骨髓間充質干細胞(BMSC)移植是重癥急性胰腺炎(SAP)治療的研究熱點。但在臨床應用中, 該治療方式卻遇到了諸多技術及倫理問題。BMSC的旁分泌因子具有與細胞移植同樣的療效, 且可減少上述生物安全問題, 具有更安全、更易操控的治療優勢。本文就BMSC旁分泌因子在SAP中的治療潛能作一綜述, 注射含旁分泌因子的BMSC培養上清有望成為未來SAP細胞治療的新策略。
引用本文： 陳珂玲, 周總光, 周斌, 李園. 骨髓間充質干細胞旁分泌因子治療重癥急性胰腺炎的潛能. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(1): 245-248. doi: 10.7507/1001-5515.20150045 復制
引言
重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是外科常見急腹癥，起病驟，預后差，死亡率高，在幫助患者修復受損組織及恢復器官功能方面尚無有效措施。骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC)因具有多向分化潛能、來源方便等優點，成為治療SAP的熱點。然而在臨床應用中，BMSC移植治療的方式卻遇到了諸多技術及倫理問題，如患者腫瘤、血栓形成的風險加大，異質性組織的形成等。近年來，科學家發現BMSC的旁分泌因子具有與BMSC移植同樣的治療效果，且可減少上述生物安全問題，具有更安全、更易操控的治療優勢[1-2]。在此，本文將針對BMSC旁分泌因子在SAP治療中的潛能作一綜述。
1 BMSC及其旁分泌作用
1.1 BMSC
自1987年，Friedenstein等首次發現并培養出BMSC后，BMSC因具有多向分化潛能、可參與免疫調節、促進效應細胞定位及歸巢等特點，迅速在包括心臟、胰腺及腎臟等在內的多種組織器官的再生中得到研究和應用，甚至在急性肺損傷、骨組織工程及腦出血等疾病中已進入臨床試驗階段[3-4]。然而，隨著這些基礎研究的成果逐步向臨床應用轉化，BMSC移植的細胞治療方式在實際操作中顯現出了諸多問題：
首先，BMSC作為活細胞被移植入人體以后，其在體內的增殖數量與頻率往往不可控，而細胞的增殖數量通常與臟器的功能密切相關(如心肌細胞與血管內皮細胞的過度增殖會影響心臟功能等)。
其二，BMSC進入體內后，暴露于免疫細胞及體內其他可溶性物質的作用下，在這種特定的微環境中，BMSC的生物學行為很可能會改變，不向預期的方向發展。如細胞突變后引起腫瘤的風險加大，在臟器中形成異質性組織(已發現在心肌中產生骨組織，在腎臟中形成脂肪組織)等[5-6]。
其三，當通過靜脈注射方式移植BMSC時，細胞利用率低，僅不足15%的細胞能跨越微血管進入組織，且極易在微血管內形成細胞團塊，引起血栓及局部組織缺血。
為解決上述問題，科學家們將研究重點從細胞本身轉移至其分泌成分上，發現用BMSC細胞培養液中含有旁分泌因子的上清液進行持續性治療，可獲得與移植BMSC相同的治療效果，且未出現上述病理變化[7-8]。
1.2 BMSC的旁分泌作用
旁分泌是指細胞通過分泌趨化因子、生長因子、激素等影響鄰近的其它種類細胞的生物學行為[2]。BMSC可分泌多種旁分泌因子，包括白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor, IGF-1)、基質金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases, MMPs)等。這些旁分泌因子有助于調節血管內皮細胞的通透性，降低機體的炎性反應，促進組織修復及抑制細菌生長[9]。BMSC的旁分泌功能可因外界條件影響而發生改變，缺氧、營養供應不足及炎性因子的刺激等均可增強BMSC的旁分泌能力[10-11]。因此，在BMSC移植技術遇到困難時，BMSC旁分泌因子則顯現出其在炎性疾病及組織修復中的臨床應用潛能。
2 SAP治療進展
