總熒光值和胞核胞質熒光比值，進一步判斷HUVECs中NF-κB/p65蛋白的表達變化和核轉位現象的發生特點。
然而，由于該軟件細胞分割模塊是基于對應的細胞核圖像，而即便是激光共聚焦顯微鏡下獲取的熒光圖像中仍存在細胞核圖像熒光亮度不均勻的問題，在進行OTSU(最大熵閾值分割法)閾值處理的時候，因部分細胞核灰度值較低，當其低于自適應閾值時，會被認為是背景不被識別而出現部分細胞的漏割現象。目前還沒有完成適用于將所有細胞圖像都完全分割的技術，我們的研究結果顯示個別低染細胞漏處理在一定程度上不會影響對整體熒光趨勢的判斷，同時我們的軟件也在進一步完善中，通過合理化閾值盡可能識別并分割所有細胞。
本實驗以LPS刺激原代HUVECs，嘗試運用自主研發的免疫熒光分析軟件探討NF-κB/p65核轉位規律。NF-κB作為細胞內廣泛存在轉錄因子，可與抑制因子IκB結合成三聚體以失活的狀態存在于細胞質中，當細胞受到各種因素刺激時，可激活IκB激酶與NF-κB/p65蛋白解離，活化的NF-κB/p65被釋放并進入細胞核中激活轉錄，參與多種基因的調控[15-16]。上述實驗分析顯示：熒光鏡下主觀判斷、熒光分析軟件檢測以及Western blot實驗三種結果表現出較好的一致性，即各LPS組細胞NF-κB/p65總蛋白表達上調，于4 h表達水平最高，2 h出現核轉高峰。NF-κB信號通路激活初始時，細胞內少量NF-κB/p65蛋白釋放，調節相關基因轉錄包括上調NF-κB/p65蛋白的合成，4 h為合成高峰期。隨著LPS誘導時間延長，更多的新合成的NF-κB/p65蛋白再次被釋放入核，4 h核轉位低于2 h高峰期，已呈現p65出核趨勢，體現了NF-κB/p65核轉位震蕩規律以及通路中信號分子動態傳遞過程。
免疫熒光分析軟件利用計算機處理熒光圖像快捷簡便，實現了對細胞熒光參數的相對定量分析，對于肉眼難以準確判斷的熒光圖像具有很好的輔助分析意義，為我們在此基礎上進一步探討研究NF-κB信號通路的下游相關基因表達的分子機制提供了可靠的實驗依據。
引言
NF-κB信號通路在免疫應答、細胞存活和增殖分化等方面發揮重要調控作用，通路的激活表現在細胞內多種蛋白和酶的級聯式反應以及相關基因的轉錄調控[1]。Rogers等[2]在研究一氧化氮對腫瘤壞死因子-α誘導(human umbilical vein endothelial cells, HUVFCs)的NF-κB信號通路的激活過程中發現NF-κB/p65蛋白核轉位“震蕩現象”，NF-κB/p65核轉位作為調控轉錄的始動因素，是我們研究NF-κB信號通路的關鍵。免疫熒光是觀察細胞內蛋白核轉位較直觀的實驗方法[3]，但多限于主觀定性判斷熒光圖片結果，具有自主知識產權的、個性化的熒光定量分析軟件相對缺乏，結合細胞特征而研究設計的熒光分析軟件可以相對定量分析免疫熒光圖像中的核轉位現象，協助探討NF-κB/p65蛋白的核轉位規律。本文將熒光分析軟件應用到免疫熒光圖像的定量及定位分析中，研究內毒素激活原代人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的NF—κB信號通路的時效規律。
1 材料與方法
1.1 主要試劑材料與儀器
新生兒臍帶取自于南昌大學第一附屬醫院婦產科正常足月新生兒，M199培養基購自HyClone公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、0.25%胰酶購自Gibco公司；牛血清白蛋白、II型膠原酶購自索來寶公司；脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(E.coil O55B5)購自Sigma公司；內皮細胞生長復合物(endothelial cell growth