淀粉樣纖維是一類與人類疾病密切相關的蛋白異常聚集體,從一些核心短肽序列入手研究天然蛋白形成淀粉樣纖維的分子機制是近年來的研究熱點。本文設計了一個由甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)三種疏水性氨基酸構成的六肽GGAAVV(GAV-6),并研究其形成淀粉樣纖維的能力。以原子力顯微鏡(AFM)和動態光散射(DLS)為手段的納米結構表征發現,GAV-6能夠在水溶液中自組裝形成光滑不分叉的納米纖維。通過剛果紅染色/結合實驗和硫磺素T結合實驗,我們證實了這些納米纖維具有典型的淀粉樣纖維的特征。上述結果表明,人工設計的GAV-6短肽能夠自組裝形成淀粉樣纖維,這可能為今后深入研究天然蛋白形成淀粉樣纖維的機制提供一種簡單的模式分子。
引用本文： 張杰, 唐成康, 陳詠竹, 邢志華, 邱峰. 人工設計GAV-6短肽自組裝形成淀粉樣纖維的研究. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(3): 686-690. doi: 10.7507/1001-5515.20140128 復制
引言
淀粉樣纖維是一類由正常蛋白經錯誤折疊形成的纖維狀聚集體，它們普遍具有光滑不分叉、直徑小于10 nm、經剛果紅染色可出現黃綠色雙折射光等特征。目前已發現淀粉樣纖維與20余種人類疾病密切相關，其中包括阿爾茨海默病、帕金森病等神經退行性疾病，以及Ⅱ型糖尿病、動脈粥樣硬化等慢性疾病[1-2]。從蛋白質分子結構及其組裝形成纖維的機制入手研究這些疾病的起因和治療方法，已成為目前國內外研究的一個熱點。近年來，越來越多的研究表明，在不同的形成淀粉樣纖維的蛋白中，各自存在一些核心的短肽序列。這些短肽在體外能夠自組裝形成具有典型特征的淀粉樣纖維，很可能對蛋白質的異常聚集并最終導致病癥的發生起著決定性作用。其中研究得較多的短肽包括與阿爾茨海默病相關的淀粉樣β蛋白中的KLVFFAE序列[3-4]，與帕金森病相關的α-synuclein蛋白中的VGGAVVTGV序列[5]，以及與Ⅱ型糖尿病相關的胰島淀粉樣多肽中的NFGAILSS序列[6]等。
自組裝短肽作為新型納米材料的研究在近年來受到越來越多的重視，其核心在于通過人工設計合成具有一定結構特征的短肽序列，使其在一定條件下能夠自組裝形成具有一定結構和功能的納米材料[7-8]。在較早的研究中，我們設計了一個序列為KGGAAVVK的短肽分子，在水溶液中能夠自組裝形成光滑、不分叉的長纖維，其形態與典型的淀粉樣纖維非常類似[9]。在之前提出的分子自組裝模型中，我們認為該短肽兩頭帶正電荷、親水的賴氨酸(K)與G、A、V組成的疏水性中間區段形成了一個博拉兩親型短肽，使其能夠以膠束的形式發生自組裝[10]。鑒于該短肽中由G、A、V組成的疏水性序列與文獻報道的GAV基序[5]的相似性，我們推測去除兩端的K后，由G、A、V組成的6肽仍然能夠自組裝形成納米纖維，并且該纖維可能具有典型的淀粉樣纖維的特征。
為此，在本研究中我們設計合成了序列為NH2-GGAAVV-COOH的6肽(命名為GAV-6)，通過圓二色譜(circular dichorism,CD)研究其二級結構，原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)、動態光散射(dynamic light scattering,DLS)研究其自組裝形成納米纖維的能力，再通過剛果紅、硫磺素T結合實驗證明其具有典型的淀粉樣纖維的特征。
1 材料和方法
1.1 短肽樣品的準備
本研究所用短肽由上海波泰生物科技有限公司采用固相合成法合成，經高效液相色譜純化、質譜鑒定，純度在95%以上。將凍干的短肽粉末以2 mg/mL濃度溶于無菌去離子水，室溫下保存于Eppendorf管中備用。所有研究均在短肽溶液配制后的2 d內完成。
