利用糖蛋白4(PRG4)分子多態性的特點,克隆表達含有兩個人促細胞生成素B (SMB)結構域及少量糖基化重復序列的重組蛋白(SMBPRG4),并建立了成熟的純化工藝流程,可高效表達重組蛋白。進一步通過凝膠排阻、動態光散射實驗發現重組蛋白具有自我聚集的特點,在溶液中以穩定的二聚體形式存在。結構預測及非還原電泳揭示SMBPRG4是非共價結合的同源二聚體。
引用本文： 王黎芳, 韓之波, 陳文虎, 杜蓬, 孫愛華, 楊萍, 趙宏光. PRG4蛋白SMB結構域的表達及聚集現象研究. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(6): 1319-1324. doi: 10.7507/1001-5515.20140250 復制
引言
糖蛋白4(proteoglycan 4,PRG4)屬于細胞外基質蛋白，被鑒定為是巨核細胞生長刺激因子(megakaryocyte stimulating factor,MSF)和關節滑膜區糖蛋白。PRG4由dol54基因編碼，包含12個外顯子：第1外顯子為信號肽，第2、3外顯子為人促細胞生成素B(somatomedin B，SMB)同源結構域，第4外顯子為猜測的肝素結合區，第5外顯子為無功能卷曲片段，第6外顯子為糖基化重復序列。其中，SMB結構域是一個由39到51個氨基酸殘基構成，富含半胱氨酸的保守序列。除了PRG4外，SMB結構域還存在于血漿玻連蛋白(vitronectin,Vn)、胎盤蛋白11(placental protein 11,PP11)[1]和核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶(nucleotide pyrophosphatases/phosphodiesterases,NPPs)蛋白家族成員等蛋白中。其中，Vn、PRG4等蛋白均屬于細胞外基質(extra cellular matrix,ECM)蛋白，通過SMB結構域與一定的受體結合而促進腫瘤細胞黏附、轉移或者通過鏈間二硫鍵形成蛋白二聚體穩定蛋白構象。Vn多聚體聚集的動力來自于C末端肝素結合區的半胱氨酸所形成的鏈間二硫鍵[2]，而NPP1的多聚體形成動力則來自SMB結構域[3]。PRG4同樣也具有自我聚集的特點，其聚集的動力是否是SMB結構域尚未可知。
利用PRG4第3外顯子的特異性正向引物和第6外顯子的特異性反向引物，在關節炎患者病變的腱部以RT-PCR和Northern blot可以檢測到dol54基因的選擇性剪接產物。一個缺失第4外顯子，另一產物同時缺失第4、5外顯子，僅含兩個SMB結構域和少量糖基化重復序列 [4-7]。利用這對引物，本文擴增后者并克隆表達，以研究重組蛋白的聚集狀態，便于更好地理解SMB結構域在PRG4蛋白聚集行為中的功能。
1 材料與方法
1.1 表達載體的構建
以Generunner計算軟件輔助設計包含PRG4第2~5外顯子擴增產物的特異性引物。引物由上海Sangon公司合成，SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)純化。
SMBPRG4Fw：5′-CATG
NcoⅠ
SMBPRG4Rev：5′＇-CTAG
XhoⅠ
PCR擴增條件為94 ℃ 30 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30個循環后72 ℃ 10 min。336 bp的cDNA擴增產物膠回收純化后以NcoⅠ、XhoⅠ(Takara公司)雙酶切，T4 DNA連接酶(Invitrogen公司)連接入pET22b(+)質粒載體(Invitrogen公司)，CaCl2法轉化感受態大腸桿菌Rosetta(DE3)。藍白斑篩選陽性單克隆菌落，挑取菌落接種于3 mL氨芐抗性的LB培養基內，37 ℃振蕩培養過夜，提質粒。以NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切、菌體PCR鑒定連接轉染實驗成功。陽性克隆送上海博亞生物公司測序。
1.2 蛋白表達純化
3.7 L高密度發酵罐搖菌，1 mmol/L 異丙基硫代半乳糖苷誘導表達后收集菌體。8 000 r/min離心30 min收集菌體沉淀。按菌液∶破菌液=10∶1(V/V)的比例加入50 mmol/L Tris緩沖液(pH 8.0)混懸菌體，冰浴超聲。12 000 r/min離心30 min收集上清，內含融合蛋白。