急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是臨床常見急腹癥，大部分為自限性傾向的輕型胰腺炎，其中約有20%的患者可轉化為SAP。SAP發展迅速，預后兇險，死亡率高達50%以上，通常以局部胰腺組織的壞死、膿腫及炎癥的全身蔓延[如系統性炎性反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)]為特征，并(或)伴以系統性多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，是導致患者死亡的主要原因[12]。SAP發病機制多樣，涉及到內毒素、微循環、炎性遞質和細胞因子連鎖反應等多個環節。近兩百年來，關于急性胰腺炎的發生、發展機制尚未完全闡明，對急性胰腺炎病情的控制及轉歸方面的研究更是鮮有進展。
目前臨床治療手段通常以使用生長抑素類藥物(如奧曲肽等)、激素(地塞米松，氫化可的松)并(或)聯合使用中藥，以抑制機體的炎性反應、清除體內毒素。但在幫助患者修復受損組織及恢復器官功能方面，仍缺乏有效措施，患者預后評估不甚理想。自20世紀80、90年代干細胞的研究興起以來，科學家們觀察到干細胞的出現是急性胰腺炎病理過程中的重要事件之一；BMSC可通過減弱炎癥反應及促進組織細胞的新生，參與到急性胰腺炎病情的控制及轉歸中。大量研究結果顯示，BMSC的注入可減輕胰腺壞死及炎性細胞浸潤，降低炎癥介質和細胞因子的表達水平[13-16]。研究者在SAP受損的胰腺組織及肺組織中觀察到BMSC可向損傷部位定向趨化移動，并在SAP誘發的受損器官中定植[17]。然而，當科學家用Cre-LoxP系統示蹤時卻發現，胰腺中新生的胰島等組織并非由這些“遠道而來”的BMSC分化而來，而是來源于導管細胞或胰島內原先即已存在的β細胞的自我復制[18-19]。既然如此，那么BMSC又為何要遷移至這些受損部位呢？除去其分化替代功能，BMSC又是通過什么樣的方式來發揮其抗炎、促新生作用的呢？新的研究發現，BMSC可遷移至受損部位，通過近距離分泌一些細胞因子、調節蛋白來減輕SAP大鼠的炎癥反應及相關臟器的損傷，BMSC的旁分泌功能可能在SAP治療中起著更重要的作用[2, 20]。
3 BMSC旁分泌因子治療SAP的作用基礎
BMSC的旁分泌因子可參與SAP炎癥的調控、血管內皮的修復及新生以及SAP相關的多器官損傷修復，具有治療SAP的作用基礎。
3.1 BMSC旁分泌因子的抑炎作用
炎性介質的大量釋放是SAP最重要的病理特征之一。BMSC分泌的多種抑炎因子可阻斷細胞炎性通路，降低核因子κ-B(nuclear factor kappa-B，NF-κB)的活性，從而減輕動物模型中的炎性應答反應。如BMSC可分泌IL-10、白介素-1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist, IL-1RA)及可溶性的腫瘤壞死因子受體1(soluble tumor necrosis factor receptor 1, sTNFR1)等多種抑炎因子。李德全等研究顯示，BMSC可分泌一些細胞因子及調節蛋白來抑制發生SAP時TOLL樣受體(TOLL like receptor，TLR)2、4的激活，或阻斷TLR 2、4與其下游炎癥因子之間的信號通路，也可能通過拮抗終末炎癥因子的生物效應間接下調TLR 2、4 mRNA表達，從而減輕患SAP大鼠的炎癥反應及相關組織損傷。此外，旁分泌因子還可以通過影響T細胞及樹突狀細胞(dendritic cell, DC)細胞的增殖與成熟來間接調控機體的炎癥反應[21-24]。
3.2 BMSC旁分泌因子促進血管新生與分化
在SAP中，大量炎性介質進入循環系統后，會導致SAP患者毛細血管通透性增高，大分子物質外滲，損傷血管內皮細胞，造成局部組織的微循環障礙。據報道，在炎性因子的刺激下，受損組織中釋放的SDF-1蛋白可通過與BMSC細胞上的CXCR4受體配對，募集BMSC細胞，并促進BMSC細胞分泌大量包括VEGF、成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor，FGF-2)、角細胞生長因子(keratinocyte growth factor，KGF)等在內的生長因子，這些細胞因子在促進血管新生與分化，保護及改善組織微循環狀況中起重要作用[25]。
