人淋巴細胞功能相關抗原3(hLFA3)是一種重要的T細胞黏附分子, 其與CD2結合后可促進T細胞活化。恒河猴被廣泛用作人類免疫疾病動物模型。因免疫系統存在嚴格的種屬特異性, 有必要研究恒河猴LFA3的功能。本文通過PCR擴增獲得mmLFA3Sh基因, 將其與人IgG1 Fc片段融合, 插入畢赤酵母表達載體構建表達質粒pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig。誘導表達后獲得融合蛋白mmLFA3Sh-Ig, 產量為3~4 mg/L。mmLFA3Sh-Ig能夠特異性與CD2陽性細胞結合, 能夠抑制Con A和同種抗原刺激的猴和人淋巴細胞增殖。這些實驗結果表明, mmLFA3Sh-Ig可能作為一種新的生物制劑用于研究恒河猴免疫疾病發病機制和實驗治療。
引用本文： 朱健, 朱升云, 楊浩, 盧曉風, 萬琳. 恒河猴LFA3胞外段CD2結合域在畢赤酵母中的重組表達及活性分析. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(1): 120-125. doi: 10.7507/1001-5515.20150022 復制
引言
人淋巴細胞功能相關抗原3(human lymphocyte function-associated antigen 3, hLFA3)是T細胞黏附分子的一種，屬于免疫球蛋白超家族成員。它廣泛表達于血細胞、內皮細胞、上皮細胞和結締組織細胞[1-3]。其中，表達在抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell, APC)上的LFA3能夠與T細胞表面糖蛋白CD2(cluster of differentiation 2, CD2)特異性結合，增強T細胞和APC之間的黏附[4]。此外，hLFA3-CD2的結合還能傳遞共刺激信號，調控T細胞、自然殺傷細胞、APC。這些事實表明hLFA3-CD2通路在免疫應答中具有重要調控作用[5-7]，因此hLFA3-CD2共刺激通路的干預手段有可能成為免疫抑制治療新方法[8-9]。
鑒于LFA3在免疫應答中的重要性，已經預測和鑒定了很多動物LFA3的編碼基因。國際上主要對人、小鼠、羊、豬的LFA3功能蛋白進行了深入研究[4, 10-12]，但國內研究僅涉及人、綿羊和豬LFA3[13-15]，目前尚未見有關恒河猴LFA3(Macaca mulatta LFA3, mmLFA3)基因克隆和蛋白功能方面的報道。恒河猴已被廣泛用作人類免疫疾病模型[16]，由于其免疫系統具有高度的種屬特異性[17]，所以極有必要對mmLFA3的結構和功能展開深入研究。
已有研究發現，hLFA3由胞外段、跨膜區和胞內段組成[18]。其中，胞外段包含CD2結合域，介導hLFA3與CD2結合。前期研究中，通過序列對比，我們發現mmLFA3胞外段1-92氨基酸與hLFA3的CD2結合域高度同源，同源性達到85%。這一信息提示，該結構可能是mmLFA3的CD2結合域，可能具有CD2結合功能，而其重組表達產物也可能通過干預mmLFA3-CD2共刺激信號通路而顯示免疫抑制活性。因此，本研究首先擴增了推測的mmLFA3胞外段CD2結合域(mmLFA3Sh)基因，然后將其與人IgG1 Fc片段融合，構建了表達質粒pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig；在摸索了融合蛋白畢赤酵母誘導表達及分離純化條件后，又進一步比較了融合蛋白對CD2陽性和陰性細胞的結合能力，測試了融合蛋白對刀豆球蛋白(concanavalin A, Con A)和同種抗原刺激的淋巴細胞增殖抑制作用。
1 材料與方法
1.1 材料
大腸桿菌TOP10，畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115均為本實驗室保種；pPIC9K載體購自Invitrogen公司；人外周血白血病T細胞(Jurkat)和B細胞淋巴瘤細胞(Raji)購自美國American Type Culture Collection(ATCC)細胞庫。
1.2 實驗動物
恒河猴來源于四川大學動物實驗中心，恒河猴的飼養和處理都符合倫理學要求。
1.3 方法
1.3.1 pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表達質粒的構建
利用特異性引物(上游：5′-TAGC
1.3.2 mmLFA3Sh-Ig表達菌的篩選
提取抗性克隆中pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表達質粒，用SacⅠ限制性內切酶進行線性化。回收酶切產物，電轉化酵母感受態細胞GS115后(電壓1.5 kV，電阻200Ω，電容25μF)，涂布于組氨酸缺陷型(minimal dextrose，MD)固體培養基上培養(28℃，40~48 h)。待克隆長出后，挑取單克隆，接種于5 mL Yeast Peptone Dextrose(YPD)培養基中培養(28℃，260 r/min，40~48 h)。