Ni2+螯合層析柱純化融合蛋白：50 mmol/L Tris緩沖液(pH 8.0)、0.5 mol/L NaCl、160 mmol/L咪唑洗脫融合蛋白。50 mmol/L Tris緩沖液(pH8.0)透析洗脫產物以脫鹽，Lowry法進行蛋白定量。以1 mg蛋白3 U腸激酶(Invitrogen公司)4 ℃酶切融合蛋白16 h。
向酶切體系中加入1 mol/L NaCl至終濃度為0.5 mol/L。于Resource Q陰離子交換柱(Amersham Pharmasia Biotech公司)上樣，20 mmol/L Tris緩沖液(pH 8.0)、0~1 mol/L NaCl梯度洗脫，分離載體蛋白和目的蛋白及腸激酶。
Western blot操作檢測純化的目的蛋白，一抗為鼠抗(His)6·Tag單克隆抗體(Invitrogen公司)，二抗為HRP-標記的羊抗鼠IgG(北京中杉生物科技公司)，二氨基聯苯胺顯色。
1.3 重組蛋白分子量測定
Superdex 75凝膠排阻實驗：純化的重組蛋白透析到20 mmol/L Tris緩沖液(pH 8.0)，上樣于Superdex 75(Φ 1.0×60 cm)層析柱，以20 mmol/L Tris緩沖液(pH 8.0)、0.2 mol/L NaCl洗脫。IgG(150 kD)，牛血清白蛋白(67 kD)和溶菌酶(14.4 kD)為分子量外標蛋白。以分子量對數為Y值，分子量外標蛋白吸收峰保留體積(Ve)與預裝柱外水體積(Vo)的比值為X值，求線性回歸方程，計算重組目的蛋白的分子量。
動態光散射實驗：純化的重組蛋白PBS透析，調整濃度為1 mg/mL。超純水清洗比色杯，加雙蒸水12 μL檢測CountAvg值在4左右為合適。加樣品12 μL，于20 ℃記錄動態光散射信號，測20個循環。重復測定3次。用Protein Solution DynaPro軟件v5.24.02版本計算分子量。
1.4 聚集的動力預測
三級結構預測：向Swiss-Model同源建模服務器(http://swissmodel.expasy.org)提交SMBPRG4序列，采用First approach mode(簡捷模式)構建蛋白三維結構模型，以DeepView項目文件的方式返回模型和模板。向(http://www.bioinfo.rpi.edu/~bystrc/hmmstr/server.php) ROSSETA軟件提交SMBPRG4序列，構建蛋白三維結構模型。
還原-非還原電泳：Lowry法進行蛋白定量，同樣蛋白量，以6倍SDS含0.5 mol/L 二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)的樣品緩沖液和6倍SDS不含0.5 mol/L DTT的樣品緩沖液上樣，SDS-PAGE電泳。
2 結果
2.1 SMBPRG4克隆表達
表達的融合蛋白包含載體硫氧還蛋白(pI=5.48)、SMBPRG4蛋白(pI=6.39)和腸激酶(pI=4.59)，理論分子量30.4 kD。因為含有SMB結構域，電泳條帶位置偏高，位于36 kD處。如圖 1所示，各泳道分別代表：1為未誘導重組菌菌體蛋白液，2為誘導后菌體蛋白液，3為超聲破菌后上清液，4為Ni2+螯合層析柱載樣后的洗滌液，5為Ni2+螯合層析柱載樣后的洗脫液(可見目的融合蛋白)，M為marker。目的融合蛋白經過腸激酶酶切后，由于載體硫氧還蛋白、SMBPRG4蛋白和腸激酶的pI值不同，在陰離子交換柱上有不同的吸附能力而被洗脫分離。酶切純化后SMBPRG4單體理論分子量為12.9 kD，但是如圖 2所示，電泳結果表明條帶大小在15 kD左右，這一現象的形成是由于SMB結構域的存在[1]。兩個SMB結構域含有14個半胱氨酸，蛋白半胱氨酸含量過高時電泳遷移率和分子量之間不存在線性關系。Western blot結果進一步驗證目的蛋白的純化，其中1為陽性對照，2為陰性對照，3為目的蛋白(箭頭所示)，M為marker。
圖1
SMBPRG4融合蛋白表達
Figure1.
The expression of SMBPRG4 fusion protein
圖2
SMBPRG4純化
Figure2.
