茜草對骨骼具有紅染效果, 但不知道采食茜草是否會改變骨生物力學性能和骨中無機質的含量。因此, 本文建立茜草飼喂大鼠的動物模型, 采用萬能材料力學檢測儀、電感耦合等離子質譜和光譜儀檢測大鼠股骨的生物力學性能和骨中無機質的含量, 并應用高效液相色譜分析骨中紅色物質。其結果發現:飼喂茜草6個月后, 10%和15%組大鼠股骨骨干生物力學性能參數值顯著高于對照組; 骨中鈣、鎂和鋅的含量顯著高于對照組大鼠; 但15%組大鼠腎臟淤血和充血, 血液中尿素氮和肌酐含量與對照組大鼠之間差異顯著; 經分析得出大鼠骨骼中的紅色物質是一種類茜草素的物質。以上結果說明:飼喂茜草6個月后, 日糧中10%含量的茜草對大鼠無毒性, 并能加強大鼠骨骼生物力學性能和增加骨中無機質的含量。
引用本文： 吳晨晨, 楊小雯, 王文龍, 王姍姍, 曹丹丹, 馬烽, 王建國, 路浩, 趙寶玉. 茜草對大鼠骨骼生物力學性能的影響. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(1): 110-115. doi: 10.7507/1001-5515.20150020 復制
引言
茜草是野生植物，主要分布在我國西南和亞洲中部以及地中海地區。早在公元前三世紀，茜草曾用作衣料和羊毛等編織物的染料。動物飼喂茜草后，生長的骨骼被染成特殊的顏色[1]。茜草根中含有蒽醌類物質(Rubia tinctorum L)，具有許多不同的生物學活性，如抗氧化劑、抗微生物、抗真菌、細胞毒性、殺滅寄生蟲幼蟲和抗病毒活性[2]。茜草也作為中草藥用于治療黃疸、坐骨神經痛和癱瘓[3]。茜草素紅還可以在體外抑制HIV-1蛋白酶，并且在體內也表現出很多優點[4]。茜草最重要的作用就是作為天然的植物染料。茜草主要含有茜草素、紅紫素和偽羥基茜草素，這些染料可以有效地結合骨中的鈣離子[5]。然而，采食茜草對骨的生長的影響眾說紛紜。有的認為茜草可能延遲鼠牙齒和骨的生長，或者是短暫停止骨的生長[6]。狗飼喂茜草素的劑量超過40 mg/kg，抑制骨的形成，飼喂同等劑量的茜草素紅S也有類似的作用。高劑量的茜草，可使血壓快速降低，心率增加并發呼吸困難[7]。為進一步驗證茜草對骨骼礦物質沉積和生物力學的影響，本實驗在大鼠日糧中添加不同劑量的茜草，并在飼喂茜草后第0.5、1、3和6個月觀測大鼠的股骨干礦物質含量和骨生物力學性能的變化。
1 材料與方法
1.1 儀器
7500型八級桿反應池系統電感耦合等離子質譜儀(ICP-MS)(美國Agilent公司)；Triton X-100(Sigma公司)；電感耦合等離子體原子發射光譜儀(ICP=OES)(美國Agilent公司)；高效液相色譜儀(Thermo ACCELA system，美國)；全自動生化分析儀檢測(Beckman Synchron CX7 Delta Chemistry Analyzers，美國)。
1.2 茜草的制備和試驗動物的飼喂以及分組
中草藥茜草根購于云南省昆明市中國傳統中醫藥商店。所購得的茜草根部經粉碎機粉碎，由200目篩子過濾，得到茜草粉末。
1月齡80只大鼠購自西安交通大學實驗動物中心，隨機分成4組，每組20只大鼠，大鼠顆粒日糧中分別添加0%(對照組)、5%(5%組)、10%(10%組)和15%(15%組)的茜草粉末，所制備的日糧營養成分符合大鼠日糧標準。
飼喂茜草后0.5、1、3和6個月，每個時間點每組處死5只大鼠。應用乙醚麻醉，取大鼠心、肝、脾、胃、腎、小腸和胰臟，10%福爾馬林固定；采集雙側股骨和血液，右側股骨用于生物力學和礦物質檢測，左側股骨用于骨中紅色物質分析，血液用于檢測生化指標。
1.3 病理組織學分析
每組大鼠臟器，固定于10%福爾馬林中，石蠟包埋作為病理組織學分析。石蠟包埋組織塊，連續切片4μm。應用蘇木素-伊紅染色(hematoxylin and eosin, HE)，電子顯微鏡觀察組織病理結構。
