人脂肪干細胞(hADSCs)的成軟骨潛能是近年來組織工程學研究的熱點之一,而生長因子是誘導hADSCs向軟骨細胞分化的關鍵因素。目前用于軟骨誘導的生長因子多來自轉化生長因子(TGF)-β超家族,其中以TGF-β1/3最為常見。但hADSCs與人骨髓干細胞(hBMSCs)對TGF-β的反應存在差異,且研究發現,骨形態發生蛋白-6(BMP-6)可以顯著上調hADSCs的TGF-β Ⅰ型受體的表達水平,因此傳統的hBMSCs軟骨誘導液未必同樣適合hADSCs。于是本文結合近年來的相關研究,對用于hADSCs成軟骨誘導的生長因子做一綜述。
引用本文： 楊午, 劉暢. 生長因子對人脂肪干細胞成軟骨誘導作用研究. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(6): 1409-1413. doi: 10.7507/1001-5515.20140267 復制
引言
人脂肪干細胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs)可在生長因子、三維培養(細胞微團或三維生物支架)、低氧張力以及適當的機械力刺激等條件下向軟骨細胞分化[1]。本文將著重討論生長因子對三維培養的hADSCs的成軟骨誘導作用。這些生長因子主要包括轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成員如TGF-β1、2、3和骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)-2、4、6、7、9，胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)，成纖維細胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)和甲狀旁腺素相關肽(parathyroid hormone related peptide,PTHrP)等。
1 軟骨缺損修復的治療現狀
關節軟骨(articular cartilage,AC)組織不含血管，軟骨細胞密度較低且含有豐富的細胞外基質，以上特性決定了AC很難自行修復缺損[2]。骨關節炎(osteoarthritis,OA)是在老年人中最常見的骨骼-肌肉系統疾病，也是導致關節軟骨退行性變的主要原因。目前治療OA的主要手段是藥物介入和關節置換術，但由于這兩種治療方法存在種種局限性，因此以軟骨細胞/間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)自體/異體移植術為代表的軟骨組織重建技術逐漸被越來越多的學者關注。目前軟骨細胞移植術在臨床上應用較多且獲得一定成果，但從活體中能夠獲取的關節軟骨組織量十分有限，而為獲得足夠的細胞數量所進行的體外擴增培養往往會導致軟骨細胞去分化；同時，該方法可能會導致供區并發癥[3]。因此，以MSCs為種子細胞的軟骨組織工程學近年來得到廣泛關注，而生長因子在MSCs軟骨誘導中起著不可忽視的作用[2]。
2 hADSC成軟骨誘導
MSCs可從多種組織，如骨髓、脂肪、滑膜、肌肉和骨膜中分離得到，且具有多向分化功能[4]。其中，對骨髓干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)和脂肪干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的研究較為深入。hBMSCs雖然具有較好的成軟骨特性，但其常用獲取手段骨髓穿刺術本身帶給患者的痛苦和風險是不容忽視的；同時，與脂肪組織相比，骨髓組織所含干細胞密度較低：在脂肪組織中，每5 000個單核細胞中有100個干細胞，而在骨髓組織中，每5 000個單核細胞中只有1個干細胞[1]。因此，ADSCs自2001年被發現并證實其多向分化功能后，就引起廣泛的關注[5]。