Analysis of SMBPRG4
2.2 SMBPRG4以二聚體形式存在
Superdex75(Φ 1.0×60 cm)分離范圍在3~70 kD 。SMBPRG4蛋白保留體積為42.61 mL，如圖 3所示，根據分子量標準蛋白的線性回歸方程計算出分子量為26.1 kD。相對于單體分子質量，蛋白表現出二聚體的特點。DLS測算其粒徑為2.302 nm，分子量為23.69 kD，進一步證實SMBPRG4是以一個有兩個SMB結構域的二聚體形式存在。
圖3
凝膠排阻實驗測定SMBPRG4蛋白分子量
Figure3.
Superdex 75 size-exclusion chromatogaraphy
2.3 SMBPRG4二聚體為非共價聚集體
雖然提交的是SMBPRG4的全長序列，但是Swiss-Model同源建模服務器僅返回了第一個SMB結構域的預測結構，第二結構域的預測結果由 ROSSETA軟件完成，如圖 4所示。兩個結構域的預測結果有巨大的差別，但均未出現游離的半胱氨酸，所有半胱氨酸均形成了鏈內二硫鍵，提示SMBPRG4的聚集可能與肽鏈間的二硫鍵無關。非還原電泳顯示DTT的存在與否不影響蛋白的解聚，SMBPRG4是以非共價的形式在溶液中自我聚集形成二聚體的，如圖 5所示，1為還原電泳，2為非還原電泳，M為marker。
圖4
預測的SMBPRG4各SMB結構域三維結構
Figure4.
Predicted 3D structure of SMB domain
圖5
SDS-PAGE檢測純化的SMBPRG4蛋白
Figure5.
SMBPRG4 analyzed by SDS-PAGE
3 討論
在ECM蛋白、蛋白多糖、黏液素蛋白中，mRNA的選擇性剪接造成蛋白分子的多態性比較普遍。白細胞P-選擇素配體-1(P-selectin glycoprotein ligand 1,PSGL-1)介導血細胞黏附于血管壁，存在三種選擇性剪接產物，分子的高度多態性造成了PSGL-1的結構多態性，使功能也表現多態性。PSGL-1全長蛋白胞內區有16個10氨基酸殘基長度的黏液素樣重復序列。PSGL-1A型為全長，B型缺失第二個重復序列，C型缺失第9和10重復序列。PSGL-1由鏈間二硫鍵形成二聚體，才能與P-選擇素相互作用[8]，但是此結論尚存爭議[9]。分子多態性導致PSGL-1分子內的配體結合區之間距離改變從而影響與P-選擇素的結合，進一步影響白細胞的功能[10]。PSGL-1的同源蛋白GPⅠbα分子多態性也是因為重復序列數目不同造成的[11]，并且這種分子多態性與疾病相關。PRG4蛋白同樣具有分子多態性的特點，這種選擇性剪接的現象在進化上是保守的。其分子多態性并不與結構中的黏液素樣重復序列相關，外顯子的缺失主要出現在5＇端。從再生障礙性貧血患者尿中提取的MSF/PRG4蛋白具有12個外顯子。RT-PCR和Northern blot顯示在滑膜成纖維細胞中表達的MSF有若干種不同形式的剪接體，但在這4種剪接體形式中，編碼SMB結構域的第3外顯子始終存在[5]，其功能與結構關系的研究對于闡述疾病的發生很有意義。由此，我們的研究著眼于PRG4蛋白的SMB結構域。利用基因的分子多態性，根據PRG4 mRNA選擇性剪接的產物，我們克隆出了僅含PRG4兩個SMB結構域和少量糖基化重復序列的重組SMBPRG4蛋白。凝膠排阻實驗顯示重組蛋白是一個同源二聚體。血漿中Vn蛋白N端含有44個氨基酸的SMB結構域在表達后，也有聚集成同源二聚體的特點[12]，二聚化進程可能是重組表達的SMB結構域的特點之一。