提取不同克隆的DNA，并以此為模板，用引物(上游：5′-TACTATTGCCGCATTGCTGC-3′；下游：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′)PCR擴增mmLFA3Sh-Ig基因(94℃變性5 min，94℃解鏈30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環)，以鑒定mmLFA3Sh基因是否插入成功。將篩選出的陽性克隆分別接種于100 mL BMGY(buffered glycerol-complex medium: 1% yeast extract，2% peptone，pH6.0的100 mmol/L磷酸鉀緩沖液，1.34% YNB，4×10-5%生物素，1%甘油)中28℃，280 r/min培養至酵母菌液A600nm=2~6。隨后將酵母菌液16 000 g離心10 min，用10 mL BMMY(buffered methanol-complex medium: 1% yeast extract，2% peptone，pH6.0的100 mmol/L磷酸鉀緩沖液，1.34% YNB，4×10-5%生物素，3%甲醇)重懸。將BMMY重懸后的菌液28℃，280 r/min誘導培養72 h，期間每天補加甲醇。
誘導完畢取菌液上清進行Western blot檢測。取上清15μL，用含有2-巰基乙醇(2-Mercaptoethanol，2-ME)與等體積上樣緩沖液混合，沸水浴5~10 min后經SDS-PAGE(Sodium dodecyl(lauryl)sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)電泳分離。分離膠濃度為12.75%，濃縮膠濃度為4%。先用80 V電壓使蛋白進入分離膠，再將電壓調至120 V電泳至溴酚藍達到分離膠底部。電泳結束后，將凝膠上的蛋白轉移(100 V，1 h)至PVDF(polyvinylidene fluoride)膜。轉移緩沖液為25 mmol/L Tris，192 mmol/L glycine，15%甲醇。轉膜結束后，PVDF膜用含有5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH7.2)37℃封閉1 h。然后用一抗(1 :1 000稀釋于含2.5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液中)4℃孵育過夜。用含有0.05% Tween 20的磷酸鹽緩沖液洗滌6次后與二抗(1 :2000稀釋于含2.5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液)孵育1 h。將膜洗滌6次后用化學發光底物顯色，用凝膠成像儀采集圖像。
1.3.3 mmLFA3Sh-Ig的分離純化
選擇表達量高的菌株大量生產蛋白。將菌株接種于1000 mL BMGY培養基中，28℃，280 r/min培養至A600nm=2~6，然后收集菌體懸浮于100 mL BMMY培養基(含3%甲醇)中誘導72 h。4℃離心(16 000 g，15 min)收集上清，并以磷酸緩沖液(20 mmol/L，pH7.2，150 mmol/L NaCl)于4℃透析過夜。用磷酸鹽緩沖液平衡Protein A-CL-Sepharose親和層析柱，待電導、A280nm、pH值穩定后上樣，流速為3 mL/min。進樣完畢，用磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH7.2，300 mmol/L NaCl)將雜蛋白洗去，再用Glycine-HCl(0.1 mol/L，pH3.6)進行洗脫，按500μL/管收集。為避免酸性環境下蛋白失活，在收集管中預先加入50μL Tris-HCl(1 mol/L，pH8.0)。純化后的蛋白用細胞培養專用PBS(137 mmol/L NaCl，2.68 mmol/L KCl，8.1 mmol/L Na2HPO4，1.47 mmol/L KH2PO4)4℃透析過夜。取10μL樣品分別用含和不含2-ME的上樣緩沖液處理后進行SDS-PAGE電泳。凝膠濃度和電壓條件同1.3.2。電泳結束，凝膠用考馬斯亮藍染色顯示蛋白條帶，并用凝膠成像儀采集圖像。其余樣品過濾滅菌分裝并貯存于-80℃備用。
1.3.4 mmLFA3Sh-Ig的FITC標記
mmLFA3Sh-Ig蛋白用1 mol/L Na2CO3調節至pH8.5左右。然后將其與溶于二甲基甲酰胺的FITC(fluorescein isothiocyanate，10 mg/mL)按物質的量之比1 :24混合，室溫避光反應1 h。反應結束后用PBS于4℃透析去除游離FITC，直至透析外液A495nm＜0.001。透析后的蛋白分裝于-80℃貯存。
1.3.5 mmLFA3Sh-Ig與細胞結合