supplement, ECGs)購自BD公司；用于免疫熒光實驗的兔抗NF-κB/p65抗體購自中山金橋公司；兔抗VIII相關抗體購自博士德生物；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標記的驢抗兔IgG購自Invitrogen公司；用于Western blot實驗的鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體、鼠抗NF-κB/p65(A)抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的山羊抗鼠IgG均購自Santa Cruz公司；化學發光試劑盒購自Pierce公司。
IX71型熒光顯微鏡為Olympus公司產品；垂直電泳系統及轉印系統、全自動凝膠成像系統均為Bio-Rad公司產品。
所有細胞培養相關實驗用品均經過去熱源處理。
1.2 實驗方法
1.2.1 原代分離培養HUVECs及鑒定
生理鹽水沖洗臍靜脈，消化液(1 :1.01%Ⅱ型膠原酶：0.25%胰酶)充盈臍靜脈，于37℃消化30 min，收集消化液和沖洗液，1 200 r/min離心收集細胞，用含1%青、鏈霉素、100μg/ml ECGs和20% FBS的M199完全培養基重懸細胞并接種于培養瓶，置37℃、5% CO2的孵箱內培養，免疫熒光檢測胞質Ⅷ因子相關抗原以鑒定內皮細胞[4-5]。
1.2.2 免疫熒光染色
細胞消化傳代，種入24孔板爬片。待細胞貼壁后取均勻分布的單層細胞爬片隨機分為6組，分別予LPS(1μg/mL)處理0.5、1、2、4 h；空白對照組無LPS處理；陰性對照組無LPS處理和一抗處理。各組處理后予4%多聚甲醛4℃固定爬片10 min，0.5% TritonX-100透化處理10 min，1%牛血清白蛋白37℃封閉30 min。行細胞免疫熒光染色，分別滴加一抗(兔抗NF-κB/p65單克隆抗體，1 :50稀釋，陰性對照不加一抗)4℃過夜，次日取出37℃孵育1 h，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)洗滌三次后滴加二抗(FITC標記的驢抗兔IgG，1 000倍稀釋)37℃孵育1 h，PBS洗滌三次，4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)復染2 min，PBS洗滌后用50%甘油封片。各組于熒光顯微鏡同一曝光條件(FITC曝光時間1/2.8 s，ISO 1600)下觀察結果并拍照。各實驗組均設三個復孔爬片。
1.2.3 免疫熒光圖片收集、軟件分析
該自主研發的軟件是基于VC++6.0開發平臺實現的具有菜單式圖像界面的系統，主要功能模塊包括以下四個部分，如圖 1所示：①圖像獲取：熒光顯微鏡下每組隨機取5張照片獲取圖片信息，添加圖像到主程序中。②圖像預處理：通過灰度化、二值化、均值濾波、膨脹和腐蝕等操作處理圖像，減少圖像噪聲。③圖像分割：提取細胞核二值圖像進行距離變換，將像素點位置信息轉化為灰度信息[6]，并提取出能代表各個細胞的“種子點”[7]，將種子點圖與細胞二值圖結合找到細胞圖中各個細胞的所在位置并重構細胞距離圖，最后利用“模擬浸沒”的方法實現分水嶺分割[8]，采用同樣的分割方法進行粘連細胞核的分割，最后通過二值圖像的四連通域方法，完成各細胞的標號。④參數提取：分別計算各個細胞和細胞核的面積及熒光強度，在得到的細胞熒光強度和細胞核熒光強度的基礎上，計算得到細胞質的熒光強度，從而得到胞核與胞質的熒光強度比。其中，每個細胞的面積等于對應標號的總像素點個數，而細胞的熒光強度等于對應標號的像素點灰度總值除以細胞面積。同理得到細胞核的各個參數。細胞質熒光強度=(細胞熒光強度-細胞核熒光強度)/(細胞面積-細胞核面積)。
圖1
免疫熒光分析軟件設計模塊
Figure1.