蛋白聚集的動力包括鏈間二硫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用等。真核表達帶有GFP標簽的重組人Muc2黏液素蛋白N端序列在胞內為單體形式，分泌后為由二硫鍵形成的三聚體，而且不是簡單的分子之間的線性排列[13]。血漿中的Vn是以單體形式存在的，而存在于ECM的Vn是多聚體，這一多聚體的形成與SMBVn中的二硫鍵無關，而是由于Vn C末端肝素結合區附近的游離Cys形成鏈間二硫鍵而導致多聚體的形成。肝素親和層析分離純化的Vn則能自發形成1 000 kD、10 nm直徑的多聚體[14]，這種多聚的動力來自于非共價鍵和二硫鍵。變性后再復性的Vn在生理鹽水狀態下自我聚集形成多聚體[2]。Vn形成多聚體過程開始時，分子之間的二硫鍵形成。NPPs蛋白的N端依次為胞內結構、穿膜序列和兩個SMB 結構域，C端為酶活性區和核酸酶樣區。SMBNPP1-3是NPPs蛋白形成同源二聚體的區域[3]。缺失核酸酶樣區或者是同時缺失前者與酶活中心，蛋白依然形成穩定的二聚體；但是缺失了兩個SMB結構域和它的旁側序列以后，蛋白就呈單體形式存在。單純缺失一個SMB結構域并不改變二聚體狀態。NPP1第二個SMB結構域C末端旁側序列中還含有兩個Cys殘基，此位點點突變后，這兩個Cys變成Ser，蛋白即呈單體形式存在；若只突變SMB的Cys或者是旁側序列的Cys都無法使蛋白解聚，這表明NPP1蛋白的SMB結構域及其C末端的旁側序列是二聚體形成的原因。Swiss-Model同源建模服務器返回了SMBPRG4第一個SMB結構域的預測結構。預測的SMBPRG4二硫鍵模式與分離自人血漿Vn SMB的51個氨基酸的模式相同，也與經內切蛋白酶Glu-C消化再由反相HPLC純化得到的55個氨基酸殘基的SMBVn二硫鍵模式一致：Cys5-Cys9，Cys19-Cys31，Cys21-Cys32，Cys25-Cys39。由于模型顯示肽鏈內不存在游離的巰基，我們推測SMBPEG4的二聚體動力并非是由于鏈間二硫鍵造成的。還原-非還原電泳結果顯示，DTT的存在與否不影響蛋白的解聚，重組SMBPRG4蛋白分子是以非共價的形式在溶液中自我聚集的。但是多角度激光光散射檢測牛軟骨細胞分泌的PRG4分子量時，發現了由二硫鍵共價形成的二聚體蛋白[15]。這或許與蛋白的種屬來源不同、一級結構有所差別有關。
本研究克隆表達了PRG4蛋白SMB結構域，重組蛋白是一個非共價結合的同源二聚體。與Vn、NPP1蛋白一樣，PRG4的SMB結構域同樣是蛋白聚集形成的動力之一。后續的研究將行半胱氨酸點突變，以進一步驗證我們的結論。
引言
糖蛋白4(proteoglycan 4,PRG4)屬于細胞外基質蛋白，被鑒定為是巨核細胞生長刺激因子(megakaryocyte stimulating factor,MSF)和關節滑膜區糖蛋白。PRG4由dol54基因編碼，包含12個外顯子：第1外顯子為信號肽，第2、3外顯子為人促細胞生成素B(somatomedin B，SMB)同源結構域，第4外顯子為猜測的肝素結合區，第5外顯子為無功能卷曲片段，第6外顯子為糖基化重復序列。其中，SMB結構域是一個由39到51個氨基酸殘基構成，富含半胱氨酸的保守序列。除了PRG4外，SMB結構域還存在于血漿玻連蛋白(vitronectin,Vn)、胎盤蛋白11(placental protein 11,PP11)[1]和核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶(nucleotide pyrophosphatases/phosphodiesterases,NPPs)蛋白家族成員等蛋白中。其中，Vn、PRG4等蛋白均屬于細胞外基質(extra cellular matrix,ECM)蛋白，通過SMB結構域與一定的受體結合而促進腫瘤細胞黏附、轉移或者通過鏈間二硫鍵形成蛋白二聚體穩定蛋白構象。Vn多聚體聚集的動力來自于C末端肝素結合區的半胱氨酸所形成的鏈間二硫鍵[2]，而NPP1的多聚體形成動力則來自SMB結構域[3]。PRG4同樣也具有自我聚集的特點，其聚集的動力是否是SMB結構域尚未可知。
