研究頻率為50 Hz不同強度正弦交變電磁場(SEMFs)對大鼠峰值骨量(PBM)的影響, 為電磁場臨床試驗提供理論依據。將30只6周齡SD實驗大鼠隨機分為3組(n=10), 對照組、0.1 mT磁場組和0.6 mT磁場組。磁場組分別給予不同強度磁場干預3 h/d、8周后, 檢測骨密度(BMD)、生物力學、血清骨鈣素(OC)和血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)以及以stevenol藍品紅苦味酸染色(VG)進行骨形態分析。實驗結果表明, 0.1 mT磁場組大鼠全身骨密度、股骨、椎骨骨密度和股骨最大載荷顯著高于對照組(P＜0.01), 股骨和椎骨屈服強度及血清生化指標顯著優于對照組(P＜0.05), 骨小梁寬度、骨小梁數目均有增加, 骨小梁間隙減小。0.6 mT組與對照組相比, 差異無統計意義(P＞0.05)。說明50 Hz 0.1 mT電磁場能增加SD大鼠骨密度, 改善骨組織微結構, 增強骨強度, 從而提高大鼠的峰值骨量。
引用本文： 高玉海, 成魁, 葛寶豐, 甄平, 周建, 馬小妮, 李少峰, 陳克明. 50Hz不同強度正弦交變電磁場對大鼠峰值骨量的影響. 生物醫學工程學雜志, 2016, 32(1): 116-119. doi: 10.7507/1001-5515.20150021 復制
引言
隨著人口老齡化，骨質疏松癥(osteoporosis, OP)已成為一個重要的公共衛生問題而被人們所重視，越來越多骨質疏松癥患者的出現對社會經濟影響也將進一步加大[1]。骨質疏松癥是一種常見的骨骼疾病，其特征是全身骨量減少、骨的微結構退化，容易導致脆性骨折，由峰值骨量(peak bone mass, PBM)和年齡增長相關的骨量丟失兩方面決定[2-3]。峰值骨量是骨成熟末期達到的最大骨量，是骨最堅硬、骨礦含量最高的時期[4]。青少年峰值骨量值的高低對老年時的骨量至關重要, 是決定老年期是否發展為骨質疏松癥的重要因素[5]。高峰值骨量不易罹患骨質疏松，因此提高峰值骨量是預防骨質疏松發生的途徑。低頻電磁場可通過改善骨小梁結構、促進骨形成來提高峰值骨量，從預防的角度治療骨質疏松癥[6-7]。本實驗通過電磁治療儀對SD大鼠進行磁場干預，通過對大鼠骨密度(bone mineral densities, BMD)和骨量的檢測，評價其對大鼠峰值骨量的影響，以進一步證明其對骨質疏松的防治作用。
1 材料與方法
1.1 實驗儀器與材料
水合氯醛(天津大茂化學試劑公司，中國)，雙能X射線骨密度儀(GE公司，美國)，AG-X系列臺式電子萬能試驗機(島津公司，日本)，酶標儀(BioTek公司，美國)，血清骨鈣素(osteocalcin, OC)試劑盒(上海研吉公司，中國)，血清抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒(IDS ltd公司，英國)，正置相差顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)，Technovit?9100樹脂包埋試劑盒(Heraeus Kulzer GmbH & Co.KG，德國)，SP1600硬組織切片機(LEICA公司，德國)。
1.2 動物分組及處理
6周齡SPF級雌性SD大鼠30只(由甘肅中醫學院動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(甘)2011-0001，體重(130±10)g。將大鼠隨機分為對照組、0.1 mT組和0.6 mT組，每組10只。分別給予50 Hz 0.1 mT的磁場強度和50 Hz 0.6 mT的磁場強度干預，兩組磁場干預時間均為3 h/d，干預時間為每天9∶00～15∶00。飼養溫度(22±2)℃，濕度60%～70%，飲用水為自來水，標準類飼料，不限制飲水和食量。每周測定一次大鼠體重。
所有大鼠在實驗開始前馴化一周，隨機安置在塑料筐內。磁場干預8周，檢測全身骨密度后處死。