1.4 大鼠血液生化指標的檢測
肝素鈉抗凝血液，經離心后獲得血漿用來檢測生化指標。所檢測指標包括：肌酸激酶(creatine kinase, CK)，肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase-MB isoenzyme, CK-MB)，天冬氨酸轉移酶(aspartate transferase, AST)，丙氨酸氨基轉移酶(alanine Aminotransferase, ALT)，血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)，肌酸酐(creatinine, CRE)，胰淀粉酶(amylopsin, AMY)和葡萄糖(glucose, GLU)，用全自動生化分析儀檢測，每個樣品重復三次。
1.5 高效液相色譜分析
高效液相色譜儀：ACCELA PDA檢測器；ACCELA自動樣品進樣器和ACCELA 1250泵。樣品分離執行柱為ACQUITY UPLC?BEH C18 column(1.7μm, 50 mm×3 mm, Waters, USA)。移動相的組成包括：0.1%(v/v)甲酸(A)和甲醇(B)。線性梯度為：0 min，40% A，60% B；0~5 min，20% A，80% B；5~10 min，100% B；流速為300μL/min。柱溫30℃，檢測波長255 nm，注射樣本體積5μL。
1.6 骨生物力學的檢測
骨骼樣品室溫條件下，緩慢解凍并放入生理鹽水中使其骨骼組織一直保持濕潤。進行三點彎試驗，股骨骨干作為實驗樣品，支點跨距(L)為20 mm，與上方支點垂直，速率10 mm/min，反方向對股骨骨干中點壓縮，直至骨干破碎。股骨的材料力學指標包括：最大應力(σult，MPa)、屈服應力(σyield，MPa)、彈性模量(Eb，Gpa)、最大能量(U，J)、最大應變(εult，%)和屈服應變(εyield，%)。
1.7 電感耦合等離子質譜和電感耦合等離子光譜檢測骨中無機質含量
骨樣品首先應用陶瓷刀切成碎片，應用陶瓷刀是避免對骨金屬污染，其次獲得的骨碎片放入50℃真空干燥箱中。骨樣品預處理之后精確稱量0.5 g放入30 mL PTFE試管中，加入5 mL高純度HNO3，混勻后，放入熱氣爐120℃加熱，直到試管中溶液變得清澈為止，這時消化已經完全。電感耦合等離子光譜儀用來檢測骨中的常量元素，例如鈣(calcium, Ca)和鎂(magnesium, Mg)；電感耦合等離子質譜儀用來分析骨中微量元素，例如鋅(zinc, Zn)、鋁(aluminium, Al)、錳(manganese, Mn)和鐵(iron, Fe)。
1.8 數據統計分析
結果用SPSS13.0軟件進行統計分析，所有數據標注均為均值±標準差，相同月齡的試驗組大鼠和對照組大鼠之間的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 大鼠骨骼紅染情況
圖 1顯示，飼喂茜草6個月后，5%、10%和15%組大鼠骨骼均被染成紅色，并且四肢骨骨內膜、骨外膜和骨板層均被染成紅色，10%和15%組大鼠長骨染色顯著深于5%組大鼠。
圖1
飼喂茜草6個月后大鼠骨骼紅染情況
Figure1.
Representative rat femurs stained red for 6 months of madder feeding
2.2 病理組織學變化
飼喂茜草后6個月，除15%組大鼠腎小球充血和腎小管血管有淤血和充血外，對照組、5%和10%組大鼠心、肝、脾、胃、肺和腎臟均未見眼觀和病理組織學變化，圖 2所示。
圖2
飼喂茜草后6個月大鼠肝和腎的病理切片(HE染色，100×)
Figure2.