3.3 BMSC旁分泌因子對減輕多器官損傷有效
在急性胰腺炎中，絕大多數患者死亡的原因是由其引發的多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，BMSC的旁分泌因子被證明可緩解多種SAP相關器官的損傷。如，SAP的死亡病例中有50%發生重度急性肺損傷(acute lung injury, ALI)，BMSC的旁分泌因子有助于調節血管內皮細胞及肺泡上皮細胞通透性，修復Ⅱ型肺泡上皮細胞及小導管上皮細胞的損傷[7]。Ionescu等[8]將BMSC的條件培養上清液注射入ALI小鼠模型中，發現小鼠的嗜中性粒細胞浸潤，肺水腫及肺損傷程度均得以減輕，且注射BMSC培養上清的效果與直接注射BMSC的效果相當。另外，在急性腎損傷模型中發現，BMSC的修復能力可隨其分泌因子的增加而增強，BMSC的培養上清可減輕由慶大霉素誘導的腎損傷[26-27]。這些研究結果均提示, BMSC并沒有直接分化替代損傷組織, 而是可能通過旁分泌的眾多因子促進及調節受損組織的修復。
4 問題與展望
研究結果顯示，BMSC可通過分泌多種細胞因子和調節蛋白來發揮在SAP治療中的抗炎、促新生等作用，而這些細胞因子和調節蛋白正是BMSC旁分泌因子的成員。因此，挖掘BMSC旁分泌因子在SAP臨床治療中的潛能，將研究重心轉移到利用這些旁分泌因子上來，將成為SAP治療的新方向。注射含旁分泌因子的BMSC培養上清液有望成為未來SAP細胞治療的新策略。
然而，作為一種新興的治療方式，在其具體的實施過程中仍不可避免地面臨一些問題。例如，BMSC在體外進行平面培養或多次傳代后，其生物特性及旁分泌能力會發生改變[5, 28]，如何在體外擴大培養的過程中保持BMSC的生物學特性并增加其旁分泌功能將是后期研究需要關注的方向。對細胞進行預刺激及使用大孔徑的纖維膜生物反應器有望成為該方向的突破口[29-30]。此外，在使用BMSC旁分泌因子進行治療時給藥劑量及給藥途徑如何確定，以及短期及長期的臨床安全性如何評估等也需要進一步探索。
引言
重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是外科常見急腹癥，起病驟，預后差，死亡率高，在幫助患者修復受損組織及恢復器官功能方面尚無有效措施。骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC)因具有多向分化潛能、來源方便等優點，成為治療SAP的熱點。然而在臨床應用中，BMSC移植治療的方式卻遇到了諸多技術及倫理問題，如患者腫瘤、血栓形成的風險加大，異質性組織的形成等。近年來，科學家發現BMSC的旁分泌因子具有與BMSC移植同樣的治療效果，且可減少上述生物安全問題，具有更安全、更易操控的治療優勢[1-2]。在此，本文將針對BMSC旁分泌因子在SAP治療中的潛能作一綜述。
1 BMSC及其旁分泌作用
1.1 BMSC
自1987年，Friedenstein等首次發現并培養出BMSC后，BMSC因具有多向分化潛能、可參與免疫調節、促進效應細胞定位及歸巢等特點，迅速在包括心臟、胰腺及腎臟等在內的多種組織器官的再生中得到研究和應用，甚至在急性肺損傷、骨組織工程及腦出血等疾病中已進入臨床試驗階段[3-4]。然而，隨著這些基礎研究的成果逐步向臨床應用轉化，BMSC移植的細胞治療方式在實際操作中顯現出了諸多問題：
首先，BMSC作為活細胞被移植入人體以后，其在體內的增殖數量與頻率往往不可控，而細胞的增殖數量通常與臟器的功能密切相關(如心肌細胞與血管內皮細胞的過度增殖會影響心臟功能等)。