1.3 正弦交變磁場發生儀
實驗所用磁場發生儀由本實驗組研制，線圈內徑為120 mm，頻率范圍為0～50 Hz，磁感應強度0～8 mT精確可調，時間自由設定。經中國人民解放軍蘭州軍區醫學計量測試研究站測定表明，磁場發生儀運行期間磁場環境均勻穩定，報告編號：醫計磁字ccqd.2008-01。
1.4 骨密度檢測
連續8周磁場干預后，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，雙能X射線骨密度儀檢測全身骨密度。大鼠處死后，立即檢測右側股骨骨密度后，迅速用0.9%NaCl浸泡過的紗布包裹保存于-20℃冰箱；同時檢測每組大鼠椎骨骨密度后，迅速用0.9%NaCl浸泡過的紗布包裹保存-20℃冰箱。
1.5 骨生物力學檢測
將保存于-20℃冰箱中的股骨和椎骨放在常溫下24 h自然解凍。將股骨置于電子萬能試驗機進行三點彎曲實驗，跨距17 mm，速度10 mm/min，椎骨進行壓縮實驗，記錄載荷變形曲線，應用C語言編程處理載荷變形曲線得出骨生物力學指標值，包括最大載荷、最大位移、彈性模量。
1.6 血清生化指標測定
大鼠心臟取血，5 000 rad/min離心15 min，血清，-80℃保存；ELISA法試劑盒測定OC和大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate-resistant acid phosphatase 5b, TRACP 5b)。標準曲線制備及樣品測定方法按說明書操作；分別于酶標儀上450 nm處和405 nm處測定OD值，并通過標準曲線計算每孔中OC和TRACP 5b的量。
1.7 骨形態計量分析
將股骨和脛骨用Technovit?9100樹脂包埋試劑盒包埋，再用LEICA SP1600骨切片機切片，厚度為50μm，切片后用502膠水封固，封固后用1 200～2 000目砂紙打磨，然后進行品紅苦味酸(van gieson，VG)染色，顯微鏡下觀察骨組織形態。
1.8 統計學分析
統計分析均采用SPSS 16.0軟件完成，所有檢測數據均用均數±標準差(±s)，不同組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較用LSD檢驗法。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 磁場對大鼠體重的影響
如圖 1所示，0.1 mT組、0.6 mT組與對照組相比，差異均無統計學意義(P＞0.05)。說明磁場干預對體重無明顯的影響。
圖1
大鼠體重測定結果
Figure1.
Measured results of body weight of rats
2.2 磁場對大鼠骨密度的影響
如表 1所示，0.1 mT組大鼠的全身骨密度、股骨骨密度和椎骨骨密度與對照組比較差異均有統計學意義，說明0.1 mT磁場強度對大鼠骨密度有影響；0.6 mT組大鼠的全身骨密度、股骨骨密度和椎骨骨密度與對照組比較差異無統計學意義，說明0.6 mT磁場強度對大鼠骨密度無影響。證明50 Hz 0.1 mT磁場強度能增加大鼠峰值骨密度。
表1
不同磁場強度對大鼠全身骨密度、股骨骨密度和椎骨骨密度的影響結果(2.3 磁場對大鼠骨生物力學的影響
如表 2所示，0.1 mT組大鼠與對照組相比，最大載荷和屈服強度的差異均有統計學意義。0.6 mT組干預的SD實驗大鼠與對照組比較，股骨與椎骨的各項生物力學性能差異均無統計學意義。說明0.1 mT磁場強度干預增加SD大鼠股骨和椎骨的材料力學和結構力學的性能，提高骨強度。
表2
不同磁場強度下生物力學參數比較(2.4 磁場對大鼠血生化指標的影響
如表 3所示，0.1 mT組血清中OC含量明顯高于對照組，而TRACP 5b明顯低于對照組，0.6 mT組則與對照組未見明顯差異。說明50 Hz 0.1 mT磁場強度的SEMFs可促進OC的分泌，有降低TRACP 5b的分泌的趨勢。
表3
電磁場對大鼠血清OC和TRACP 5b的影響
Table3.