Histopathology sections of liver and kidney in rat for 6 months of madder feeding (HE stain, 100×)
2.3 血液生化指標的檢測
表 1顯示了飼喂茜草6個月后，對照組、5%、10%和15%組大鼠血液生化指標的變化。飼喂茜草后6個月，5%、10%組與對照組大鼠血液中CK、CK-MB、AST、ALT、BUN、CRE、AMY和GLU水平的差異均不顯著(P＞0.05)。然而，飼喂茜草后6個月，15%組大鼠血液中BUN和CRE的水平顯著高于對照組大鼠(P＜0.05)。
表1
飼喂茜草6個月后大鼠血液生化指標的檢測結果
Table1.
Comparison of the biochemical levels in blood plasma of rat for 6 months of madder feeding
2.4 大鼠股骨礦物質含量
飼喂茜草0.5、1、3和6個月后，對照組、5%、10%和15%組大鼠股骨干中無機質的含量見表 2。飼喂茜草1個月后，10%和15%組大鼠股骨干中鈣含量顯著高于對照組(P＜0.05)。飼喂茜草3個月后，10%和15%組大鼠股骨干中鈣和鎂的含量顯著高于對照組大鼠(P＜0.05)。飼喂茜草6個月后，10%組大鼠股骨干中鈣、鎂和鋅的含量高于對照組，分別增加28.2%、23.92%和16.88%(P＜0.05)；15%組大鼠股骨干中鈣、鎂和鋅的含量高于對照組大鼠，分別增加27.2%、24.02%和17.02%(P＜0.05)，如表 2所示。
表2
飼喂茜草后大鼠股骨干中礦物質含量的檢測結果
Table2.
Bone mineral contents of the rat femurs after madder feeding
2.5 高效液相色譜分析結果
飼喂茜草6個月后，用稀鹽酸提取骨中紅色物質，高效液相色譜圖譜分析結果圖 3所示。紅色物質主要存在三個峰，保留時間分別為：2.252、2.908和4.091 min。茜草素標準品(97%)主要有三個峰，其保留時間分別顯示：1.035、2.805和4.078 min。大鼠中紅色物質最高峰的保留時間值為4.091 min，與茜草素標準品的最高峰保留時間4.078 min幾乎一致，所以可以認為大鼠骨中的紅色物質是一種茜草素類似物質。
圖3
飼喂茜草后大鼠股骨中紅色物質的高效液相色譜分析結果
Figure3.
Chromatogram showing the separation of red material isolated from rat femurs after madder feeding
2.6 大鼠股骨三點彎試驗
飼喂茜草3和6個月后，10%組大鼠股骨干彈性模量、能量、屈服壓力、最大壓力、屈服應變和最大應變的值均顯著高于對照組大鼠(P＜0.05)，如表 3所示。
表3
飼喂茜草后大鼠的股骨三點彎試驗的參數結果
Table3.
Results of three-point bending experiments of the femur diaphysis in the rats after madder feeding
3 討論
茜草內含有豐富的染料物質，經研究發現動物采食茜草后，動物骨骼可變為紅色，因此，至今茜草素仍然被用作研究骨骼生長的熒光標記物，或者作為骨中鈣離子的染色劑[8]。正常范圍內飼喂茜草，對動物是安全的，無毒害影響，同時亦不會抑制動物的生長。然而，長時間飼喂高劑量的茜草會導致一些毒副作用。本試驗研究發現飼喂茜草6個月后，15%組大鼠腎小球和腎小管血管充血和淤血，血漿尿素氮和肌酐濃度顯著高于對照組，說明長期大劑量的飼喂茜草會導致大鼠腎臟損傷；5%和10%組大鼠腎臟和肝臟與對照組之間無差異，說明長期飼喂含有適量(≤10%)茜草的日糧對大鼠無毒害作用。