FITC標記的anti-CD2抗體購自BD公司，Jurkat，Raji細胞按照ATCC官網上描述的條件進行培養。Jurkat和Raji細胞均用含有0.5%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的PBS洗滌兩次。細胞計數后，每2×105個細胞用100μL含有0.5% FBS的PBS重懸。向兩種細胞中加入FITC標記的anti-CD2抗體或mmLFA3Sh-Ig，37℃結合1 h。細胞再用含0.5% FBS的PBS洗滌2次(600 g，3 min)，以羊抗鼠IgG抗體作為對照，用流式細胞分析儀檢測。
1.3.6 BrdU檢測mmLFA3Sh-Ig對淋巴細胞增殖的抑制效果
Con A可刺激淋巴細胞增殖，是最常用的淋巴細胞增殖抑制測試體系。混合淋巴細胞反應(Mixed Lymphocyte Reaction, MLR)體系能模擬移植排斥，是常規免疫抑制體外測試模型。本文用Con A和MLR兩種體系測試mmLFA3Sh-Ig的生物活性。抽取恒河猴和人血液，用Ficoll液分離獲取外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclearcells, PBMCs)。在Con A體系中，取2.5×105個細胞接種于96孔板，然后用Con A(5μg/mL)刺激培養。在0 d時加入不同濃度(0、2.5、5、10、20、40或80μg/mL)的mmLFA3Sh-Ig，3 d后用BrdU檢測其對淋巴細胞增殖的抑制效果。在MLR體系中，以5×105個淋巴細胞作為效應細胞，用同樣數目的同種異體淋巴細胞[經50μg/mL絲裂霉素C(mitomycin C，MMC)，37℃處理30 min]作為刺激細胞。效應細胞與刺激細胞懸浮于200μL培養基中，96孔板中共培養。0 d時加入不同濃度(0、2.5、5、10、20、40或80μg/mL)mmLFA3Sh-Ig，5 d后用BrdU檢測其對淋巴細胞增殖的抑制效果。BrdU摻入時間為2~24 h，以蛋白濃度為0μg/mL(加入等體積PBS)的孔中細胞Brdu攝取量為100%。所有操作按照試劑盒說明書進行，重復三次。
2 結果
2.1 pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig重組表達質粒的構建
以優化過后的mmLFA3基因為模板，PCR擴增獲得的片段位于250~500 bp[圖 1(a)]，與預期分子量大小相符。經DNA測序驗證，基因片段大小為306 bp，序列與mmLFA3Sh序列一致。將經過EcoRⅠ和AvrⅡ雙酶切后的mmLFA3Sh片段與pPIC9K-Fc質粒載體連接。獲得的質粒再經EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，電泳顯示酶切產物大于1 000 bp[圖 1(b)，泳道2]。進一步測序確定該片段包含mmLFA3Sh和IgG Fc基因，表明mmLFA3Sh與IgG1 Fc連接成功。該表達質粒命名為pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig，框架如圖 1(c)所示。
圖1
pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表達質粒構建
(a)mmLFA3Sh基因的PCR擴增；M：DNA分子量標準；1：mmLFA3Sh基因擴增產物; (b)質粒酶切鑒定；M：DNA分子量標準；1：pPIC9K-mmLFA3FL-Ig對照質粒；2：pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表達質粒；(c) pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表達質粒結構示意圖
Figure1. Construction of pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig expression plasmid(a) PCR amplification of mmLFA3Sh gene; M: DNA marker; 1: PCR product of mmLFA3Sh; (b) digestion of pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig plasmid with
2.2 pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig陽性克隆篩選及表達純化
隨機挑取7個克隆用PCR擴增檢查mmLFA3Sh-Ig基因整合情況。電泳顯示從6個克隆中擴增出基因片段[圖 2(a)]。DNA測序確定該片段大小為1 100 bp，是mmLFA3Sh-Ig編碼基因。進一步對這6個陽性克隆菌株目的蛋白表達進行檢測。Western blot分析發現，所有菌株發酵液中均顯示出與目的蛋白大小(35 kD)相近的蛋白條帶，提示mmLFA3Sh-Ig在這些菌株中可以獲得表達。相同條件下，6號菌株目的蛋白表達量最高[圖 2(b)]。