Effects of electromagnetic fields on OC and TRACP 5b of serum
2.5 骨形態計量分析
如圖 2所示，0.1 mT組骨小梁數量和厚度明顯高于對照組，而骨小梁分離度則低于對照組；0.6 mT組則無明顯差異。50 Hz 0.1 mT磁場強度的SEMFs在骨組織微結構方面影響了大鼠的峰值骨量。
圖2
脛骨組織形態的觀察
Figure2.
Tibia bone tissue morphology
3 討論
自從1954年Yasuda等發現骨的壓電效應后電磁場治療骨質疏松及相關骨病的研究不斷得到重視，但由于目前采用的磁場參數各不相同，導致研究存在分歧[8-9]。本研究所選參數是根據本實驗室周建等[10]在細胞水平實驗篩選的最佳的磁場參數組合50 Hz 0.1 mT和0.6 mT SEMFs，研究其對大鼠峰值骨量的影響，以期篩選出最佳的磁場強度參數，為將磁場應用于骨質疏松臨床治療提供最佳參數。
骨量減少是危害骨性能的一個重要的因素，會導致骨強度的降低和骨脆性增加。而提高骨量后，骨強度提高，骨折不易發生[11]。骨密度是評價骨強度判斷的指標，通過檢測骨密度，能準確地預測發生骨折的風險，是確定骨質疏松癥最基本的依據。本實驗研究發現，50 Hz 0.1 mT電磁場增加了SD大鼠的峰值骨密度。50 Hz 0.6 mT磁場強度干預后，并沒有表現出與對照組顯著的差異性，而在前期本實驗室電磁場作用于成骨細胞后對成骨細胞增殖與分化以及骨形成相關基因的表達中都有明顯增加，說明電磁場作用于細胞和動物實驗存在差異性。
骨強度與骨密度、骨微結構和連結性、礦化作用有關。骨的整體性質是由骨的微結構、幾何形態和材料力學性能決定的[12]。同時骨的幾何形態又決定了骨的結構力學特性，而骨的微細結構決定了骨的材料力學性能。骨生物力學研究結果顯示為骨結構力學和材料力學的性能。骨生物力學參數可較直接地反映骨的抗骨折能力，骨生物力學性能的改善是評定某些治療手段有效性的客觀依據。骨質疏松研究領域常用的結構力學指標主要有：最大載荷等，可反映骨的整體抗骨折能力；材料力學指標有：彈性模量等，性能不受骨形狀大小的影響，反映骨的自身強度和韌性，與骨骼中礦物質含量和骨密度有關。在股骨三點彎曲實驗中，0.1 mT組的最大載荷和屈服強度明顯高于對照，反映出50 Hz 0.1 mT磁場強度增強生物力學性能的作用。
本實驗分析骨組織的靜態微結構后發現，0.1 mT磁場組大鼠骨小梁數量和骨小梁厚度明顯增加，而骨小梁分離度明顯降低，從磁場改變骨組織微結構方面進一步說明了磁場影響SD大鼠峰值骨量，表明電磁場對大鼠的股骨骨小梁起到改建的作用，能有效的改善骨微結構。從而進一步支持和印證了電磁場對骨密度的影響。而生化指標反映體內骨代謝，評價骨轉換率，客觀地反映了大鼠的骨吸收和骨形成。實驗證明，50 Hz 0.1 mT能提高血清中與成骨細胞增殖與分化有關的因子：OC，從而促進了骨形成，同時，存在降低血清中破骨細胞相關的因子：TRACP 5b活性的趨勢。但是，由于處死樣本存在血清收集不全，小樣本分析的現象，此結果仍需在后續實驗中得到驗證。總體而言，結果與骨密度指標和骨生物力學指標一致。表明50 Hz 0.1 mT通過提高骨形成的指標，可能降低骨吸收的指標，增加了骨密度，提高骨的力學性能。提示50 Hz 0.1 mT具有提高大鼠的骨量和骨強度的能力，進而證明其能起到預防骨質疏松癥骨折發生的作用。
本實驗證明50 Hz 0.1 mT磁場強度的參數組合提高了大鼠的峰值骨量，可能實現降低骨質疏松發生的機率，為預防和治療骨質疏松癥提供一種安全、簡單的選擇。然而，電磁場的時間效應與峰值骨量的作用機理等一系列問題仍需去探索，同時篩選最有效的參數仍是亟待解決的問題。