先前研究指出大鼠肌肉注射茜草素后，表現出體重減輕，但是不會影響骨生長[6]。也有報道指出注射茜素紅S會停止或延緩骨骼的生長[7]。少數報道注射茜草素可以導致大鼠腎臟和肝臟發生癌變。目前有關茜草對骨骼生長和體重影響的結論眾說紛紜。因此，本試驗選取1月齡大鼠隨機分為4組，分別在日糧中添加0%、5%、10%和15%的茜草，飼喂茜草1、3和6個月后，10%和15%組大鼠股骨中鈣的含量顯著高于對照組；飼喂茜草3個月后，10%和15%組大鼠骨中鈣和鎂的含量顯著高于對照組；飼喂茜草6個月后，10%和15%組大鼠骨中鈣、鎂和鋅的含量顯著高于對照組，由此說明茜草飼喂能增加大鼠骨骼中的鈣、鎂和鋅的含量。骨是由有機物和無機物組成，有機物主要是蛋白質，無機物主要是鈣質和磷質等礦物質組成，并且無機質占骨量90%以上，是骨礦物質密度的主要決定因素。本試驗中，試驗組大鼠骨中的鈣和鎂含量增加，會進一步的增強骨中的礦物質密度。
我們進一步應用高效液相色譜法分析大鼠骨中紅色物質，與茜草素標準品進行對比，骨中紅色物質的主要成分是一種類似于茜草素的化合物。茜草素是茜草染料中的主要物質，這種類似于茜草素的化合物與磷酸鈣具有一定的親和性，與鈣鹽結合形成一種不溶于水的化合物并沉積在骨骼中，使骨骼被染成紅色[9]。正是由于這種類似茜草素的紅色染料與骨中主要礦物質元素具有一定的親和性，所以導致骨骼中的鈣鹽含量增加，可進一步促進骨骼礦物質的沉積。骨礦物質的增加，相應地影響了骨生物力學性能，骨的力學性能也隨之改變[10-12]。本試驗研究表明大鼠骨骼生物力學的變化趨勢與礦物質的含量變化一致，飼喂茜草3和6個月后，10%組大鼠股骨干彈性模量、能量、屈服壓力、最大壓力、屈服應變和最大應變值顯著高于對照組。骨礦物質含量與骨的生物力學性能呈顯著的相關性[13]。骨組織是承重的特殊組織，當力作用時，它會引起變形，根據Natali等[14]理論，單位骨質所受的力大于一定閾值時，骨就發生折斷，也就是說，當出現骨折時，說明骨的力學性能(骨的承重功能)已經降低。骨受力作用而產生變形和折斷的性質及大小與骨的幾何形態、骨組織材料和骨的結構特性密切相關。研究顯示，無論在正常大鼠或是去卵巢后，骨礦物質含量與骨生物力學指標是呈正相關[15]。因此，在本試驗中飼喂茜草后，大鼠骨骼中礦物質含量增加，相應的增強了骨的強度。
大鼠長期飼喂少于10%含量茜草是無毒害的，茜草中茜草素類似物能使其骨骼紅染，同時增加骨骼中鈣鹽沉積，進一步促進骨骼的生物力學性能。
引言
茜草是野生植物，主要分布在我國西南和亞洲中部以及地中海地區。早在公元前三世紀，茜草曾用作衣料和羊毛等編織物的染料。動物飼喂茜草后，生長的骨骼被染成特殊的顏色[1]。茜草根中含有蒽醌類物質(Rubia tinctorum L)，具有許多不同的生物學活性，如抗氧化劑、抗微生物、抗真菌、細胞毒性、殺滅寄生蟲幼蟲和抗病毒活性[2]。茜草也作為中草藥用于治療黃疸、坐骨神經痛和癱瘓[3]。茜草素紅還可以在體外抑制HIV-1蛋白酶，并且在體內也表現出很多優點[4]。茜草最重要的作用就是作為天然的植物染料。茜草主要含有茜草素、紅紫素和偽羥基茜草素，這些染料可以有效地結合骨中的鈣離子[5]。然而，采食茜草對骨的生長的影響眾說紛紜。有的認為茜草可能延遲鼠牙齒和骨的生長，或者是短暫停止骨的生長[6]。狗飼喂茜草素的劑量超過40 mg/kg，抑制骨的形成，飼喂同等劑量的茜草素紅S也有類似的作用。高劑量的茜草，可使血壓快速降低，心率增加并發呼吸困難[7]。為進一步驗證茜草對骨骼礦物質沉積和生物力學的影響，本實驗在大鼠日糧中添加不同劑量的茜草，并在飼喂茜草后第0.5、1、3和6個月觀測大鼠的股骨干礦物質含量和骨生物力學性能的變化。
1 材料與方法
1.1 儀器
7500型八級桿反應池系統電感耦合等離子質譜儀(ICP-MS)(美國Agilent公司)；Triton X-100(Sigma公司)；電感耦合等離子體原子發射光譜儀(ICP=OES)(美國Agilent公司)；高效液相色譜儀(Thermo ACCELA system，美國)；全自動生化分析儀檢測(Beckman Synchron CX7 Delta Chemistry Analyzers，美國)。
1.2 茜草的制備和試驗動物的飼喂以及分組
中草藥茜草根購于云南省昆明市中國傳統中醫藥商店。所購得的茜草根部經粉碎機粉碎，由200目篩子過濾，得到茜草粉末。