圖2
mmLFA3Sh-Ig陽性克隆篩選和純化蛋白電泳
(a)PCR鑒定mmLFA3Sh-Ig基因在不同克隆(1~7)的插入；(b)Western blot分析檢測陽性克隆中mmLFA3Sh-Ig蛋白的表達；(c)純化后mmLFA3Sh-Ig的SDS-PAGE電泳；M:蛋白質分子量標準；1:樣品含2-ME；2：樣品不含2-ME
Figure2. Screening of mmLFA3Sh-Ig-productive colonies and SDS-PAGE of purified mmLFA3Sh-Ig(a) PCR amplification of mmLFA3Sh-Ig in different colonies(1~7); (b) Western blot assays for mmLFA3Sh-Ig expression in PCR-identified colonies; (c) SDS-PAGE of purified mmLFA3Sh-Ig in the presence (+) or absence (-) of 2-ME
利用6號菌株進行蛋白的大量表達和純化。純化后的mmLFA3Sh-Ig與含和不含2-巰基乙醇(2-ME)的上樣緩沖液混合后電泳。結果如圖 2(c)所示，mmLFA3Sh-Ig在有2-ME條件下顯示為單帶，分子量大約為35 kD。在無2-ME條件下，mmLFA3Sh-Ig顯示為兩條帶，分子量相當于單體和二聚體。IgG1 Fc段有通過分子間二硫鍵形成二聚體的能力。因此，電泳結果提示部分mmLFA3Sh-Ig可能在分子內Fc段的作用下形成二聚體。分離純化結果表明，從1 L誘導培養基中能獲得3~4 mg純度為80%左右的mmLFA3Sh-Ig蛋白。
2.3 mmLFA3Sh-Ig與細胞的結合
流式細胞儀檢測發現，Anti-CD2抗體與Jurkat，Raji細胞孵育后，陽性率分別是99.7%和2%，驗證了Jurkat是CD2陽性細胞，而Raji是CD2陰性細胞[圖 3(a)]。mmLFA3Sh-Ig蛋白與Jurkat和Raji細胞孵育后，陽性率分別為66.7%和5% [圖 3(b)]，結果顯示mmLFA3Sh-Ig能夠與CD2陽性細胞Jurkat結合，不與CD2陰性細胞Raji結合。
圖3
蛋白與細胞的結合
(a)anti-CD2和細胞的結合；(b)mmLFA3Sh-Ig和細胞的結合
Figure3. Binding of proteins to Jurkat and Raji cells(a) the binding of anti-CD2 to Jurkat and Raji cells; (b) the binding of mmLFA3Sh-Ig to Jurkat and Raji cells
2.4 mmLFA3Sh-Ig對淋巴細胞增殖的抑制
如圖 4所示，在Con A刺激的淋巴細胞增殖系統中，隨著mmLFA3Sh-Ig蛋白濃度的增加，淋巴細胞的增殖越來越少，這表明mmLFA3Sh-Ig具有劑量依賴的淋巴細胞增殖抑制活性。當蛋白濃度從2.5μg/mL提高到80μg/mL時，抑制率從14%提高到56%。在MLR體系中，mmLFA3Sh-Ig同樣顯示了對人和猴淋巴細胞增殖的劑量依賴性抑制作用。而且，當蛋白濃度為80μg/mL時，mmLFA3Sh-Ig對恒河猴淋巴細胞增殖的抑制率達到了75%，而對人淋巴細胞增殖的抑制率為55%，兩者有明顯差異，提示LFA3有一定的種屬特異性。但是，mmLFA3Sh-Ig對Con A刺激的人和猴淋巴細胞增殖抑制沒有明顯差別。這可能是由于Con A刺激淋巴細胞增殖主要依賴絲裂原受體途徑而非MLR反應的抗原遞呈所致。
圖4
mmLFA3Sh-Ig在Con A和MLR系統中對淋巴細胞增殖的抑制作用
Figure4.
Ability of mmLFA3Sh-Ig to suppress the proliferation of lymphocytes in Con A and MLR system
3 討論
目前，與IgG1 Fc段融合表達是多數共刺激分子功能區段的優選策略。為驗證mmLFA3Sh區域的功能，本實驗同樣選擇了將mmLFA3的CD2結合域mmLFA3Sh區域與IgG1 Fc融合[圖 1(c)]。實驗中，我們用畢赤酵母成功表達了mmLFA3Sh-Ig融合蛋白。SDS-PAGE電泳結果顯示，mmLFA3Sh-Ig在溶液中多數以二聚體形式存在[圖 2(c)]，這說明與mmLFA3Sh融合的Fc段發揮了聚合作用。因為天然LFA3是以二聚體形式發揮功能的[19]，所以二聚體形式的mmLFA3Sh-Ig也能更好的模擬天然mmLFA3。