利用PRG4第3外顯子的特異性正向引物和第6外顯子的特異性反向引物，在關節炎患者病變的腱部以RT-PCR和Northern blot可以檢測到dol54基因的選擇性剪接產物。一個缺失第4外顯子，另一產物同時缺失第4、5外顯子，僅含兩個SMB結構域和少量糖基化重復序列 [4-7]。利用這對引物，本文擴增后者并克隆表達，以研究重組蛋白的聚集狀態，便于更好地理解SMB結構域在PRG4蛋白聚集行為中的功能。
1 材料與方法
1.1 表達載體的構建
以Generunner計算軟件輔助設計包含PRG4第2~5外顯子擴增產物的特異性引物。引物由上海Sangon公司合成，SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)純化。
SMBPRG4Fw：5′-CATG
NcoⅠ
SMBPRG4Rev：5′＇-CTAG
XhoⅠ
PCR擴增條件為94 ℃ 30 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30個循環后72 ℃ 10 min。336 bp的cDNA擴增產物膠回收純化后以NcoⅠ、XhoⅠ(Takara公司)雙酶切，T4 DNA連接酶(Invitrogen公司)連接入pET22b(+)質粒載體(Invitrogen公司)，CaCl2法轉化感受態大腸桿菌Rosetta(DE3)。藍白斑篩選陽性單克隆菌落，挑取菌落接種于3 mL氨芐抗性的LB培養基內，37 ℃振蕩培養過夜，提質粒。以NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切、菌體PCR鑒定連接轉染實驗成功。陽性克隆送上海博亞生物公司測序。
1.2 蛋白表達純化
3.7 L高密度發酵罐搖菌，1 mmol/L 異丙基硫代半乳糖苷誘導表達后收集菌體。8 000 r/min離心30 min收集菌體沉淀。按菌液∶破菌液=10∶1(V/V)的比例加入50 mmol/L Tris緩沖液(pH 8.0)混懸菌體，冰浴超聲。12 000 r/min離心30 min收集上清，內含融合蛋白。
Ni2+螯合層析柱純化融合蛋白：50 mmol/L Tris緩沖液(pH 8.0)、0.5 mol/L NaCl、160 mmol/L咪唑洗脫融合蛋白。50 mmol/L Tris緩沖液(pH8.0)透析洗脫產物以脫鹽，Lowry法進行蛋白定量。以1 mg蛋白3 U腸激酶(Invitrogen公司)4 ℃酶切融合蛋白16 h。
向酶切體系中加入1 mol/L NaCl至終濃度為0.5 mol/L。于Resource Q陰離子交換柱(Amersham Pharmasia Biotech公司)上樣，20 mmol/L Tris緩沖液(pH 8.0)、0~1 mol/L NaCl梯度洗脫，分離載體蛋白和目的蛋白及腸激酶。
Western blot操作檢測純化的目的蛋白，一抗為鼠抗(His)6·Tag單克隆抗體(Invitrogen公司)，二抗為HRP-標記的羊抗鼠IgG(北京中杉生物科技公司)，二氨基聯苯胺顯色。
1.3 重組蛋白分子量測定
Superdex 75凝膠排阻實驗：純化的重組蛋白透析到20 mmol/L Tris緩沖液(pH 8.0)，上樣于Superdex 75(Φ 1.0×60 cm)層析柱，以20 mmol/L Tris緩沖液(pH 8.0)、0.2 mol/L NaCl洗脫。IgG(150 kD)，牛血清白蛋白(67 kD)和溶菌酶(14.4 kD)為分子量外標蛋白。以分子量對數為Y值，分子量外標蛋白吸收峰保留體積(Ve)與預裝柱外水體積(Vo)的比值為X值，求線性回歸方程，計算重組目的蛋白的分子量。
動態光散射實驗：純化的重組蛋白PBS透析，調整濃度為1 mg/mL。超純水清洗比色杯，加雙蒸水12 μL檢測CountAvg值在4左右為合適。加樣品12 μL，于20 ℃記錄動態光散射信號，測20個循環。重復測定3次。用Protein Solution DynaPro軟件v5.24.02版本計算分子量。