引言
隨著人口老齡化，骨質疏松癥(osteoporosis, OP)已成為一個重要的公共衛生問題而被人們所重視，越來越多骨質疏松癥患者的出現對社會經濟影響也將進一步加大[1]。骨質疏松癥是一種常見的骨骼疾病，其特征是全身骨量減少、骨的微結構退化，容易導致脆性骨折，由峰值骨量(peak bone mass, PBM)和年齡增長相關的骨量丟失兩方面決定[2-3]。峰值骨量是骨成熟末期達到的最大骨量，是骨最堅硬、骨礦含量最高的時期[4]。青少年峰值骨量值的高低對老年時的骨量至關重要, 是決定老年期是否發展為骨質疏松癥的重要因素[5]。高峰值骨量不易罹患骨質疏松，因此提高峰值骨量是預防骨質疏松發生的途徑。低頻電磁場可通過改善骨小梁結構、促進骨形成來提高峰值骨量，從預防的角度治療骨質疏松癥[6-7]。本實驗通過電磁治療儀對SD大鼠進行磁場干預，通過對大鼠骨密度(bone mineral densities, BMD)和骨量的檢測，評價其對大鼠峰值骨量的影響，以進一步證明其對骨質疏松的防治作用。
1 材料與方法
1.1 實驗儀器與材料
水合氯醛(天津大茂化學試劑公司，中國)，雙能X射線骨密度儀(GE公司，美國)，AG-X系列臺式電子萬能試驗機(島津公司，日本)，酶標儀(BioTek公司，美國)，血清骨鈣素(osteocalcin, OC)試劑盒(上海研吉公司，中國)，血清抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒(IDS ltd公司，英國)，正置相差顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)，Technovit?9100樹脂包埋試劑盒(Heraeus Kulzer GmbH & Co.KG，德國)，SP1600硬組織切片機(LEICA公司，德國)。
1.2 動物分組及處理
6周齡SPF級雌性SD大鼠30只(由甘肅中醫學院動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(甘)2011-0001，體重(130±10)g。將大鼠隨機分為對照組、0.1 mT組和0.6 mT組，每組10只。分別給予50 Hz 0.1 mT的磁場強度和50 Hz 0.6 mT的磁場強度干預，兩組磁場干預時間均為3 h/d，干預時間為每天9∶00～15∶00。飼養溫度(22±2)℃，濕度60%～70%，飲用水為自來水，標準類飼料，不限制飲水和食量。每周測定一次大鼠體重。
所有大鼠在實驗開始前馴化一周，隨機安置在塑料筐內。磁場干預8周，檢測全身骨密度后處死。
1.3 正弦交變磁場發生儀
實驗所用磁場發生儀由本實驗組研制，線圈內徑為120 mm，頻率范圍為0～50 Hz，磁感應強度0～8 mT精確可調，時間自由設定。經中國人民解放軍蘭州軍區醫學計量測試研究站測定表明，磁場發生儀運行期間磁場環境均勻穩定，報告編號：醫計磁字ccqd.2008-01。
1.4 骨密度檢測
連續8周磁場干預后，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，雙能X射線骨密度儀檢測全身骨密度。大鼠處死后，立即檢測右側股骨骨密度后，迅速用0.9%NaCl浸泡過的紗布包裹保存于-20℃冰箱；同時檢測每組大鼠椎骨骨密度后，迅速用0.9%NaCl浸泡過的紗布包裹保存-20℃冰箱。
1.5 骨生物力學檢測