1月齡80只大鼠購自西安交通大學實驗動物中心，隨機分成4組，每組20只大鼠，大鼠顆粒日糧中分別添加0%(對照組)、5%(5%組)、10%(10%組)和15%(15%組)的茜草粉末，所制備的日糧營養成分符合大鼠日糧標準。
飼喂茜草后0.5、1、3和6個月，每個時間點每組處死5只大鼠。應用乙醚麻醉，取大鼠心、肝、脾、胃、腎、小腸和胰臟，10%福爾馬林固定；采集雙側股骨和血液，右側股骨用于生物力學和礦物質檢測，左側股骨用于骨中紅色物質分析，血液用于檢測生化指標。
1.3 病理組織學分析
每組大鼠臟器，固定于10%福爾馬林中，石蠟包埋作為病理組織學分析。石蠟包埋組織塊，連續切片4μm。應用蘇木素-伊紅染色(hematoxylin and eosin, HE)，電子顯微鏡觀察組織病理結構。
1.4 大鼠血液生化指標的檢測
肝素鈉抗凝血液，經離心后獲得血漿用來檢測生化指標。所檢測指標包括：肌酸激酶(creatine kinase, CK)，肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase-MB isoenzyme, CK-MB)，天冬氨酸轉移酶(aspartate transferase, AST)，丙氨酸氨基轉移酶(alanine Aminotransferase, ALT)，血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)，肌酸酐(creatinine, CRE)，胰淀粉酶(amylopsin, AMY)和葡萄糖(glucose, GLU)，用全自動生化分析儀檢測，每個樣品重復三次。
1.5 高效液相色譜分析
高效液相色譜儀：ACCELA PDA檢測器；ACCELA自動樣品進樣器和ACCELA 1250泵。樣品分離執行柱為ACQUITY UPLC?BEH C18 column(1.7μm, 50 mm×3 mm, Waters, USA)。移動相的組成包括：0.1%(v/v)甲酸(A)和甲醇(B)。線性梯度為：0 min，40% A，60% B；0~5 min，20% A，80% B；5~10 min，100% B；流速為300μL/min。柱溫30℃，檢測波長255 nm，注射樣本體積5μL。
1.6 骨生物力學的檢測
骨骼樣品室溫條件下，緩慢解凍并放入生理鹽水中使其骨骼組織一直保持濕潤。進行三點彎試驗，股骨骨干作為實驗樣品，支點跨距(L)為20 mm，與上方支點垂直，速率10 mm/min，反方向對股骨骨干中點壓縮，直至骨干破碎。股骨的材料力學指標包括：最大應力(σult，MPa)、屈服應力(σyield，MPa)、彈性模量(Eb，Gpa)、最大能量(U，J)、最大應變(εult，%)和屈服應變(εyield，%)。
1.7 電感耦合等離子質譜和電感耦合等離子光譜檢測骨中無機質含量
骨樣品首先應用陶瓷刀切成碎片，應用陶瓷刀是避免對骨金屬污染，其次獲得的骨碎片放入50℃真空干燥箱中。骨樣品預處理之后精確稱量0.5 g放入30 mL PTFE試管中，加入5 mL高純度HNO3，混勻后，放入熱氣爐120℃加熱，直到試管中溶液變得清澈為止，這時消化已經完全。電感耦合等離子光譜儀用來檢測骨中的常量元素，例如鈣(calcium, Ca)和鎂(magnesium, Mg)；電感耦合等離子質譜儀用來分析骨中微量元素，例如鋅(zinc, Zn)、鋁(aluminium, Al)、錳(manganese, Mn)和鐵(iron, Fe)。
1.8 數據統計分析
結果用SPSS13.0軟件進行統計分析，所有數據標注均為均值±標準差，相同月齡的試驗組大鼠和對照組大鼠之間的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 大鼠骨骼紅染情況
圖 1顯示，飼喂茜草6個月后，5%、10%和15%組大鼠骨骼均被染成紅色，并且四肢骨骨內膜、骨外膜和骨板層均被染成紅色，10%和15%組大鼠長骨染色顯著深于5%組大鼠。
圖1
飼喂茜草6個月后大鼠骨骼紅染情況
Figure1.