Design module of immuno-fluorescence analysis software
1.2.4 Western blot驗證NF-κB/p65蛋白表達變化
原代HUVECs隨機分為5組，分別予LPS(1μg/mL)處理0.5、1、2、4 h；空白對照組(0 h組)無LPS處理。分別提取各組總蛋白和胞質、胞核蛋白，于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移至硝酸纖維膜上，室溫下5 %牛奶封閉1 h，加入鼠抗NF-κB/p65(A)抗體(一抗，稀釋比為1 :250)和HRP標記山羊抗鼠IgG(二抗，稀釋比1 :2 000)，內參為鼠抗GAPDH抗體(稀釋比為1 :500)。一抗加入后于4℃孵育過夜。洗滌后加入相應的二抗室溫孵育2 h。洗滌后應用化學發光液于全自動凝膠成像系統檢測雜交信號，Image J 1.44p軟件定量分析比較條帶結果。
1.3 統計學處理
數據采用SPSS 17.0軟件分析, 用
2 實驗結果分析
2.1 HUVECs形態與鑒定
原代HUVECs生長呈典型鋪路石樣排列[見圖 2(a)]，Ⅷ因子相關抗原鑒定[見圖 2(b)]陽性，與陰性對照組[見圖 2(c)]相比，原代HUVECs細胞質中可見高強度的綠色熒光，胞核內熒光極弱。
圖2
原代HUVECs的細胞形態與分離鑒定
(a)光鏡下原代HUVECs形態；(b)熒光顯微鏡下Ⅷ因子鑒定內皮細胞；(c)陰性對照
Figure2. Morphology and identification of primary HUVECs(a) morphology of primary HUVECs under light microscope; (b) primary HUVECs identification with factorⅧunder fluorescence microscope; (c) negative control
2.2 免疫熒光染色法檢測LPS誘導HUVECs的核因子-κB激活
如圖 3所示，熒光鏡下HUVECs于爬片上多聚團生長，每張爬片在熒光顯微鏡(40×)下隨機選取5個不重疊視野觀察，結果提示：與空白對照組相比，LPS各組隨刺激時間增加整體熒光強度逐漸增加，胞核內熒光逐漸聚集，整體熒光強度于4 h達高峰，核轉位現象在2 h組和4 h組較顯著。而在未添加NF-κB/p65(A)一抗的陰性對照組中未見FITC綠色熒光，可排除二抗非特異性結合對實驗的干擾。
圖3
熒光顯微鏡下觀察LPS刺激原代HUVECs后NF-κB/p65蛋白在細胞中的表達和定位
Figure3.
Localization and expression of NF-κB/p65 in HUVECs stimulated with LPS observed under fluorescence microscope
2.3 免疫熒光軟件分析熒光圖像檢測NF-κB/p65蛋白的核轉位現象
如表 1所示，LPS刺激后各組總熒光強度逐漸增強，4 h組總熒光值最高，1 h、2 h和4 h組總熒光值與空白對照組相比均有顯著差異(P＜0.01)；胞核/胞質熒光比值2 h組最高，與空白對照組相比具有顯著性差異(P＜0.01)。
表1
免疫熒光分析軟件檢測熒光值結果
Table1.
Fluorescence value of each group determined by fluorescence analysis software
2.4 Western blot檢驗NF-κB/p65蛋白表達變化
如圖 4(a)所示，與空白對照組(0 h組)相比，總NF-κB/p65蛋白隨著LPS刺激時間延長表達逐漸升高，4 h為表達高峰；胞核、胞質NF-κB/p65蛋白表達也隨LPS刺激時間延長逐漸增加。圖 5(b)的Image J分析結果顯示：總蛋白表達上調，1 h和4 h與空白對照組相比具有顯著性差異(P＜0.01)，胞質、胞核蛋白條帶比照其各自對應內參后，胞核/胞質比值于2 h組明顯高于空白對照組，且具有顯著性差異(P＜0.01)。
圖4
LPS刺激HUVECs后NF-κB/p65蛋白的表達變化
(a) Western blot檢測各組NF-κB/p65蛋白的表達；(b)Image J軟件分析Western blot實驗結果(* *各實驗組0.5 h組、1 h組、2 h組、4 h組分別與空白對照組0 h組比較,