將保存于-20℃冰箱中的股骨和椎骨放在常溫下24 h自然解凍。將股骨置于電子萬能試驗機進行三點彎曲實驗，跨距17 mm，速度10 mm/min，椎骨進行壓縮實驗，記錄載荷變形曲線，應用C語言編程處理載荷變形曲線得出骨生物力學指標值，包括最大載荷、最大位移、彈性模量。
1.6 血清生化指標測定
大鼠心臟取血，5 000 rad/min離心15 min，血清，-80℃保存；ELISA法試劑盒測定OC和大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate-resistant acid phosphatase 5b, TRACP 5b)。標準曲線制備及樣品測定方法按說明書操作；分別于酶標儀上450 nm處和405 nm處測定OD值，并通過標準曲線計算每孔中OC和TRACP 5b的量。
1.7 骨形態計量分析
將股骨和脛骨用Technovit?9100樹脂包埋試劑盒包埋，再用LEICA SP1600骨切片機切片，厚度為50μm，切片后用502膠水封固，封固后用1 200～2 000目砂紙打磨，然后進行品紅苦味酸(van gieson，VG)染色，顯微鏡下觀察骨組織形態。
1.8 統計學分析
統計分析均采用SPSS 16.0軟件完成，所有檢測數據均用均數±標準差(±s)，不同組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較用LSD檢驗法。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 磁場對大鼠體重的影響
如圖 1所示，0.1 mT組、0.6 mT組與對照組相比，差異均無統計學意義(P＞0.05)。說明磁場干預對體重無明顯的影響。
圖1
大鼠體重測定結果
Figure1.
Measured results of body weight of rats
2.2 磁場對大鼠骨密度的影響
如表 1所示，0.1 mT組大鼠的全身骨密度、股骨骨密度和椎骨骨密度與對照組比較差異均有統計學意義，說明0.1 mT磁場強度對大鼠骨密度有影響；0.6 mT組大鼠的全身骨密度、股骨骨密度和椎骨骨密度與對照組比較差異無統計學意義，說明0.6 mT磁場強度對大鼠骨密度無影響。證明50 Hz 0.1 mT磁場強度能增加大鼠峰值骨密度。
表1
不同磁場強度對大鼠全身骨密度、股骨骨密度和椎骨骨密度的影響結果(2.3 磁場對大鼠骨生物力學的影響
如表 2所示，0.1 mT組大鼠與對照組相比，最大載荷和屈服強度的差異均有統計學意義。0.6 mT組干預的SD實驗大鼠與對照組比較，股骨與椎骨的各項生物力學性能差異均無統計學意義。說明0.1 mT磁場強度干預增加SD大鼠股骨和椎骨的材料力學和結構力學的性能，提高骨強度。
表2
不同磁場強度下生物力學參數比較(2.4 磁場對大鼠血生化指標的影響
如表 3所示，0.1 mT組血清中OC含量明顯高于對照組，而TRACP 5b明顯低于對照組，0.6 mT組則與對照組未見明顯差異。說明50 Hz 0.1 mT磁場強度的SEMFs可促進OC的分泌，有降低TRACP 5b的分泌的趨勢。
表3
電磁場對大鼠血清OC和TRACP 5b的影響
Table3.
Effects of electromagnetic fields on OC and TRACP 5b of serum
2.5 骨形態計量分析
如圖 2所示，0.1 mT組骨小梁數量和厚度明顯高于對照組，而骨小梁分離度則低于對照組；0.6 mT組則無明顯差異。50 Hz 0.1 mT磁場強度的SEMFs在骨組織微結構方面影響了大鼠的峰值骨量。
圖2
脛骨組織形態的觀察
Figure2.