許多研究已經證明，hADSCs與hBMSCs一樣，擁有活躍的成軟骨、成骨、成肌、成肌腱、成神經元以及成脂分化潛能。然而套用hBMSCs軟骨誘導液誘導hADSCs的結果并不理想，這說明兩種不同來源的MSCs向軟骨分化所需的條件有所不同。例如，有實驗證明向誘導液中添加BMP-6可以大幅提高hADSCs的成軟骨潛能，使其大量表達軟骨特異性標志物如Ⅱ型膠原(collagen type Ⅱ,COL-Ⅱ)和蛋白聚糖(aggrecan)，且基因表達譜與經TGF-β單一誘導后的hBMSCs相似[6]。這說明，雖然hADSCs與hBMSCs是兩種極為相似的MSCs,但二者卻對生長因子有著不同的應答反應。目前hADSCs軟骨誘導液是在hBMSCs軟骨誘導液配方的基礎上增加(減少)某些組分，或改變各組分之間配比得來的，其誘導效果不盡相同。我們結合已發表的研究成果，總結出各個學者在誘導hADSCs成軟骨時所添加的生長因子及其它可溶性成分(見表 1)。
3 TGF-β超家族
TGF-βs超家族含有30余種成員，包括TGF-βs、BMPs、生長分化因子(growth differentiation factors,GDFs)、激活素和Nodal蛋白，在維持胚胎正常發育和機體穩態中起著極其重要的作用[19]。
3.1 TGF-βs
TGF-β1是應用最早且應用范圍最廣的軟骨誘導因子，Bahney等[20]于1998年利用TGF-β1通過團塊培養方式成功誘導兔BMSCs向軟骨分化。Puetzer等[21]通過劑量反應實驗證明當濃度為10 ng/mL時，hADSCs的誘導效率最高。但Yu等[13]證明，hADSCs僅在TGF-β1的作用下并不能達到理想的分化效果，還需佐以適當的機械力刺激。TGF-β3在細胞分化和成軟骨中的作用首次于1986年提出[22]。實驗證明對hBMSCs而言，TGF-β3的軟骨誘導效應強于TGF-β1：hBMSCs微球在軟骨誘導液中誘導21 d后，TGF-β3誘導組表達的COL-Ⅱ和aggrecan量均高于TGF-β1誘導組[23]。很多研究者認為這個規律同樣適用于hADSCs，然而Estes等[8]的實驗結果卻證明并非如此。他們將干細胞軟骨誘導液中的TGF-β1換成TGF-β3后，并未提高誘導后hADSCs中COL-Ⅱ和aggrecan的表達水平，而該現象背后的具體機制還有待進一步研究。
表1
相關試驗中hADSCs軟骨誘導液可溶性因子添加情況分析
Table1.
Breakdown of different media and supplements used by relevant articles to induce chondrogenesis in hADSCs
3.2 BMPs
BMPs與TGF-βs同屬TGF-β超家族，且在軟骨修復方面發揮著重要作用[24]。Yoon等[11]證明50 ng/mL的BMP-2可在透明質酸支架體系中成功誘導hADSCs向軟骨細胞分化。另有研究表明，在hADSCs藻酸鹽微球誘導體系中單獨加入500 ng/mL的BMP-6可大幅提高AGC1和COL2A1基因的表達,同時抑制軟骨細胞肥大標志物COL10A1B基因表達[7]。然而也有學者指出BMPs不足以單獨誘導hADSCs向軟骨細胞分化。該研究對BMP-2、4、6或7(10 ng/mL)單獨誘導6周的hADSCs微球行COL-Ⅱ免疫組化染色，結果顯示為陰性，而若向該體系中補充10 ng/mL的TGF-β3，則結果顯示為陽性(BMP-7組除外)，且經RT-PCR證實COL2A1 mRNA大量表達[6]。
通過瀏覽文獻，我們總結出近年來較為流行的觀點--10 ng/mL的TGF-β3與10 ng/mL的BMP-6是誘導hADSCs向軟骨細胞分化的“黃金搭檔”，不僅可以充分誘導hADSCs表達COL-Ⅱ和aggrecan等，還能有效控制軟骨細胞肥大化標志物--COL-Ⅹ的表達 [6, 8-9, 16, 18]。