1.4 聚集的動力預測
三級結構預測：向Swiss-Model同源建模服務器(http://swissmodel.expasy.org)提交SMBPRG4序列，采用First approach mode(簡捷模式)構建蛋白三維結構模型，以DeepView項目文件的方式返回模型和模板。向(http://www.bioinfo.rpi.edu/~bystrc/hmmstr/server.php) ROSSETA軟件提交SMBPRG4序列，構建蛋白三維結構模型。
還原-非還原電泳：Lowry法進行蛋白定量，同樣蛋白量，以6倍SDS含0.5 mol/L 二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)的樣品緩沖液和6倍SDS不含0.5 mol/L DTT的樣品緩沖液上樣，SDS-PAGE電泳。
2 結果
2.1 SMBPRG4克隆表達
表達的融合蛋白包含載體硫氧還蛋白(pI=5.48)、SMBPRG4蛋白(pI=6.39)和腸激酶(pI=4.59)，理論分子量30.4 kD。因為含有SMB結構域，電泳條帶位置偏高，位于36 kD處。如圖 1所示，各泳道分別代表：1為未誘導重組菌菌體蛋白液，2為誘導后菌體蛋白液，3為超聲破菌后上清液，4為Ni2+螯合層析柱載樣后的洗滌液，5為Ni2+螯合層析柱載樣后的洗脫液(可見目的融合蛋白)，M為marker。目的融合蛋白經過腸激酶酶切后，由于載體硫氧還蛋白、SMBPRG4蛋白和腸激酶的pI值不同，在陰離子交換柱上有不同的吸附能力而被洗脫分離。酶切純化后SMBPRG4單體理論分子量為12.9 kD，但是如圖 2所示，電泳結果表明條帶大小在15 kD左右，這一現象的形成是由于SMB結構域的存在[1]。兩個SMB結構域含有14個半胱氨酸，蛋白半胱氨酸含量過高時電泳遷移率和分子量之間不存在線性關系。Western blot結果進一步驗證目的蛋白的純化，其中1為陽性對照，2為陰性對照，3為目的蛋白(箭頭所示)，M為marker。
圖1
SMBPRG4融合蛋白表達
Figure1.
The expression of SMBPRG4 fusion protein
圖2
SMBPRG4純化
Figure2.
Analysis of SMBPRG4
2.2 SMBPRG4以二聚體形式存在
Superdex75(Φ 1.0×60 cm)分離范圍在3~70 kD 。SMBPRG4蛋白保留體積為42.61 mL，如圖 3所示，根據分子量標準蛋白的線性回歸方程計算出分子量為26.1 kD。相對于單體分子質量，蛋白表現出二聚體的特點。DLS測算其粒徑為2.302 nm，分子量為23.69 kD，進一步證實SMBPRG4是以一個有兩個SMB結構域的二聚體形式存在。
圖3
凝膠排阻實驗測定SMBPRG4蛋白分子量
Figure3.
Superdex 75 size-exclusion chromatogaraphy
2.3 SMBPRG4二聚體為非共價聚集體
雖然提交的是SMBPRG4的全長序列，但是Swiss-Model同源建模服務器僅返回了第一個SMB結構域的預測結構，第二結構域的預測結果由 ROSSETA軟件完成，如圖 4所示。兩個結構域的預測結果有巨大的差別，但均未出現游離的半胱氨酸，所有半胱氨酸均形成了鏈內二硫鍵，提示SMBPRG4的聚集可能與肽鏈間的二硫鍵無關。非還原電泳顯示DTT的存在與否不影響蛋白的解聚，SMBPRG4是以非共價的形式在溶液中自我聚集形成二聚體的，如圖 5所示，1為還原電泳，2為非還原電泳，M為marker。
圖4
預測的SMBPRG4各SMB結構域三維結構
Figure4.
Predicted 3D structure of SMB domain
圖5
SDS-PAGE檢測純化的SMBPRG4蛋白
Figure5.