mmLFA3Sh-Ig能夠與CD2陽性Jurkat細胞結合，而不與CD2陰性Raji細胞結合，提示mmLFA3Sh具有CD2結合能力。體外實驗發現，mmLFA3Sh-Ig在Con A和MLR體系中均顯示劑量依賴性的淋巴細胞增殖抑制作用(圖 4)，提示了mmLFA3Sh-Ig可能通過干擾LFA3-CD2共刺激信號通路而顯示免疫抑制。但已有研究對hLFA3胞外段CD2結合域重組蛋白(Alefacept)的研究表明，Alefacept體內條件下主要依賴Fc介導的細胞毒作用清除記憶性T細胞而顯示免疫抑制[20-22]。對于酵母生產的mmLFA3Sh-Ig是否有同樣的功能，還需進一步實驗證明。盡管如此，mmLFA3Sh-Ig對同種抗原刺激的恒河猴淋巴細胞增殖抑制強于對人淋巴細胞的增殖抑制，不僅提示猴和人免疫系統的差別，還提示我們在恒河猴免疫疾病模型中，最好用mmLFA3來探討LFA3-CD2共刺激信號通路介導的發病機制或進行實驗免疫治療。
引言
人淋巴細胞功能相關抗原3(human lymphocyte function-associated antigen 3, hLFA3)是T細胞黏附分子的一種，屬于免疫球蛋白超家族成員。它廣泛表達于血細胞、內皮細胞、上皮細胞和結締組織細胞[1-3]。其中，表達在抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell, APC)上的LFA3能夠與T細胞表面糖蛋白CD2(cluster of differentiation 2, CD2)特異性結合，增強T細胞和APC之間的黏附[4]。此外，hLFA3-CD2的結合還能傳遞共刺激信號，調控T細胞、自然殺傷細胞、APC。這些事實表明hLFA3-CD2通路在免疫應答中具有重要調控作用[5-7]，因此hLFA3-CD2共刺激通路的干預手段有可能成為免疫抑制治療新方法[8-9]。
鑒于LFA3在免疫應答中的重要性，已經預測和鑒定了很多動物LFA3的編碼基因。國際上主要對人、小鼠、羊、豬的LFA3功能蛋白進行了深入研究[4, 10-12]，但國內研究僅涉及人、綿羊和豬LFA3[13-15]，目前尚未見有關恒河猴LFA3(Macaca mulatta LFA3, mmLFA3)基因克隆和蛋白功能方面的報道。恒河猴已被廣泛用作人類免疫疾病模型[16]，由于其免疫系統具有高度的種屬特異性[17]，所以極有必要對mmLFA3的結構和功能展開深入研究。
已有研究發現，hLFA3由胞外段、跨膜區和胞內段組成[18]。其中，胞外段包含CD2結合域，介導hLFA3與CD2結合。前期研究中，通過序列對比，我們發現mmLFA3胞外段1-92氨基酸與hLFA3的CD2結合域高度同源，同源性達到85%。這一信息提示，該結構可能是mmLFA3的CD2結合域，可能具有CD2結合功能，而其重組表達產物也可能通過干預mmLFA3-CD2共刺激信號通路而顯示免疫抑制活性。因此，本研究首先擴增了推測的mmLFA3胞外段CD2結合域(mmLFA3Sh)基因，然后將其與人IgG1 Fc片段融合，構建了表達質粒pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig；在摸索了融合蛋白畢赤酵母誘導表達及分離純化條件后，又進一步比較了融合蛋白對CD2陽性和陰性細胞的結合能力，測試了融合蛋白對刀豆球蛋白(concanavalin A, Con A)和同種抗原刺激的淋巴細胞增殖抑制作用。
1 材料與方法
1.1 材料
大腸桿菌TOP10，畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115均為本實驗室保種；pPIC9K載體購自Invitrogen公司；人外周血白血病T細胞(Jurkat)和B細胞淋巴瘤細胞(Raji)購自美國American Type Culture Collection(ATCC)細胞庫。
1.2 實驗動物
恒河猴來源于四川大學動物實驗中心，恒河猴的飼養和處理都符合倫理學要求。
1.3 方法
1.3.1 pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表達質粒的構建
利用特異性引物(上游：5′-TAGC
1.3.2 mmLFA3Sh-Ig表達菌的篩選
提取抗性克隆中pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表達質粒，用SacⅠ限制性內切酶進行線性化。回收酶切產物，電轉化酵母感受態細胞GS115后(電壓1.5 kV，電阻200Ω，電容25μF)，涂布于組氨酸缺陷型(minimal dextrose，MD)固體培養基上培養(28℃，40~48 h)。待克隆長出后，挑取單克隆，接種于5 mL Yeast Peptone Dextrose(YPD)培養基中培養(28℃，260 r/min，40~48 h)。