4 其他可溶性因子
4.1 IGF-1
Park等[25]認為IGF-1能通過獨立于TGF-β的作用機制誘導BMSCs向軟骨細胞分化。另有學者認為雖然IGF單獨作用時誘導效果甚微，但它可以通過協同作用強化TGF-β的誘導結果,使細胞外基質的合成有所增加[6, 17]。Hennig等證實IGF-1(10 ng/mL)不能使hADSCs向軟骨分化，但卻可以增強TGF-β3的誘導效果。然而Estes等[8]卻認為IGF-1(100 ng/mL)會抑制hADSCs向軟骨細胞分化。他們通過對TGF-β3、TGF-β3+IGF-1以及TGF-β3+ IGF-1+BMP-6這三種不同組合方式的誘導結果進行比較分析，提出IGF-1可在一定程度上抑制TGF-β3的軟骨誘導效應，而BMP-6則可取消該種抑制作用。我們認為，或許是IGF-1的添加濃度不同導致學者們得出以上兩種不同結論。
4.2 FGF-2
有實驗結果表明，在平面擴增期添加FGF-2不僅能提高hADSCs的增殖速率，更能提高其成軟骨潛能[26]。但也有學者指出，在TGF-β3、BMP-6的聯合誘導過程中加入FGF-2卻會減弱COL-Ⅱ和糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)等軟骨特異性標志物的表達[27]。這提示我們FGF-2的添加時間對誘導結果有著重要影響。
4.3 PTHrP
PTHrP在hADSCs成軟骨誘導中的應用還存在爭議。有學者指出，軟骨細胞自身分泌的PTHrP是軟骨作用液(chondrocyte-conditioned medium)有效控制MSCs誘導后肥大的主要原因[1]。的確，在軟骨誘導液中添加濃度為10 ng/mL的PTHrP能夠顯著抑制COL10A1 mRNA表達，但同時也降低了COL2A1 mRNA的表達水平。針對該現象有學者提出周期性添加PTHrP，也許既可以抑制MSCs被誘導后的早期肥大，又不影響軟骨特異性標志物的表達水平[28]。
5 生長因子的時序效應
TGF-β超家族成員具體通過怎樣的級聯轉錄機制調節MSCs向軟骨分化，目前尚處于探索階段。早前Indrawattana等[29]為了探索這種級聯關系進行了如下實驗：建立hBMSCs微球誘導體系后，前4 d向誘導液中添加TGF-β3，后3 d向誘導液中添加BMP-6，如此循環3個周期。通過RT-PCR和組織特染等檢測手段證明，該誘導方法下hBMSCs的COL-Ⅱ、GAGs表達水平均高于TGF-β持續誘導21 d組。Hennig等[6]通過RT-PCR、Western blot和cDNA芯片技術分析誘導前后的hADSCs和hBMSCs后發現：與hBMSCs不同，未經誘導的hADSCs幾乎不表達BMPs和TGF-β Ⅰ型受體(TGF-β RⅠ)，而TGF-β需要通過TGF-βRⅠ/TGF-β RⅡ形成的異二聚體激活Smads通路[30-31]。該結論也許可以解釋為什么hADSCs對TGF-β的應答遠不如hBMSCs強烈。而如果在hADSCs平面擴增階段就添加BMP-6，細胞表面就會表達TGF-βRⅠ[6]，這提示我們BMPs對hADSCs軟骨分化的必要性。
到目前為止，BMP-6和TGF-β3似乎是體外誘導hADSCs成軟骨的最佳配伍方式。如果誘導液中缺失BMP-6，將會導致COL-Ⅱ和GAGs表達量的大幅下降。不過含有BMP-6的誘導液在增加軟骨特異性標志物表達的同時，也會使COL-Ⅹ表達大幅上調，而僅含TGFβ-3和地塞米松的誘導液卻不會產生這種作用[6]。因此,何時添加BMP-6以及BMP-6作用持續時間的長短，都有待進一步研究以優化hADSCs軟骨誘導方案。
6 小結