其二，BMSC進入體內后，暴露于免疫細胞及體內其他可溶性物質的作用下，在這種特定的微環境中，BMSC的生物學行為很可能會改變，不向預期的方向發展。如細胞突變后引起腫瘤的風險加大，在臟器中形成異質性組織(已發現在心肌中產生骨組織，在腎臟中形成脂肪組織)等[5-6]。
其三，當通過靜脈注射方式移植BMSC時，細胞利用率低，僅不足15%的細胞能跨越微血管進入組織，且極易在微血管內形成細胞團塊，引起血栓及局部組織缺血。
為解決上述問題，科學家們將研究重點從細胞本身轉移至其分泌成分上，發現用BMSC細胞培養液中含有旁分泌因子的上清液進行持續性治療，可獲得與移植BMSC相同的治療效果，且未出現上述病理變化[7-8]。
1.2 BMSC的旁分泌作用
旁分泌是指細胞通過分泌趨化因子、生長因子、激素等影響鄰近的其它種類細胞的生物學行為[2]。BMSC可分泌多種旁分泌因子，包括白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor, IGF-1)、基質金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases, MMPs)等。這些旁分泌因子有助于調節血管內皮細胞的通透性，降低機體的炎性反應，促進組織修復及抑制細菌生長[9]。BMSC的旁分泌功能可因外界條件影響而發生改變，缺氧、營養供應不足及炎性因子的刺激等均可增強BMSC的旁分泌能力[10-11]。因此，在BMSC移植技術遇到困難時，BMSC旁分泌因子則顯現出其在炎性疾病及組織修復中的臨床應用潛能。
2 SAP治療進展
急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是臨床常見急腹癥，大部分為自限性傾向的輕型胰腺炎，其中約有20%的患者可轉化為SAP。SAP發展迅速，預后兇險，死亡率高達50%以上，通常以局部胰腺組織的壞死、膿腫及炎癥的全身蔓延[如系統性炎性反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)]為特征，并(或)伴以系統性多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，是導致患者死亡的主要原因[12]。SAP發病機制多樣，涉及到內毒素、微循環、炎性遞質和細胞因子連鎖反應等多個環節。近兩百年來，關于急性胰腺炎的發生、發展機制尚未完全闡明，對急性胰腺炎病情的控制及轉歸方面的研究更是鮮有進展。
目前臨床治療手段通常以使用生長抑素類藥物(如奧曲肽等)、激素(地塞米松，氫化可的松)并(或)聯合使用中藥，以抑制機體的炎性反應、清除體內毒素。但在幫助患者修復受損組織及恢復器官功能方面，仍缺乏有效措施，患者預后評估不甚理想。自20世紀80、90年代干細胞的研究興起以來，科學家們觀察到干細胞的出現是急性胰腺炎病理過程中的重要事件之一；BMSC可通過減弱炎癥反應及促進組織細胞的新生，參與到急性胰腺炎病情的控制及轉歸中。大量研究結果顯示，BMSC的注入可減輕胰腺壞死及炎性細胞浸潤，降低炎癥介質和細胞因子的表達水平[13-16]。研究者在SAP受損的胰腺組織及肺組織中觀察到BMSC可向損傷部位定向趨化移動，并在SAP誘發的受損器官中定植[17]。然而，當科學家用Cre-LoxP系統示蹤時卻發現，胰腺中新生的胰島等組織并非由這些“遠道而來”的BMSC分化而來，而是來源于導管細胞或胰島內原先即已存在的β細胞的自我復制[18-19]。既然如此，那么BMSC又為何要遷移至這些受損部位呢？除去其分化替代功能，BMSC又是通過什么樣的方式來發揮其抗炎、促新生作用的呢？新的研究發現，BMSC可遷移至受損部位，通過近距離分泌一些細胞因子、調節蛋白來減輕SAP大鼠的炎癥反應及相關臟器的損傷，BMSC的旁分泌功能可能在SAP治療中起著更重要的作用[2, 20]。
3 BMSC旁分泌因子治療SAP的作用基礎
BMSC的旁分泌因子可參與SAP炎癥的調控、血管內皮的修復及新生以及SAP相關的多器官損傷修復，具有治療SAP的作用基礎。