Tibia bone tissue morphology
3 討論
自從1954年Yasuda等發現骨的壓電效應后電磁場治療骨質疏松及相關骨病的研究不斷得到重視，但由于目前采用的磁場參數各不相同，導致研究存在分歧[8-9]。本研究所選參數是根據本實驗室周建等[10]在細胞水平實驗篩選的最佳的磁場參數組合50 Hz 0.1 mT和0.6 mT SEMFs，研究其對大鼠峰值骨量的影響，以期篩選出最佳的磁場強度參數，為將磁場應用于骨質疏松臨床治療提供最佳參數。
骨量減少是危害骨性能的一個重要的因素，會導致骨強度的降低和骨脆性增加。而提高骨量后，骨強度提高，骨折不易發生[11]。骨密度是評價骨強度判斷的指標，通過檢測骨密度，能準確地預測發生骨折的風險，是確定骨質疏松癥最基本的依據。本實驗研究發現，50 Hz 0.1 mT電磁場增加了SD大鼠的峰值骨密度。50 Hz 0.6 mT磁場強度干預后，并沒有表現出與對照組顯著的差異性，而在前期本實驗室電磁場作用于成骨細胞后對成骨細胞增殖與分化以及骨形成相關基因的表達中都有明顯增加，說明電磁場作用于細胞和動物實驗存在差異性。
骨強度與骨密度、骨微結構和連結性、礦化作用有關。骨的整體性質是由骨的微結構、幾何形態和材料力學性能決定的[12]。同時骨的幾何形態又決定了骨的結構力學特性，而骨的微細結構決定了骨的材料力學性能。骨生物力學研究結果顯示為骨結構力學和材料力學的性能。骨生物力學參數可較直接地反映骨的抗骨折能力，骨生物力學性能的改善是評定某些治療手段有效性的客觀依據。骨質疏松研究領域常用的結構力學指標主要有：最大載荷等，可反映骨的整體抗骨折能力；材料力學指標有：彈性模量等，性能不受骨形狀大小的影響，反映骨的自身強度和韌性，與骨骼中礦物質含量和骨密度有關。在股骨三點彎曲實驗中，0.1 mT組的最大載荷和屈服強度明顯高于對照，反映出50 Hz 0.1 mT磁場強度增強生物力學性能的作用。
本實驗分析骨組織的靜態微結構后發現，0.1 mT磁場組大鼠骨小梁數量和骨小梁厚度明顯增加，而骨小梁分離度明顯降低，從磁場改變骨組織微結構方面進一步說明了磁場影響SD大鼠峰值骨量，表明電磁場對大鼠的股骨骨小梁起到改建的作用，能有效的改善骨微結構。從而進一步支持和印證了電磁場對骨密度的影響。而生化指標反映體內骨代謝，評價骨轉換率，客觀地反映了大鼠的骨吸收和骨形成。實驗證明，50 Hz 0.1 mT能提高血清中與成骨細胞增殖與分化有關的因子：OC，從而促進了骨形成，同時，存在降低血清中破骨細胞相關的因子：TRACP 5b活性的趨勢。但是，由于處死樣本存在血清收集不全，小樣本分析的現象，此結果仍需在后續實驗中得到驗證。總體而言，結果與骨密度指標和骨生物力學指標一致。表明50 Hz 0.1 mT通過提高骨形成的指標，可能降低骨吸收的指標，增加了骨密度，提高骨的力學性能。提示50 Hz 0.1 mT具有提高大鼠的骨量和骨強度的能力，進而證明其能起到預防骨質疏松癥骨折發生的作用。
本實驗證明50 Hz 0.1 mT磁場強度的參數組合提高了大鼠的峰值骨量，可能實現降低骨質疏松發生的機率，為預防和治療骨質疏松癥提供一種安全、簡單的選擇。然而，電磁場的時間效應與峰值骨量的作用機理等一系列問題仍需去探索，同時篩選最有效的參數仍是亟待解決的問題。
