高尿酸血癥是多種疾病的危險因素, 但人們對急性高尿酸血癥的認識還存在不足。本研究旨在從血液流變學角度探討急性高尿酸血癥對紅細胞的影響, 為其臨床處理提供參考依據。通過對大鼠灌胃500 mg/kg的次黃嘌呤, 同時腹腔注射100 mg/kg氧嗪酸鉀誘導短期急性高尿酸血癥模型, 在給藥的第0、1、2、3、6 h內眥取血測量血尿酸水平、紅細胞的流變學指標和血漿丙二醛水平。結果表明給藥后1、2、3 h大鼠血尿酸水平顯著升高, 同期內紅細胞的積分變形指數、松弛指數顯著升高, 紅細胞的破碎率顯著降低, 給藥后2 h血漿丙二醛水平顯著降低。結果提示, 短期急性尿酸升高引起了紅細胞流變學特性的改善和脂質過氧化水平的下降。
引用本文： 李葵花, 王喜福, 劉玉玲, 李璐, 許士奇, 佟曉波, 謝利德, 姚偉娟. 急性高尿酸血癥大鼠的紅細胞血液流變學研究. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(2): 321-325. doi: 10.7507/1001-5515.20150059 復制
引言
由于尿酸排泄減少或尿酸合成增加，或者兩個方面的共同作用，引起血液中尿酸濃度的升高，稱為高尿酸血癥。大多數研究者認為慢性高尿酸血癥是很多疾病的危險因素[1-2]，但對急性高尿酸血癥的認識偏差較大。在各種急性病癥如急性冠脈綜合征、急性心力衰竭、急性腦卒中和各種心腦血管手術后，常出現血液中急性尿酸水平的升高，然而高尿酸水平是短期預后良好的預測因子[3]，還是不良結局的危險指標[4]仍存在爭議，對急性尿酸升高是否需要干預仍是臨床面臨的重要問題，因此從不同角度出發對急性高尿酸血癥進行研究顯得尤為必要。血液流變學是研究血液流動及其與周圍環境相互作用的學科，研究血液成分的變形和流動特性以及此時血管結構的變化特性，有助于更客觀、準確地反映血液循環的功能狀況。國內外尚無從血液流變學角度研究急性高尿酸血癥對機體影響的研究。本文通過建立急性高尿酸血癥大鼠模型，研究不同尿酸水平下紅細胞的流變特性，為臨床急性高尿酸血癥的處理提供參考依據。
1 材料和方法
1.1 主要試劑
本研究所需的主要試劑：次黃嘌呤(西亞試劑研究中心，批號K6432)，氧嗪酸鉀(上海金穗生物科技有限公司，批號JS14824)，羧甲基纖維素鈉(北京冰達生物有限公司)，聚丙烯吡咯烷酮(北京化學試劑公司)，尿酸試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司)，丙二醛試劑盒(南京建成試劑有限公司)。
1.2 實驗動物及處理
健康雄性SD大鼠10只，體重(300±10) g，購于北京大學醫學部實驗動物中心，以顆粒飼料飼養，自由飲水。以500 mg/kg的次黃嘌呤灌胃，100 mg/kg氧嗪酸鉀腹腔注射對10只大鼠造模[5]，在給藥的第0、1、2、3、6 h從每只大鼠的內眥取血，各時點選擇任意8個無溶血現象的血液樣本進行相關參數的測量，每個樣本重復測量三次以消除誤差。
1.3 尿酸水平的測定
采集血樣后，不做抗凝處理，待自然凝血后離心提取上清，-20℃冷凍批量檢測。酶法測定血清尿酸水平，具體步驟按照尿酸試劑盒廠家提供的說明書和儀器操作常規方法進行。
1.4 紅細胞流變學參數的測定