1.2 二級結構研究及三維分子模型的建立
用無菌去離子水將新鮮配制的短肽溶液稀釋為0.2 mg/mL，取800 μL于光徑為2 mm的石英比色杯中，在圓二色譜儀(Model 400 Circular Dichroism Spectrophotometer,Aviv Biomedical,Inc.)中測量其185~260 nm的遠紫外區CD光譜，連續測量3次取其平均值。根據測得的CD光譜推測短肽二級結構，將二級結構、氨基酸序列等信息導入Molsoft ICM-Pro軟件，構建其三維分子模型。
1.3 AFM觀察
取5 μL短肽溶液滴加于新撕開的云母片表面，在室溫下孵育8 h以便更多的納米結構能夠沉積于云母表面。然后用槍頭輕輕吸去短肽溶液，使云母片曝露在空氣中徹底干燥。將附著有樣品的云母片置于AFM(SPA400,SII Nanotechnology,Inc.)下，用探針以輕敲模式掃描樣品表面獲得其形貌圖。
1.4 DLS分析
為驗證AFM觀察到的納米結構在溶液狀態下存在，我們同時采用動態光散射儀(HORIBA LB-550)分析短肽溶液的納米粒度。在光徑為1 cm的石英比色杯中加入約2 mL新鮮配制的短肽溶液，靜置平衡20 s后開始測量，測量結果為連續30次掃描的平均值。
1.5 剛果紅染色
用80%無水乙醇配制飽和的剛果紅溶液作為染色液。取10 μL短肽溶液滴于潔凈的載玻片表面，待其在空氣中晾干后，滴加10 μL剛果紅染液染色5 min，然后用去離子水輕輕沖掉多余的染液。待載玻片徹底干燥后，在帶有起偏器的光學顯微鏡(Leica DM4000 B)下觀察其雙折射光。
1.6 剛果紅結合實驗
用去離子水配制濃度為1 mmol/L的剛果紅母液，取10 μL滴加到990 μL短肽溶液或作為對照的去離子水中，使剛果紅終濃度為10 μmol/L。溶液混合均勻后在室溫條件下避光靜置1 h，然后用紫外/可見分光光度計(DU 800 Nucleic acid/protein analyzer,Beckman Coulter)測定其400~600 nm的吸收光譜。每個樣品測量3次取其平均值。
1.7 硫磺素T結合實驗
用去離子水配制濃度為1 mmol/L的硫磺素T母液，取10 μL滴加到990 μL短肽溶液或作為對照的去離子水中，使硫磺素T終濃度為10 μmol/L。溶液混合均勻后在室溫條件下避光靜置1 h，然后用熒光分光度計(Hitachi F-7000)在激發波長為450 nm的條件下測量其460~600 nm的熒光光譜。每個樣品測量3次取其平均值。
2 結果和討論
2.1 GAV-6的分子結構和三維模型
GAV-6短肽的化學結構如圖 1(a)所示。該短肽由三種疏水性氨基酸G、A、V構成其疏水區段，可解離的N末端氨基和C末端羧基形成親水性的頭部，因此在結構上為典型的博拉兩親型分子。如圖 1(b)所示，CD光譜顯示GAV-6在195 nm處有一負峰，表現為無規則的二級結構。根據GAV-6的氨基酸序列及其無規則的二級結構，用Molsoft ICM-Pro軟件模擬出該短肽的三維分子模型如圖 1(c)所示。由于組成短肽的三種氨基酸的體積大小為G＜A＜V，因此GAV-6分子的體積從N端到C端依次變大，在空間幾何形狀上呈現出楔形結構。
圖1
GAV-6的分子結構
(a)化學結構示意圖；(b)CD光譜；(c)三維分子模型
Figure1. Molecular structure of GAV-6(a) scheme of chemical structure; (b) CD spectrum; (c) 3D molecular model
2.2 GAV-6的自組裝結構