3.1 BMSC旁分泌因子的抑炎作用
炎性介質的大量釋放是SAP最重要的病理特征之一。BMSC分泌的多種抑炎因子可阻斷細胞炎性通路，降低核因子κ-B(nuclear factor kappa-B，NF-κB)的活性，從而減輕動物模型中的炎性應答反應。如BMSC可分泌IL-10、白介素-1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist, IL-1RA)及可溶性的腫瘤壞死因子受體1(soluble tumor necrosis factor receptor 1, sTNFR1)等多種抑炎因子。李德全等研究顯示，BMSC可分泌一些細胞因子及調節蛋白來抑制發生SAP時TOLL樣受體(TOLL like receptor，TLR)2、4的激活，或阻斷TLR 2、4與其下游炎癥因子之間的信號通路，也可能通過拮抗終末炎癥因子的生物效應間接下調TLR 2、4 mRNA表達，從而減輕患SAP大鼠的炎癥反應及相關組織損傷。此外，旁分泌因子還可以通過影響T細胞及樹突狀細胞(dendritic cell, DC)細胞的增殖與成熟來間接調控機體的炎癥反應[21-24]。
3.2 BMSC旁分泌因子促進血管新生與分化
在SAP中，大量炎性介質進入循環系統后，會導致SAP患者毛細血管通透性增高，大分子物質外滲，損傷血管內皮細胞，造成局部組織的微循環障礙。據報道，在炎性因子的刺激下，受損組織中釋放的SDF-1蛋白可通過與BMSC細胞上的CXCR4受體配對，募集BMSC細胞，并促進BMSC細胞分泌大量包括VEGF、成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor，FGF-2)、角細胞生長因子(keratinocyte growth factor，KGF)等在內的生長因子，這些細胞因子在促進血管新生與分化，保護及改善組織微循環狀況中起重要作用[25]。
3.3 BMSC旁分泌因子對減輕多器官損傷有效
在急性胰腺炎中，絕大多數患者死亡的原因是由其引發的多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，BMSC的旁分泌因子被證明可緩解多種SAP相關器官的損傷。如，SAP的死亡病例中有50%發生重度急性肺損傷(acute lung injury, ALI)，BMSC的旁分泌因子有助于調節血管內皮細胞及肺泡上皮細胞通透性，修復Ⅱ型肺泡上皮細胞及小導管上皮細胞的損傷[7]。Ionescu等[8]將BMSC的條件培養上清液注射入ALI小鼠模型中，發現小鼠的嗜中性粒細胞浸潤，肺水腫及肺損傷程度均得以減輕，且注射BMSC培養上清的效果與直接注射BMSC的效果相當。另外，在急性腎損傷模型中發現，BMSC的修復能力可隨其分泌因子的增加而增強，BMSC的培養上清可減輕由慶大霉素誘導的腎損傷[26-27]。這些研究結果均提示, BMSC并沒有直接分化替代損傷組織, 而是可能通過旁分泌的眾多因子促進及調節受損組織的修復。
4 問題與展望
研究結果顯示，BMSC可通過分泌多種細胞因子和調節蛋白來發揮在SAP治療中的抗炎、促新生等作用，而這些細胞因子和調節蛋白正是BMSC旁分泌因子的成員。因此，挖掘BMSC旁分泌因子在SAP臨床治療中的潛能，將研究重心轉移到利用這些旁分泌因子上來，將成為SAP治療的新方向。注射含旁分泌因子的BMSC培養上清液有望成為未來SAP細胞治療的新策略。
然而，作為一種新興的治療方式，在其具體的實施過程中仍不可避免地面臨一些問題。例如，BMSC在體外進行平面培養或多次傳代后，其生物特性及旁分泌能力會發生改變[5, 28]，如何在體外擴大培養的過程中保持BMSC的生物學特性并增加其旁分泌功能將是后期研究需要關注的方向。對細胞進行預刺激及使用大孔徑的纖維膜生物反應器有望成為該方向的突破口[29-30]。此外，在使用BMSC旁分泌因子進行治療時給藥劑量及給藥途徑如何確定，以及短期及長期的臨床安全性如何評估等也需要進一步探索。