提取不同克隆的DNA，并以此為模板，用引物(上游：5′-TACTATTGCCGCATTGCTGC-3′；下游：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′)PCR擴增mmLFA3Sh-Ig基因(94℃變性5 min，94℃解鏈30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環)，以鑒定mmLFA3Sh基因是否插入成功。將篩選出的陽性克隆分別接種于100 mL BMGY(buffered glycerol-complex medium: 1% yeast extract，2% peptone，pH6.0的100 mmol/L磷酸鉀緩沖液，1.34% YNB，4×10-5%生物素，1%甘油)中28℃，280 r/min培養至酵母菌液A600nm=2~6。隨后將酵母菌液16 000 g離心10 min，用10 mL BMMY(buffered methanol-complex medium: 1% yeast extract，2% peptone，pH6.0的100 mmol/L磷酸鉀緩沖液，1.34% YNB，4×10-5%生物素，3%甲醇)重懸。將BMMY重懸后的菌液28℃，280 r/min誘導培養72 h，期間每天補加甲醇。
誘導完畢取菌液上清進行Western blot檢測。取上清15μL，用含有2-巰基乙醇(2-Mercaptoethanol，2-ME)與等體積上樣緩沖液混合，沸水浴5~10 min后經SDS-PAGE(Sodium dodecyl(lauryl)sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)電泳分離。分離膠濃度為12.75%，濃縮膠濃度為4%。先用80 V電壓使蛋白進入分離膠，再將電壓調至120 V電泳至溴酚藍達到分離膠底部。電泳結束后，將凝膠上的蛋白轉移(100 V，1 h)至PVDF(polyvinylidene fluoride)膜。轉移緩沖液為25 mmol/L Tris，192 mmol/L glycine，15%甲醇。轉膜結束后，PVDF膜用含有5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH7.2)37℃封閉1 h。然后用一抗(1 :1 000稀釋于含2.5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液中)4℃孵育過夜。用含有0.05% Tween 20的磷酸鹽緩沖液洗滌6次后與二抗(1 :2000稀釋于含2.5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液)孵育1 h。將膜洗滌6次后用化學發光底物顯色，用凝膠成像儀采集圖像。
1.3.3 mmLFA3Sh-Ig的分離純化
選擇表達量高的菌株大量生產蛋白。將菌株接種于1000 mL BMGY培養基中，28℃，280 r/min培養至A600nm=2~6，然后收集菌體懸浮于100 mL BMMY培養基(含3%甲醇)中誘導72 h。4℃離心(16 000 g，15 min)收集上清，并以磷酸緩沖液(20 mmol/L，pH7.2，150 mmol/L NaCl)于4℃透析過夜。用磷酸鹽緩沖液平衡Protein A-CL-Sepharose親和層析柱，待電導、A280nm、pH值穩定后上樣，流速為3 mL/min。進樣完畢，用磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH7.2，300 mmol/L NaCl)將雜蛋白洗去，再用Glycine-HCl(0.1 mol/L，pH3.6)進行洗脫，按500μL/管收集。為避免酸性環境下蛋白失活，在收集管中預先加入50μL Tris-HCl(1 mol/L，pH8.0)。純化后的蛋白用細胞培養專用PBS(137 mmol/L NaCl，2.68 mmol/L KCl，8.1 mmol/L Na2HPO4，1.47 mmol/L KH2PO4)4℃透析過夜。取10μL樣品分別用含和不含2-ME的上樣緩沖液處理后進行SDS-PAGE電泳。凝膠濃度和電壓條件同1.3.2。電泳結束，凝膠用考馬斯亮藍染色顯示蛋白條帶，并用凝膠成像儀采集圖像。其余樣品過濾滅菌分裝并貯存于-80℃備用。
1.3.4 mmLFA3Sh-Ig的FITC標記
mmLFA3Sh-Ig蛋白用1 mol/L Na2CO3調節至pH8.5左右。然后將其與溶于二甲基甲酰胺的FITC(fluorescein isothiocyanate，10 mg/mL)按物質的量之比1 :24混合，室溫避光反應1 h。反應結束后用PBS于4℃透析去除游離FITC，直至透析外液A495nm＜0.001。透析后的蛋白分裝于-80℃貯存。
1.3.5 mmLFA3Sh-Ig與細胞結合
FITC標記的anti-CD2抗體購自BD公司，Jurkat，Raji細胞按照ATCC官網上描述的條件進行培養。Jurkat和Raji細胞均用含有0.5%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的PBS洗滌兩次。細胞計數后，每2×105個細胞用100μL含有0.5% FBS的PBS重懸。向兩種細胞中加入FITC標記的anti-CD2抗體或mmLFA3Sh-Ig，37℃結合1 h。細胞再用含0.5% FBS的PBS洗滌2次(600 g，3 min)，以羊抗鼠IgG抗體作為對照，用流式細胞分析儀檢測。