hADSCs最終是否能夠作為種子細胞應用于臨床的軟骨缺損修復治療，主要取決于hADSCs工程軟骨組織能否在體內長期保持令人滿意的功能。然而現有的生長因子或其它可溶性因子很難將hADSCs誘導為表型及功能都穩定的關節軟骨樣細胞。hADSCs的成軟骨誘導效率和誘導環境(如生長因子、細胞因子等)以及理化因素(如機械載荷、氧張力、培養液pH值、生物基質等)息息相關。因此，一方面我們應當進一步優化現有的可溶性生長因子誘導方案，與此同時，將傳統的生物化學誘導方法與適當的機械力刺激以及理想的生物基質等誘導因素結合起來也許會讓我們看到更穩定的誘導結果。
引言
人脂肪干細胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs)可在生長因子、三維培養(細胞微團或三維生物支架)、低氧張力以及適當的機械力刺激等條件下向軟骨細胞分化[1]。本文將著重討論生長因子對三維培養的hADSCs的成軟骨誘導作用。這些生長因子主要包括轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成員如TGF-β1、2、3和骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)-2、4、6、7、9，胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)，成纖維細胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)和甲狀旁腺素相關肽(parathyroid hormone related peptide,PTHrP)等。
1 軟骨缺損修復的治療現狀
關節軟骨(articular cartilage,AC)組織不含血管，軟骨細胞密度較低且含有豐富的細胞外基質，以上特性決定了AC很難自行修復缺損[2]。骨關節炎(osteoarthritis,OA)是在老年人中最常見的骨骼-肌肉系統疾病，也是導致關節軟骨退行性變的主要原因。目前治療OA的主要手段是藥物介入和關節置換術，但由于這兩種治療方法存在種種局限性，因此以軟骨細胞/間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)自體/異體移植術為代表的軟骨組織重建技術逐漸被越來越多的學者關注。目前軟骨細胞移植術在臨床上應用較多且獲得一定成果，但從活體中能夠獲取的關節軟骨組織量十分有限，而為獲得足夠的細胞數量所進行的體外擴增培養往往會導致軟骨細胞去分化；同時，該方法可能會導致供區并發癥[3]。因此，以MSCs為種子細胞的軟骨組織工程學近年來得到廣泛關注，而生長因子在MSCs軟骨誘導中起著不可忽視的作用[2]。
2 hADSC成軟骨誘導
MSCs可從多種組織，如骨髓、脂肪、滑膜、肌肉和骨膜中分離得到，且具有多向分化功能[4]。其中，對骨髓干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)和脂肪干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的研究較為深入。hBMSCs雖然具有較好的成軟骨特性，但其常用獲取手段骨髓穿刺術本身帶給患者的痛苦和風險是不容忽視的；同時，與脂肪組織相比，骨髓組織所含干細胞密度較低：在脂肪組織中，每5 000個單核細胞中有100個干細胞，而在骨髓組織中，每5 000個單核細胞中只有1個干細胞[1]。因此，ADSCs自2001年被發現并證實其多向分化功能后，就引起廣泛的關注[5]。