Representative rat femurs stained red for 6 months of madder feeding
2.2 病理組織學變化
飼喂茜草后6個月，除15%組大鼠腎小球充血和腎小管血管有淤血和充血外，對照組、5%和10%組大鼠心、肝、脾、胃、肺和腎臟均未見眼觀和病理組織學變化，圖 2所示。
圖2
飼喂茜草后6個月大鼠肝和腎的病理切片(HE染色，100×)
Figure2.
Histopathology sections of liver and kidney in rat for 6 months of madder feeding (HE stain, 100×)
2.3 血液生化指標的檢測
表 1顯示了飼喂茜草6個月后，對照組、5%、10%和15%組大鼠血液生化指標的變化。飼喂茜草后6個月，5%、10%組與對照組大鼠血液中CK、CK-MB、AST、ALT、BUN、CRE、AMY和GLU水平的差異均不顯著(P＞0.05)。然而，飼喂茜草后6個月，15%組大鼠血液中BUN和CRE的水平顯著高于對照組大鼠(P＜0.05)。
表1
飼喂茜草6個月后大鼠血液生化指標的檢測結果
Table1.
Comparison of the biochemical levels in blood plasma of rat for 6 months of madder feeding
2.4 大鼠股骨礦物質含量
飼喂茜草0.5、1、3和6個月后，對照組、5%、10%和15%組大鼠股骨干中無機質的含量見表 2。飼喂茜草1個月后，10%和15%組大鼠股骨干中鈣含量顯著高于對照組(P＜0.05)。飼喂茜草3個月后，10%和15%組大鼠股骨干中鈣和鎂的含量顯著高于對照組大鼠(P＜0.05)。飼喂茜草6個月后，10%組大鼠股骨干中鈣、鎂和鋅的含量高于對照組，分別增加28.2%、23.92%和16.88%(P＜0.05)；15%組大鼠股骨干中鈣、鎂和鋅的含量高于對照組大鼠，分別增加27.2%、24.02%和17.02%(P＜0.05)，如表 2所示。
表2
飼喂茜草后大鼠股骨干中礦物質含量的檢測結果
Table2.
Bone mineral contents of the rat femurs after madder feeding
2.5 高效液相色譜分析結果
飼喂茜草6個月后，用稀鹽酸提取骨中紅色物質，高效液相色譜圖譜分析結果圖 3所示。紅色物質主要存在三個峰，保留時間分別為：2.252、2.908和4.091 min。茜草素標準品(97%)主要有三個峰，其保留時間分別顯示：1.035、2.805和4.078 min。大鼠中紅色物質最高峰的保留時間值為4.091 min，與茜草素標準品的最高峰保留時間4.078 min幾乎一致，所以可以認為大鼠骨中的紅色物質是一種茜草素類似物質。
圖3
飼喂茜草后大鼠股骨中紅色物質的高效液相色譜分析結果
Figure3.
Chromatogram showing the separation of red material isolated from rat femurs after madder feeding
2.6 大鼠股骨三點彎試驗
飼喂茜草3和6個月后，10%組大鼠股骨干彈性模量、能量、屈服壓力、最大壓力、屈服應變和最大應變的值均顯著高于對照組大鼠(P＜0.05)，如表 3所示。
表3
飼喂茜草后大鼠的股骨三點彎試驗的參數結果
Table3.