取肝素抗凝血40μL，與15%聚丙烯吡咯烷酮(N-polyvinylpyrrolidone, PVP)溶液(分子量30 kD，pH 7.4，滲透壓295 mOsm/kg，粘度8 CP)1 mL混勻，分別取500μL混合液檢測紅細胞變形性和松弛性[6]。取肝素抗凝血20μL，與3% PVP溶液(分子量30 kD，pH 7.4，滲透壓295 mOsm/kg，粘度1.2 CP)1 mL混勻，取500μL混合液檢測紅細胞小變形指數和取向指數[7](北京普利生LBY-BX紅細胞變形儀)。
取30μL肝素抗凝血分別加入到3 mL不同滲透壓的PBS溶液中混勻，靜置1 h，3 000 r/min離心6 min，取上清以UNICO UV-2000紫外分光光度計以540 nm的波長比色，以蒸餾水為空白對照，根據各管上清液的透光率(translation rate，Tr)計算細胞破碎率(haemolysis rate，Hr)，Hr=(Tr(295)-Tr)/(Tr(295)-Tr(0))×100%[8]。
1.5 血漿丙二醛的測定
取肝素抗凝血漿，硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)法測定血漿丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，具體操作遵照丙二醛試劑盒說明書。
1.6 統計學方法
實驗結果以均數±標準差(
2 結果
2.1 大鼠血尿酸水平的變化
給藥后大鼠血尿酸水平急速顯著升高，1、2、3 h時血尿酸水平明顯高于給藥前(P＜0.001)，2 h達到最高值；之后迅速回落，給藥6 h與給藥前相比無統計學差異，如圖 1所示。
圖1
血尿酸水平隨時間的變化
與0 h相比，*
as compared to 0 h, *
2.2 大鼠紅細胞變形性和松弛性的變化
紅細胞變形性是指紅細胞在外力作用下改變其形狀，以便通過小于其自身直徑的血管的能力，隨切變率增大，紅細胞的變形指數(deformation index，DI)逐漸變大，而積分變形指數(integrated deformation index，IDI)是反映從最小切變率逐漸增至最大切變率過程中紅細胞變形能力的總體效應。給藥后在大鼠尿酸水平顯著升高的時間段內，紅細胞的變形性也隨之升高。在各切變率下，紅細胞的變形指數波動較小，在1 000 s-1切變率下紅細胞的最大變形指數僅在2 h時差異有統計學意義(P＜0.05)，積分變形指數在1、2、3 h均顯著升高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05)，如圖 2所示。松弛實驗檢測剪切變形的紅細胞在除去剪切力后的彈性恢復特性。圖 2中顯示紅細胞的松弛指數(relaxation index，RI)在1、2、3 h均顯著升高(P＜0.001)。結果表明大鼠給藥造模后短期內紅細胞的整體變形性和松弛性變化較大。
圖2
紅細胞的變形性和松弛性
與0 h相比， &
as compared to 0 h, &
2.3 大鼠紅細胞小變形指數和取向指數的變化
用新型激光衍射法測得的低粘切變流場中的小變形指數DI(d)反映了紅細胞膜脂的流動性，取向指數DI(or)是一個可以在亞細胞水平上反映紅細胞膜細微結構變化引起的幾何特性和變形性改變的流變學指標[9]。給藥后小變形指數和取向指數雖與尿酸水平有相同的升高趨勢，但在所測時間范圍內變化無統計學差異，如圖 3所示。結果提示大鼠造模后短期內紅細胞膜脂流動性和細微結構的變化不大。
圖3
紅細胞的小變形指數和取向指數
Figure3.