1.3.6 BrdU檢測mmLFA3Sh-Ig對淋巴細胞增殖的抑制效果
Con A可刺激淋巴細胞增殖，是最常用的淋巴細胞增殖抑制測試體系。混合淋巴細胞反應(Mixed Lymphocyte Reaction, MLR)體系能模擬移植排斥，是常規免疫抑制體外測試模型。本文用Con A和MLR兩種體系測試mmLFA3Sh-Ig的生物活性。抽取恒河猴和人血液，用Ficoll液分離獲取外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclearcells, PBMCs)。在Con A體系中，取2.5×105個細胞接種于96孔板，然后用Con A(5μg/mL)刺激培養。在0 d時加入不同濃度(0、2.5、5、10、20、40或80μg/mL)的mmLFA3Sh-Ig，3 d后用BrdU檢測其對淋巴細胞增殖的抑制效果。在MLR體系中，以5×105個淋巴細胞作為效應細胞，用同樣數目的同種異體淋巴細胞[經50μg/mL絲裂霉素C(mitomycin C，MMC)，37℃處理30 min]作為刺激細胞。效應細胞與刺激細胞懸浮于200μL培養基中，96孔板中共培養。0 d時加入不同濃度(0、2.5、5、10、20、40或80μg/mL)mmLFA3Sh-Ig，5 d后用BrdU檢測其對淋巴細胞增殖的抑制效果。BrdU摻入時間為2~24 h，以蛋白濃度為0μg/mL(加入等體積PBS)的孔中細胞Brdu攝取量為100%。所有操作按照試劑盒說明書進行，重復三次。
2 結果
2.1 pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig重組表達質粒的構建
以優化過后的mmLFA3基因為模板，PCR擴增獲得的片段位于250~500 bp[圖 1(a)]，與預期分子量大小相符。經DNA測序驗證，基因片段大小為306 bp，序列與mmLFA3Sh序列一致。將經過EcoRⅠ和AvrⅡ雙酶切后的mmLFA3Sh片段與pPIC9K-Fc質粒載體連接。獲得的質粒再經EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，電泳顯示酶切產物大于1 000 bp[圖 1(b)，泳道2]。進一步測序確定該片段包含mmLFA3Sh和IgG Fc基因，表明mmLFA3Sh與IgG1 Fc連接成功。該表達質粒命名為pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig，框架如圖 1(c)所示。
圖1
pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表達質粒構建
(a)mmLFA3Sh基因的PCR擴增；M：DNA分子量標準；1：mmLFA3Sh基因擴增產物; (b)質粒酶切鑒定；M：DNA分子量標準；1：pPIC9K-mmLFA3FL-Ig對照質粒；2：pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表達質粒；(c) pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表達質粒結構示意圖
Figure1. Construction of pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig expression plasmid(a) PCR amplification of mmLFA3Sh gene; M: DNA marker; 1: PCR product of mmLFA3Sh; (b) digestion of pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig plasmid with
2.2 pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig陽性克隆篩選及表達純化
隨機挑取7個克隆用PCR擴增檢查mmLFA3Sh-Ig基因整合情況。電泳顯示從6個克隆中擴增出基因片段[圖 2(a)]。DNA測序確定該片段大小為1 100 bp，是mmLFA3Sh-Ig編碼基因。進一步對這6個陽性克隆菌株目的蛋白表達進行檢測。Western blot分析發現，所有菌株發酵液中均顯示出與目的蛋白大小(35 kD)相近的蛋白條帶，提示mmLFA3Sh-Ig在這些菌株中可以獲得表達。相同條件下，6號菌株目的蛋白表達量最高[圖 2(b)]。
圖2
mmLFA3Sh-Ig陽性克隆篩選和純化蛋白電泳
(a)PCR鑒定mmLFA3Sh-Ig基因在不同克隆(1~7)的插入；(b)Western blot分析檢測陽性克隆中mmLFA3Sh-Ig蛋白的表達；(c)純化后mmLFA3Sh-Ig的SDS-PAGE電泳；M:蛋白質分子量標準；1:樣品含2-ME；2：樣品不含2-ME