Results of three-point bending experiments of the femur diaphysis in the rats after madder feeding
3 討論
茜草內含有豐富的染料物質，經研究發現動物采食茜草后，動物骨骼可變為紅色，因此，至今茜草素仍然被用作研究骨骼生長的熒光標記物，或者作為骨中鈣離子的染色劑[8]。正常范圍內飼喂茜草，對動物是安全的，無毒害影響，同時亦不會抑制動物的生長。然而，長時間飼喂高劑量的茜草會導致一些毒副作用。本試驗研究發現飼喂茜草6個月后，15%組大鼠腎小球和腎小管血管充血和淤血，血漿尿素氮和肌酐濃度顯著高于對照組，說明長期大劑量的飼喂茜草會導致大鼠腎臟損傷；5%和10%組大鼠腎臟和肝臟與對照組之間無差異，說明長期飼喂含有適量(≤10%)茜草的日糧對大鼠無毒害作用。
先前研究指出大鼠肌肉注射茜草素后，表現出體重減輕，但是不會影響骨生長[6]。也有報道指出注射茜素紅S會停止或延緩骨骼的生長[7]。少數報道注射茜草素可以導致大鼠腎臟和肝臟發生癌變。目前有關茜草對骨骼生長和體重影響的結論眾說紛紜。因此，本試驗選取1月齡大鼠隨機分為4組，分別在日糧中添加0%、5%、10%和15%的茜草，飼喂茜草1、3和6個月后，10%和15%組大鼠股骨中鈣的含量顯著高于對照組；飼喂茜草3個月后，10%和15%組大鼠骨中鈣和鎂的含量顯著高于對照組；飼喂茜草6個月后，10%和15%組大鼠骨中鈣、鎂和鋅的含量顯著高于對照組，由此說明茜草飼喂能增加大鼠骨骼中的鈣、鎂和鋅的含量。骨是由有機物和無機物組成，有機物主要是蛋白質，無機物主要是鈣質和磷質等礦物質組成，并且無機質占骨量90%以上，是骨礦物質密度的主要決定因素。本試驗中，試驗組大鼠骨中的鈣和鎂含量增加，會進一步的增強骨中的礦物質密度。
我們進一步應用高效液相色譜法分析大鼠骨中紅色物質，與茜草素標準品進行對比，骨中紅色物質的主要成分是一種類似于茜草素的化合物。茜草素是茜草染料中的主要物質，這種類似于茜草素的化合物與磷酸鈣具有一定的親和性，與鈣鹽結合形成一種不溶于水的化合物并沉積在骨骼中，使骨骼被染成紅色[9]。正是由于這種類似茜草素的紅色染料與骨中主要礦物質元素具有一定的親和性，所以導致骨骼中的鈣鹽含量增加，可進一步促進骨骼礦物質的沉積。骨礦物質的增加，相應地影響了骨生物力學性能，骨的力學性能也隨之改變[10-12]。本試驗研究表明大鼠骨骼生物力學的變化趨勢與礦物質的含量變化一致，飼喂茜草3和6個月后，10%組大鼠股骨干彈性模量、能量、屈服壓力、最大壓力、屈服應變和最大應變值顯著高于對照組。骨礦物質含量與骨的生物力學性能呈顯著的相關性[13]。骨組織是承重的特殊組織，當力作用時，它會引起變形，根據Natali等[14]理論，單位骨質所受的力大于一定閾值時，骨就發生折斷，也就是說，當出現骨折時，說明骨的力學性能(骨的承重功能)已經降低。骨受力作用而產生變形和折斷的性質及大小與骨的幾何形態、骨組織材料和骨的結構特性密切相關。研究顯示，無論在正常大鼠或是去卵巢后，骨礦物質含量與骨生物力學指標是呈正相關[15]。因此，在本試驗中飼喂茜草后，大鼠骨骼中礦物質含量增加，相應的增強了骨的強度。
大鼠長期飼喂少于10%含量茜草是無毒害的，茜草中茜草素類似物能使其骨骼紅染，同時增加骨骼中鈣鹽沉積，進一步促進骨骼的生物力學性能。