The small deformation index and the orientation of erythrocytes
2.4 大鼠紅細胞滲透脆性的變化
滲透脆性是指紅細胞在低滲溶液中紅細胞膜的抗張強度，通常用紅細胞的破碎率表示。如圖 4所示，大鼠紅細胞處于等滲的環境中時，破碎率為0，保持了良好的完整性。隨著外環境滲透壓的降低，細胞的破碎率逐漸升高，但存在一個升勢較為平緩的“平臺期”。隨后，細胞的破碎率迅速升高，最終全部破碎。在145 mOsm·kg-1滲透壓下，各時間點細胞的平均破碎率差別較大。對145 mOsm·kg-1滲透壓下的破碎率進行統計，發現給藥后在尿酸水平顯著升高的同時期紅細胞的破碎率顯著降低(P＜0.05)，在2 h和3 h尤為明顯(P＜0.001)。結果表明給藥后大鼠紅細胞對低滲溶液的抵抗能力增強。
圖4
紅細胞的破碎率
與0 h相比， &
as compared to 0 h, &
2.5 大鼠血漿丙二醛的變化
MDA是脂質過氧化的分解產物，是反映組織氧化水平的重要指標。如圖 5所示，給藥后大鼠血漿丙二醛水平顯現降低趨勢，在2 h時差異有統計學意義(P＜0.05)，之后MDA水平逐漸升高回歸正常水平。這個結果說明給藥后血漿的氧化應激水平發生了變化。
圖5
血漿丙二醛隨時間的變化
與0 h相比， &
as compared to 0 h, &
3 討論
本實驗中通過灌胃次黃嘌呤增加尿酸的生成，并通過腹腔注射氧嗪酸鉀抑制尿酸酶活性，從而減少尿酸在大鼠體內的分解，使大鼠血漿尿酸水平急速升高，以模擬短期急性高尿酸血癥。在血尿酸急性升高期間對紅細胞的相關參數進行了測試。這些參數包括描述紅細胞變形性的變形指數，體現紅細胞松弛特性的松弛指數，反映紅細胞膜流動性的小變形指數，表述紅細胞在血液流動中取向能力的取向指數，代表紅細胞對低滲溶液抵抗能力的破碎率等。結果顯示紅細胞在各切變率的整體變形能力和彈性松弛恢復能力在血尿酸水平顯著升高時也顯著升高，而紅細胞的破碎率在尿酸水平升高時減少，提示高尿酸水平下紅細胞膜骨架可能發生變化，使紅細胞膜的抗張強度變大，抵抗外環境滲透壓的能力增強，從而保持了細胞的完整性。以上結果提示急性尿酸升高時紅細胞的狀態反而變得更好。
急性高尿酸血癥對機體的作用與尿酸的抗氧化能力和促氧化能力關系密切[10]。尿酸是人體中一種很重要的內源性抗氧化劑，是人類進化過程中延長壽命和降低年齡特異性患病率的主要因素[11-12]。循環過程中的紅細胞對過氧化損傷極為敏感，紅細胞膜脂質過氧化可導致其不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例降低，膜硬度增加，從而導致紅細胞變形性下降。MDA作為脂質過氧化的分解產物，常被用作細胞膜氧化損傷的指示物。在本實驗中發現在尿酸急性升高的時期，血漿MDA水平降低，這提示在急性高尿酸血癥中尿酸的抗氧化能力起到了主要作用。通過直接抑制過氧化自由基和過氧化亞硝酸鹽，使紅細胞免受過氧化損傷，這可能是尿酸急性升高期內紅細胞流變學特性得到改善的一個重要機制。有研究顯示，隨尿酸水平升高，急性腦卒中不良結局危險性反而呈下降的趨勢，表明高尿酸水平對急性腦梗死具有一定的保護作用，因此血清尿酸水平升高是急性缺血性腦卒中患者短期預后良好的一個獨立預測因子[3]。