Figure2. Screening of mmLFA3Sh-Ig-productive colonies and SDS-PAGE of purified mmLFA3Sh-Ig(a) PCR amplification of mmLFA3Sh-Ig in different colonies(1~7); (b) Western blot assays for mmLFA3Sh-Ig expression in PCR-identified colonies; (c) SDS-PAGE of purified mmLFA3Sh-Ig in the presence (+) or absence (-) of 2-ME
利用6號菌株進行蛋白的大量表達和純化。純化后的mmLFA3Sh-Ig與含和不含2-巰基乙醇(2-ME)的上樣緩沖液混合后電泳。結果如圖 2(c)所示，mmLFA3Sh-Ig在有2-ME條件下顯示為單帶，分子量大約為35 kD。在無2-ME條件下，mmLFA3Sh-Ig顯示為兩條帶，分子量相當于單體和二聚體。IgG1 Fc段有通過分子間二硫鍵形成二聚體的能力。因此，電泳結果提示部分mmLFA3Sh-Ig可能在分子內Fc段的作用下形成二聚體。分離純化結果表明，從1 L誘導培養基中能獲得3~4 mg純度為80%左右的mmLFA3Sh-Ig蛋白。
2.3 mmLFA3Sh-Ig與細胞的結合
流式細胞儀檢測發現，Anti-CD2抗體與Jurkat，Raji細胞孵育后，陽性率分別是99.7%和2%，驗證了Jurkat是CD2陽性細胞，而Raji是CD2陰性細胞[圖 3(a)]。mmLFA3Sh-Ig蛋白與Jurkat和Raji細胞孵育后，陽性率分別為66.7%和5% [圖 3(b)]，結果顯示mmLFA3Sh-Ig能夠與CD2陽性細胞Jurkat結合，不與CD2陰性細胞Raji結合。
圖3
蛋白與細胞的結合
(a)anti-CD2和細胞的結合；(b)mmLFA3Sh-Ig和細胞的結合
Figure3. Binding of proteins to Jurkat and Raji cells(a) the binding of anti-CD2 to Jurkat and Raji cells; (b) the binding of mmLFA3Sh-Ig to Jurkat and Raji cells
2.4 mmLFA3Sh-Ig對淋巴細胞增殖的抑制
如圖 4所示，在Con A刺激的淋巴細胞增殖系統中，隨著mmLFA3Sh-Ig蛋白濃度的增加，淋巴細胞的增殖越來越少，這表明mmLFA3Sh-Ig具有劑量依賴的淋巴細胞增殖抑制活性。當蛋白濃度從2.5μg/mL提高到80μg/mL時，抑制率從14%提高到56%。在MLR體系中，mmLFA3Sh-Ig同樣顯示了對人和猴淋巴細胞增殖的劑量依賴性抑制作用。而且，當蛋白濃度為80μg/mL時，mmLFA3Sh-Ig對恒河猴淋巴細胞增殖的抑制率達到了75%，而對人淋巴細胞增殖的抑制率為55%，兩者有明顯差異，提示LFA3有一定的種屬特異性。但是，mmLFA3Sh-Ig對Con A刺激的人和猴淋巴細胞增殖抑制沒有明顯差別。這可能是由于Con A刺激淋巴細胞增殖主要依賴絲裂原受體途徑而非MLR反應的抗原遞呈所致。
圖4
mmLFA3Sh-Ig在Con A和MLR系統中對淋巴細胞增殖的抑制作用
Figure4.
Ability of mmLFA3Sh-Ig to suppress the proliferation of lymphocytes in Con A and MLR system
3 討論
目前，與IgG1 Fc段融合表達是多數共刺激分子功能區段的優選策略。為驗證mmLFA3Sh區域的功能，本實驗同樣選擇了將mmLFA3的CD2結合域mmLFA3Sh區域與IgG1 Fc融合[圖 1(c)]。實驗中，我們用畢赤酵母成功表達了mmLFA3Sh-Ig融合蛋白。SDS-PAGE電泳結果顯示，mmLFA3Sh-Ig在溶液中多數以二聚體形式存在[圖 2(c)]，這說明與mmLFA3Sh融合的Fc段發揮了聚合作用。因為天然LFA3是以二聚體形式發揮功能的[19]，所以二聚體形式的mmLFA3Sh-Ig也能更好的模擬天然mmLFA3。
mmLFA3Sh-Ig能夠與CD2陽性Jurkat細胞結合，而不與CD2陰性Raji細胞結合，提示mmLFA3Sh具有CD2結合能力。體外實驗發現，mmLFA3Sh-Ig在Con A和MLR體系中均顯示劑量依賴性的淋巴細胞增殖抑制作用(圖 4)，提示了mmLFA3Sh-Ig可能通過干擾LFA3-CD2共刺激信號通路而顯示免疫抑制。但已有研究對hLFA3胞外段CD2結合域重組蛋白(Alefacept)的研究表明，Alefacept體內條件下主要依賴Fc介導的細胞毒作用清除記憶性T細胞而顯示免疫抑制[20-22]。對于酵母生產的mmLFA3Sh-Ig是否有同樣的功能，還需進一步實驗證明。盡管如此，mmLFA3Sh-Ig對同種抗原刺激的恒河猴淋巴細胞增殖抑制強于對人淋巴細胞的增殖抑制，不僅提示猴和人免疫系統的差別，還提示我們在恒河猴免疫疾病模型中，最好用mmLFA3來探討LFA3-CD2共刺激信號通路介導的發病機制或進行實驗免疫治療。