許多研究已經證明，hADSCs與hBMSCs一樣，擁有活躍的成軟骨、成骨、成肌、成肌腱、成神經元以及成脂分化潛能。然而套用hBMSCs軟骨誘導液誘導hADSCs的結果并不理想，這說明兩種不同來源的MSCs向軟骨分化所需的條件有所不同。例如，有實驗證明向誘導液中添加BMP-6可以大幅提高hADSCs的成軟骨潛能，使其大量表達軟骨特異性標志物如Ⅱ型膠原(collagen type Ⅱ,COL-Ⅱ)和蛋白聚糖(aggrecan)，且基因表達譜與經TGF-β單一誘導后的hBMSCs相似[6]。這說明，雖然hADSCs與hBMSCs是兩種極為相似的MSCs,但二者卻對生長因子有著不同的應答反應。目前hADSCs軟骨誘導液是在hBMSCs軟骨誘導液配方的基礎上增加(減少)某些組分，或改變各組分之間配比得來的，其誘導效果不盡相同。我們結合已發表的研究成果，總結出各個學者在誘導hADSCs成軟骨時所添加的生長因子及其它可溶性成分(見表 1)。
3 TGF-β超家族
TGF-βs超家族含有30余種成員，包括TGF-βs、BMPs、生長分化因子(growth differentiation factors,GDFs)、激活素和Nodal蛋白，在維持胚胎正常發育和機體穩態中起著極其重要的作用[19]。
3.1 TGF-βs
TGF-β1是應用最早且應用范圍最廣的軟骨誘導因子，Bahney等[20]于1998年利用TGF-β1通過團塊培養方式成功誘導兔BMSCs向軟骨分化。Puetzer等[21]通過劑量反應實驗證明當濃度為10 ng/mL時，hADSCs的誘導效率最高。但Yu等[13]證明，hADSCs僅在TGF-β1的作用下并不能達到理想的分化效果，還需佐以適當的機械力刺激。TGF-β3在細胞分化和成軟骨中的作用首次于1986年提出[22]。實驗證明對hBMSCs而言，TGF-β3的軟骨誘導效應強于TGF-β1：hBMSCs微球在軟骨誘導液中誘導21 d后，TGF-β3誘導組表達的COL-Ⅱ和aggrecan量均高于TGF-β1誘導組[23]。很多研究者認為這個規律同樣適用于hADSCs，然而Estes等[8]的實驗結果卻證明并非如此。他們將干細胞軟骨誘導液中的TGF-β1換成TGF-β3后，并未提高誘導后hADSCs中COL-Ⅱ和aggrecan的表達水平，而該現象背后的具體機制還有待進一步研究。
表1
相關試驗中hADSCs軟骨誘導液可溶性因子添加情況分析
Table1.
Breakdown of different media and supplements used by relevant articles to induce chondrogenesis in hADSCs
3.2 BMPs
BMPs與TGF-βs同屬TGF-β超家族，且在軟骨修復方面發揮著重要作用[24]。Yoon等[11]證明50 ng/mL的BMP-2可在透明質酸支架體系中成功誘導hADSCs向軟骨細胞分化。另有研究表明，在hADSCs藻酸鹽微球誘導體系中單獨加入500 ng/mL的BMP-6可大幅提高AGC1和COL2A1基因的表達,同時抑制軟骨細胞肥大標志物COL10A1B基因表達[7]。然而也有學者指出BMPs不足以單獨誘導hADSCs向軟骨細胞分化。該研究對BMP-2、4、6或7(10 ng/mL)單獨誘導6周的hADSCs微球行COL-Ⅱ免疫組化染色，結果顯示為陰性，而若向該體系中補充10 ng/mL的TGF-β3，則結果顯示為陽性(BMP-7組除外)，且經RT-PCR證實COL2A1 mRNA大量表達[6]。
通過瀏覽文獻，我們總結出近年來較為流行的觀點--10 ng/mL的TGF-β3與10 ng/mL的BMP-6是誘導hADSCs向軟骨細胞分化的“黃金搭檔”，不僅可以充分誘導hADSCs表達COL-Ⅱ和aggrecan等，還能有效控制軟骨細胞肥大化標志物--COL-Ⅹ的表達 [6, 8-9, 16, 18]。
4 其他可溶性因子
4.1 IGF-1