我們的結果也從血液流變學的角度提示急性尿酸水平升高可能是某些疾病預后良好的預測因子。但是，當高尿酸水平維持更長時間(24 h以上)時，尿酸就會作為促氧化劑引起腎功能的降低，造成急性腎臟損傷，此時尿酸就成為疾病發展的不利因素[13]。由此可以看出，高尿酸血癥持續時間的不同對紅細胞可能存在不同的影響。在本實驗中高尿酸水平維持時間較短，觀察到的是對血液流變學指標的保護作用，我們正在制備長期高尿酸血癥模型，以觀察其對流變學指標的影響并與本研究的結果進行對比。
本研究首次從血液流變學的角度探討了高尿酸血癥對機體的影響，發現血尿酸短期急性升高時，可通過其抗氧化能力改善紅細胞狀態。這將為臨床急性高尿酸血癥的處理提供流變學數據參考。我們正在對血尿酸短期急性升高時紅細胞膜蛋白的變化進行分析，以期找到流變學指標改善的分子機制。
引言
由于尿酸排泄減少或尿酸合成增加，或者兩個方面的共同作用，引起血液中尿酸濃度的升高，稱為高尿酸血癥。大多數研究者認為慢性高尿酸血癥是很多疾病的危險因素[1-2]，但對急性高尿酸血癥的認識偏差較大。在各種急性病癥如急性冠脈綜合征、急性心力衰竭、急性腦卒中和各種心腦血管手術后，常出現血液中急性尿酸水平的升高，然而高尿酸水平是短期預后良好的預測因子[3]，還是不良結局的危險指標[4]仍存在爭議，對急性尿酸升高是否需要干預仍是臨床面臨的重要問題，因此從不同角度出發對急性高尿酸血癥進行研究顯得尤為必要。血液流變學是研究血液流動及其與周圍環境相互作用的學科，研究血液成分的變形和流動特性以及此時血管結構的變化特性，有助于更客觀、準確地反映血液循環的功能狀況。國內外尚無從血液流變學角度研究急性高尿酸血癥對機體影響的研究。本文通過建立急性高尿酸血癥大鼠模型，研究不同尿酸水平下紅細胞的流變特性，為臨床急性高尿酸血癥的處理提供參考依據。
1 材料和方法
1.1 主要試劑
本研究所需的主要試劑：次黃嘌呤(西亞試劑研究中心，批號K6432)，氧嗪酸鉀(上海金穗生物科技有限公司，批號JS14824)，羧甲基纖維素鈉(北京冰達生物有限公司)，聚丙烯吡咯烷酮(北京化學試劑公司)，尿酸試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司)，丙二醛試劑盒(南京建成試劑有限公司)。
1.2 實驗動物及處理
健康雄性SD大鼠10只，體重(300±10) g，購于北京大學醫學部實驗動物中心，以顆粒飼料飼養，自由飲水。以500 mg/kg的次黃嘌呤灌胃，100 mg/kg氧嗪酸鉀腹腔注射對10只大鼠造模[5]，在給藥的第0、1、2、3、6 h從每只大鼠的內眥取血，各時點選擇任意8個無溶血現象的血液樣本進行相關參數的測量，每個樣本重復測量三次以消除誤差。
1.3 尿酸水平的測定
采集血樣后，不做抗凝處理，待自然凝血后離心提取上清，-20℃冷凍批量檢測。酶法測定血清尿酸水平，具體步驟按照尿酸試劑盒廠家提供的說明書和儀器操作常規方法進行。
1.4 紅細胞流變學參數的測定
取肝素抗凝血40μL，與15%聚丙烯吡咯烷酮(N-polyvinylpyrrolidone, PVP)溶液(分子量30 kD，pH 7.4，滲透壓295 mOsm/kg，粘度8 CP)1 mL混勻，分別取500μL混合液檢測紅細胞變形性和松弛性[6]。取肝素抗凝血20μL，與3% PVP溶液(分子量30 kD，pH 7.4，滲透壓295 mOsm/kg，粘度1.2 CP)1 mL混勻，取500μL混合液檢測紅細胞小變形指數和取向指數[7](北京普利生LBY-BX紅細胞變形儀)。