SMBPRG4 analyzed by SDS-PAGE
3 討論
在ECM蛋白、蛋白多糖、黏液素蛋白中，mRNA的選擇性剪接造成蛋白分子的多態性比較普遍。白細胞P-選擇素配體-1(P-selectin glycoprotein ligand 1,PSGL-1)介導血細胞黏附于血管壁，存在三種選擇性剪接產物，分子的高度多態性造成了PSGL-1的結構多態性，使功能也表現多態性。PSGL-1全長蛋白胞內區有16個10氨基酸殘基長度的黏液素樣重復序列。PSGL-1A型為全長，B型缺失第二個重復序列，C型缺失第9和10重復序列。PSGL-1由鏈間二硫鍵形成二聚體，才能與P-選擇素相互作用[8]，但是此結論尚存爭議[9]。分子多態性導致PSGL-1分子內的配體結合區之間距離改變從而影響與P-選擇素的結合，進一步影響白細胞的功能[10]。PSGL-1的同源蛋白GPⅠbα分子多態性也是因為重復序列數目不同造成的[11]，并且這種分子多態性與疾病相關。PRG4蛋白同樣具有分子多態性的特點，這種選擇性剪接的現象在進化上是保守的。其分子多態性并不與結構中的黏液素樣重復序列相關，外顯子的缺失主要出現在5＇端。從再生障礙性貧血患者尿中提取的MSF/PRG4蛋白具有12個外顯子。RT-PCR和Northern blot顯示在滑膜成纖維細胞中表達的MSF有若干種不同形式的剪接體，但在這4種剪接體形式中，編碼SMB結構域的第3外顯子始終存在[5]，其功能與結構關系的研究對于闡述疾病的發生很有意義。由此，我們的研究著眼于PRG4蛋白的SMB結構域。利用基因的分子多態性，根據PRG4 mRNA選擇性剪接的產物，我們克隆出了僅含PRG4兩個SMB結構域和少量糖基化重復序列的重組SMBPRG4蛋白。凝膠排阻實驗顯示重組蛋白是一個同源二聚體。血漿中Vn蛋白N端含有44個氨基酸的SMB結構域在表達后，也有聚集成同源二聚體的特點[12]，二聚化進程可能是重組表達的SMB結構域的特點之一。
蛋白聚集的動力包括鏈間二硫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用等。真核表達帶有GFP標簽的重組人Muc2黏液素蛋白N端序列在胞內為單體形式，分泌后為由二硫鍵形成的三聚體，而且不是簡單的分子之間的線性排列[13]。血漿中的Vn是以單體形式存在的，而存在于ECM的Vn是多聚體，這一多聚體的形成與SMBVn中的二硫鍵無關，而是由于Vn C末端肝素結合區附近的游離Cys形成鏈間二硫鍵而導致多聚體的形成。肝素親和層析分離純化的Vn則能自發形成1 000 kD、10 nm直徑的多聚體[14]，這種多聚的動力來自于非共價鍵和二硫鍵。變性后再復性的Vn在生理鹽水狀態下自我聚集形成多聚體[2]。Vn形成多聚體過程開始時，分子之間的二硫鍵形成。NPPs蛋白的N端依次為胞內結構、穿膜序列和兩個SMB 結構域，C端為酶活性區和核酸酶樣區。SMBNPP1-3是NPPs蛋白形成同源二聚體的區域[3]。缺失核酸酶樣區或者是同時缺失前者與酶活中心，蛋白依然形成穩定的二聚體；但是缺失了兩個SMB結構域和它的旁側序列以后，蛋白就呈單體形式存在。單純缺失一個SMB結構域并不改變二聚體狀態。NPP1第二個SMB結構域C末端旁側序列中還含有兩個Cys殘基，此位點點突變后，這兩個Cys變成Ser，蛋白即呈單體形式存在；若只突變SMB的Cys或者是旁側序列的Cys都無法使蛋白解聚，這表明NPP1蛋白的SMB結構域及其C末端的旁側序列是二聚體形成的原因。Swiss-Model同源建模服務器返回了SMBPRG4第一個SMB結構域的預測結構。預測的SMBPRG4二硫鍵模式與分離自人血漿Vn SMB的51個氨基酸的模式相同，也與經內切蛋白酶Glu-C消化再由反相HPLC純化得到的55個氨基酸殘基的SMBVn二硫鍵模式一致：Cys5-Cys9，Cys19-Cys31，Cys21-Cys32，Cys25-Cys39。由于模型顯示肽鏈內不存在游離的巰基，我們推測SMBPEG4的二聚體動力并非是由于鏈間二硫鍵造成的。還原-非還原電泳結果顯示，DTT的存在與否不影響蛋白的解聚，重組SMBPRG4蛋白分子是以非共價的形式在溶液中自我聚集的。但是多角度激光光散射檢測牛軟骨細胞分泌的PRG4分子量時，發現了由二硫鍵共價形成的二聚體蛋白[15]。這或許與蛋白的種屬來源不同、一級結構有所差別有關。
本研究克隆表達了PRG4蛋白SMB結構域，重組蛋白是一個非共價結合的同源二聚體。與Vn、NPP1蛋白一樣，PRG4的SMB結構域同樣是蛋白聚集形成的動力之一。后續的研究將行半胱氨酸點突變，以進一步驗證我們的結論。