(a) expression of NF-κB/p65 detected by Western blot; (b) results of Western blot analyzed by Image J (* *group 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h compared with group 0 h respectively,
3 討論與結論
免疫熒光是觀察細胞內蛋白核轉位現象最直觀的方法，但主要通過主觀定性判斷熒光結果，難以量化分析。既往有電泳遷移率實驗(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)半定量方法檢測NF-κB核轉位，但實驗步驟繁多復雜，需要使用放射性同位素及大量細胞，因此分析原代細胞顯得尤為困難[9-11]。也有研究應用激光共聚焦顯微鏡定量分析細胞內目標熒光蛋白變化[12]，但鑒于實驗條件的限制，我們希望在運用現有普通熒光顯微鏡的基礎上，尋求科學的圖像分析軟件，為免疫熒光的定量分析提供更可靠的依據。目前市場上圖像分析軟件頗多：有關研究運用MetaMorph軟件計算熒光素標記的p65蛋白的總熒光密度值的分布，并結合NF-κB活性試劑盒輔助分析核轉位特征[2]，事實上NF-κB活性試劑盒即是EMSA和酶聯免疫原理的結合，但其實驗成本高且無法同時分析胞質與胞核蛋白表達關系；Noursadeghi等[13]的研究中運用Image J定量分析巨噬細胞熒光圖片，但巨噬細胞多分散單個分布，而HUVECs常呈鋪路石樣緊密排列生長，準確分割成片細胞圖像存在困難；此外，也有相關研究結合應用軟件Simple PCI、Imagepro-Plus 6.0和Image J半定量分析細胞骨架蛋白免疫熒光圖像，成功分割提取單個細胞[14]，通過比較細胞骨架分形維數觀察微管蛋白表達變化，但多軟件圖像處理過程相對復雜，且參數的選取直接影響實驗結果，所以對于難以分割的成片HUVECs熒光圖像，胞質胞核參數的獨立提取和定位還難以實現。
因此我們嘗試設計VC++6.0為平臺的免疫熒光分析軟件，考慮HUVECs的生長特性采用基于“種子點”優化的分水嶺分割算法，實現成片生長的細胞的有效分離；同時通過胞核DAPI藍色熒光較精確定位胞核位置，以實現對圖片中細胞個數、面積、圓度因子、灰度均值、熒光強度等參數的獨立提取，通過上述方法得到的細胞總熒光值和胞核胞質熒光比值，進一步判斷HUVECs中NF-κB/p65蛋白的表達變化和核轉位現象的發生特點。
然而，由于該軟件細胞分割模塊是基于對應的細胞核圖像，而即便是激光共聚焦顯微鏡下獲取的熒光圖像中仍存在細胞核圖像熒光亮度不均勻的問題，在進行OTSU(最大熵閾值分割法)閾值處理的時候，因部分細胞核灰度值較低，當其低于自適應閾值時，會被認為是背景不被識別而出現部分細胞的漏割現象。目前還沒有完成適用于將所有細胞圖像都完全分割的技術，我們的研究結果顯示個別低染細胞漏處理在一定程度上不會影響對整體熒光趨勢的判斷，同時我們的軟件也在進一步完善中，通過合理化閾值盡可能識別并分割所有細胞。
本實驗以LPS刺激原代HUVECs，嘗試運用自主研發的免疫熒光分析軟件探討NF-κB/p65核轉位規律。NF-κB作為細胞內廣泛存在轉錄因子，可與抑制因子IκB結合成三聚體以失活的狀態存在于細胞質中，當細胞受到各種因素刺激時，可激活IκB激酶與NF-κB/p65蛋白解離，活化的NF-κB/p65被釋放并進入細胞核中激活轉錄，參與多種基因的調控[15-16]。上述實驗分析顯示：熒光鏡下主觀判斷、熒光分析軟件檢測以及Western blot實驗三種結果表現出較好的一致性，即各LPS組細胞NF-κB/p65總蛋白表達上調，于4 h表達水平最高，2 h出現核轉高峰。NF-κB信號通路激活初始時，細胞內少量NF-κB/p65蛋白釋放，調節相關基因轉錄包括上調NF-κB/p65蛋白的合成，4 h為合成高峰期。隨著LPS誘導時間延長，更多的新合成的NF-κB/p65蛋白再次被釋放入核，4 h核轉位低于2 h高峰期，已呈現p65出核趨勢，體現了NF-κB/p65核轉位震蕩規律以及通路中信號分子動態傳遞過程。
免疫熒光分析軟件利用計算機處理熒光圖像快捷簡便，實現了對細胞熒光參數的相對定量分析，對于肉眼難以準確判斷的熒光圖像具有很好的輔助分析意義，為我們在此基礎上進一步探討研究NF-κB信號通路的下游相關基因表達的分子機制提供了可靠的實驗依據。