取30μL肝素抗凝血分別加入到3 mL不同滲透壓的PBS溶液中混勻，靜置1 h，3 000 r/min離心6 min，取上清以UNICO UV-2000紫外分光光度計以540 nm的波長比色，以蒸餾水為空白對照，根據各管上清液的透光率(translation rate，Tr)計算細胞破碎率(haemolysis rate，Hr)，Hr=(Tr(295)-Tr)/(Tr(295)-Tr(0))×100%[8]。
1.5 血漿丙二醛的測定
取肝素抗凝血漿，硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)法測定血漿丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，具體操作遵照丙二醛試劑盒說明書。
1.6 統計學方法
實驗結果以均數±標準差(
2 結果
2.1 大鼠血尿酸水平的變化
給藥后大鼠血尿酸水平急速顯著升高，1、2、3 h時血尿酸水平明顯高于給藥前(P＜0.001)，2 h達到最高值；之后迅速回落，給藥6 h與給藥前相比無統計學差異，如圖 1所示。
圖1
血尿酸水平隨時間的變化
與0 h相比，*
as compared to 0 h, *
2.2 大鼠紅細胞變形性和松弛性的變化
紅細胞變形性是指紅細胞在外力作用下改變其形狀，以便通過小于其自身直徑的血管的能力，隨切變率增大，紅細胞的變形指數(deformation index，DI)逐漸變大，而積分變形指數(integrated deformation index，IDI)是反映從最小切變率逐漸增至最大切變率過程中紅細胞變形能力的總體效應。給藥后在大鼠尿酸水平顯著升高的時間段內，紅細胞的變形性也隨之升高。在各切變率下，紅細胞的變形指數波動較小，在1 000 s-1切變率下紅細胞的最大變形指數僅在2 h時差異有統計學意義(P＜0.05)，積分變形指數在1、2、3 h均顯著升高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05)，如圖 2所示。松弛實驗檢測剪切變形的紅細胞在除去剪切力后的彈性恢復特性。圖 2中顯示紅細胞的松弛指數(relaxation index，RI)在1、2、3 h均顯著升高(P＜0.001)。結果表明大鼠給藥造模后短期內紅細胞的整體變形性和松弛性變化較大。
圖2
紅細胞的變形性和松弛性
與0 h相比， &
as compared to 0 h, &
2.3 大鼠紅細胞小變形指數和取向指數的變化
用新型激光衍射法測得的低粘切變流場中的小變形指數DI(d)反映了紅細胞膜脂的流動性，取向指數DI(or)是一個可以在亞細胞水平上反映紅細胞膜細微結構變化引起的幾何特性和變形性改變的流變學指標[9]。給藥后小變形指數和取向指數雖與尿酸水平有相同的升高趨勢，但在所測時間范圍內變化無統計學差異，如圖 3所示。結果提示大鼠造模后短期內紅細胞膜脂流動性和細微結構的變化不大。
圖3
紅細胞的小變形指數和取向指數
Figure3.