Park等[25]認為IGF-1能通過獨立于TGF-β的作用機制誘導BMSCs向軟骨細胞分化。另有學者認為雖然IGF單獨作用時誘導效果甚微，但它可以通過協同作用強化TGF-β的誘導結果,使細胞外基質的合成有所增加[6, 17]。Hennig等證實IGF-1(10 ng/mL)不能使hADSCs向軟骨分化，但卻可以增強TGF-β3的誘導效果。然而Estes等[8]卻認為IGF-1(100 ng/mL)會抑制hADSCs向軟骨細胞分化。他們通過對TGF-β3、TGF-β3+IGF-1以及TGF-β3+ IGF-1+BMP-6這三種不同組合方式的誘導結果進行比較分析，提出IGF-1可在一定程度上抑制TGF-β3的軟骨誘導效應，而BMP-6則可取消該種抑制作用。我們認為，或許是IGF-1的添加濃度不同導致學者們得出以上兩種不同結論。
4.2 FGF-2
有實驗結果表明，在平面擴增期添加FGF-2不僅能提高hADSCs的增殖速率，更能提高其成軟骨潛能[26]。但也有學者指出，在TGF-β3、BMP-6的聯合誘導過程中加入FGF-2卻會減弱COL-Ⅱ和糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)等軟骨特異性標志物的表達[27]。這提示我們FGF-2的添加時間對誘導結果有著重要影響。
4.3 PTHrP
PTHrP在hADSCs成軟骨誘導中的應用還存在爭議。有學者指出，軟骨細胞自身分泌的PTHrP是軟骨作用液(chondrocyte-conditioned medium)有效控制MSCs誘導后肥大的主要原因[1]。的確，在軟骨誘導液中添加濃度為10 ng/mL的PTHrP能夠顯著抑制COL10A1 mRNA表達，但同時也降低了COL2A1 mRNA的表達水平。針對該現象有學者提出周期性添加PTHrP，也許既可以抑制MSCs被誘導后的早期肥大，又不影響軟骨特異性標志物的表達水平[28]。
5 生長因子的時序效應
TGF-β超家族成員具體通過怎樣的級聯轉錄機制調節MSCs向軟骨分化，目前尚處于探索階段。早前Indrawattana等[29]為了探索這種級聯關系進行了如下實驗：建立hBMSCs微球誘導體系后，前4 d向誘導液中添加TGF-β3，后3 d向誘導液中添加BMP-6，如此循環3個周期。通過RT-PCR和組織特染等檢測手段證明，該誘導方法下hBMSCs的COL-Ⅱ、GAGs表達水平均高于TGF-β持續誘導21 d組。Hennig等[6]通過RT-PCR、Western blot和cDNA芯片技術分析誘導前后的hADSCs和hBMSCs后發現：與hBMSCs不同，未經誘導的hADSCs幾乎不表達BMPs和TGF-β Ⅰ型受體(TGF-β RⅠ)，而TGF-β需要通過TGF-βRⅠ/TGF-β RⅡ形成的異二聚體激活Smads通路[30-31]。該結論也許可以解釋為什么hADSCs對TGF-β的應答遠不如hBMSCs強烈。而如果在hADSCs平面擴增階段就添加BMP-6，細胞表面就會表達TGF-βRⅠ[6]，這提示我們BMPs對hADSCs軟骨分化的必要性。
到目前為止，BMP-6和TGF-β3似乎是體外誘導hADSCs成軟骨的最佳配伍方式。如果誘導液中缺失BMP-6，將會導致COL-Ⅱ和GAGs表達量的大幅下降。不過含有BMP-6的誘導液在增加軟骨特異性標志物表達的同時，也會使COL-Ⅹ表達大幅上調，而僅含TGFβ-3和地塞米松的誘導液卻不會產生這種作用[6]。因此,何時添加BMP-6以及BMP-6作用持續時間的長短，都有待進一步研究以優化hADSCs軟骨誘導方案。
6 小結
hADSCs最終是否能夠作為種子細胞應用于臨床的軟骨缺損修復治療，主要取決于hADSCs工程軟骨組織能否在體內長期保持令人滿意的功能。然而現有的生長因子或其它可溶性因子很難將hADSCs誘導為表型及功能都穩定的關節軟骨樣細胞。hADSCs的成軟骨誘導效率和誘導環境(如生長因子、細胞因子等)以及理化因素(如機械載荷、氧張力、培養液pH值、生物基質等)息息相關。因此，一方面我們應當進一步優化現有的可溶性生長因子誘導方案，與此同時，將傳統的生物化學誘導方法與適當的機械力刺激以及理想的生物基質等誘導因素結合起來也許會讓我們看到更穩定的誘導結果。