The small deformation index and the orientation of erythrocytes
2.4 大鼠紅細胞滲透脆性的變化
滲透脆性是指紅細胞在低滲溶液中紅細胞膜的抗張強度，通常用紅細胞的破碎率表示。如圖 4所示，大鼠紅細胞處于等滲的環境中時，破碎率為0，保持了良好的完整性。隨著外環境滲透壓的降低，細胞的破碎率逐漸升高，但存在一個升勢較為平緩的“平臺期”。隨后，細胞的破碎率迅速升高，最終全部破碎。在145 mOsm·kg-1滲透壓下，各時間點細胞的平均破碎率差別較大。對145 mOsm·kg-1滲透壓下的破碎率進行統計，發現給藥后在尿酸水平顯著升高的同時期紅細胞的破碎率顯著降低(P＜0.05)，在2 h和3 h尤為明顯(P＜0.001)。結果表明給藥后大鼠紅細胞對低滲溶液的抵抗能力增強。
圖4
紅細胞的破碎率
與0 h相比， &
as compared to 0 h, &
2.5 大鼠血漿丙二醛的變化
MDA是脂質過氧化的分解產物，是反映組織氧化水平的重要指標。如圖 5所示，給藥后大鼠血漿丙二醛水平顯現降低趨勢，在2 h時差異有統計學意義(P＜0.05)，之后MDA水平逐漸升高回歸正常水平。這個結果說明給藥后血漿的氧化應激水平發生了變化。
圖5
血漿丙二醛隨時間的變化
與0 h相比， &
as compared to 0 h, &
3 討論
本實驗中通過灌胃次黃嘌呤增加尿酸的生成，并通過腹腔注射氧嗪酸鉀抑制尿酸酶活性，從而減少尿酸在大鼠體內的分解，使大鼠血漿尿酸水平急速升高，以模擬短期急性高尿酸血癥。在血尿酸急性升高期間對紅細胞的相關參數進行了測試。這些參數包括描述紅細胞變形性的變形指數，體現紅細胞松弛特性的松弛指數，反映紅細胞膜流動性的小變形指數，表述紅細胞在血液流動中取向能力的取向指數，代表紅細胞對低滲溶液抵抗能力的破碎率等。結果顯示紅細胞在各切變率的整體變形能力和彈性松弛恢復能力在血尿酸水平顯著升高時也顯著升高，而紅細胞的破碎率在尿酸水平升高時減少，提示高尿酸水平下紅細胞膜骨架可能發生變化，使紅細胞膜的抗張強度變大，抵抗外環境滲透壓的能力增強，從而保持了細胞的完整性。以上結果提示急性尿酸升高時紅細胞的狀態反而變得更好。
急性高尿酸血癥對機體的作用與尿酸的抗氧化能力和促氧化能力關系密切[10]。尿酸是人體中一種很重要的內源性抗氧化劑，是人類進化過程中延長壽命和降低年齡特異性患病率的主要因素[11-12]。循環過程中的紅細胞對過氧化損傷極為敏感，紅細胞膜脂質過氧化可導致其不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例降低，膜硬度增加，從而導致紅細胞變形性下降。MDA作為脂質過氧化的分解產物，常被用作細胞膜氧化損傷的指示物。在本實驗中發現在尿酸急性升高的時期，血漿MDA水平降低，這提示在急性高尿酸血癥中尿酸的抗氧化能力起到了主要作用。通過直接抑制過氧化自由基和過氧化亞硝酸鹽，使紅細胞免受過氧化損傷，這可能是尿酸急性升高期內紅細胞流變學特性得到改善的一個重要機制。有研究顯示，隨尿酸水平升高，急性腦卒中不良結局危險性反而呈下降的趨勢，表明高尿酸水平對急性腦梗死具有一定的保護作用，因此血清尿酸水平升高是急性缺血性腦卒中患者短期預后良好的一個獨立預測因子[3]。我們的結果也從血液流變學的角度提示急性尿酸水平升高可能是某些疾病預后良好的預測因子。但是，當高尿酸水平維持更長時間(24 h以上)時，尿酸就會作為促氧化劑引起腎功能的降低，造成急性腎臟損傷，此時尿酸就成為疾病發展的不利因素[13]。由此可以看出，高尿酸血癥持續時間的不同對紅細胞可能存在不同的影響。在本實驗中高尿酸水平維持時間較短，觀察到的是對血液流變學指標的保護作用，我們正在制備長期高尿酸血癥模型，以觀察其對流變學指標的影響并與本研究的結果進行對比。
本研究首次從血液流變學的角度探討了高尿酸血癥對機體的影響，發現血尿酸短期急性升高時，可通過其抗氧化能力改善紅細胞狀態。這將為臨床急性高尿酸血癥的處理提供流變學數據參考。我們正在對血尿酸短期急性升高時紅細胞膜蛋白的變化進行分析，以期找到流變學指標改善的分子機制。