GAV-6的自組裝結構如圖 2所示。AFM觀察發現GAV-6可形成直徑約為4 nm、長度達幾微米的長纖維，這些光滑、不分叉的長纖維在形態和尺度上與典型的淀粉樣纖維十分接近[見圖 2(a)]。另一方面，如圖 2(a)中的箭頭所示，這些纖維又可進一步形成并行排列的纖維束，表現出與淀粉樣纖維類似的聚集行為。為了證實這些納米纖維是由GAV-6在溶液中自組裝形成的，而非與云母片表面相互作用的結果，我們進一步分析了GAV-6在溶液狀態下的納米粒度。如圖 2(b)所示，DLS結果顯示GAV-6的粒徑分布出現在100~300 nm的范圍內，證實了納米結構在溶液中的存在。由于DLS主要用于表征顆粒形狀的納米結構的大小，并不能精確反映納米纖維的尺寸，所以100~300 nm這一數據與AFM觀察到的纖維直徑和長度并不矛盾。圖 2所示的AFM形貌圖和DLS數據聯合起來，證實了GAV-6能夠在溶液中自組裝形成具有淀粉樣纖維形態特征的納米纖維。
圖2
GAV-6的自組裝結構
(a)AFM形貌圖(比例尺：1
(a) AFM topographical image (Scale bar: 1
2.3 GAV-6納米纖維與標志性染料的結合
在研究了GAV-6納米纖維形態特征的基礎上，我們進一步研究其與特殊染料的結合情況，分析其是否具有淀粉樣纖維的其它特征。剛果紅是鑒定淀粉樣纖維的一種經典染料，當其與淀粉樣纖維結合后，能夠在偏光顯微鏡下呈現出蘋果綠或亮黃色的雙折射光[11-12]。如圖 3所示，經剛果紅染色后，GAV-6短肽在偏光顯微鏡下呈現出淀粉樣纖維特有的雙折射光。
圖3
GAV-6經剛果紅染色后的顯微照片
(a)普通光視野；(b)偏振光視野(比例尺：500
(a) normal field; (b) polarized light field (Scale bars: 500
淀粉樣纖維與剛果紅結合后的另一特征是它能顯著改變剛果紅的吸收光譜。如圖 4(a)所示，剛果紅純品的吸收峰出現在495 nm左右；而當其與GAV-6納米纖維結合后，該吸收峰紅移至510 nm左右，并且伴隨峰值的大幅增加，同時在約540 nm處產生了一個新的吸收峰，這與文獻描述的典型的淀粉樣纖維的行為非常一致[13-14]。硫磺素T是另一個用于鑒定淀粉樣纖維的染料，與淀粉樣纖維結合后能產生特征性的熒光光譜。如圖 4(b)所示，在450 nm波長的激發光條件下，硫磺素T純品不具有熒光性；而當其與GAV-6納米纖維結合后，在490 nm附近出現了強烈的熒光峰。這一現象同樣與文獻報道的淀粉樣纖維與硫磺素T的結合行為非常一致[15-16]。
圖4
GAV-6短肽與標志性染料的結合
(a)與剛果紅結合后的吸收光譜；(b)與硫磺素T結合后的熒光光譜
Figure4. Binding behavior of GAV-6 peptide with indicative dyes(a) absorbance of Congo red after binding with GAV-6; (b) fluorescence of thioflavin-T after binding with GAV-6
2.4 推測的自組裝模型
上述研究結果表明，GAV-6自組裝形成的納米纖維在形態、與標志性染料的結合等方面都具有典型的淀粉樣纖維的特征。不同的是，文獻報道的淀粉樣纖維大多是由天然蛋白質或短肽在β-折疊二級結構的基礎上形成的，而本研究的GAV-6短肽卻是無規則的二級結構。因此，我們推測GAV-6短肽可能有其獨特的自組裝模式。圖 5為我們根據GAV-6三維分子模型及其形成纖維的形態特征推測的自組裝模型。由于分子單體為楔形，GAV-6短肽非常容易以棒狀膠束的形式發生自組裝，將主體疏水段包裹于膠束內部，只在表面暴露親水性的C末端，從而形成具有極高縱橫比的納米纖維。這一模型與我們[9]在之前研究中報道的KGGAAVVK短肽的自組裝模型是基本一致的，其區別在于在KGGAAVVK形成的纖維中，暴露于水溶液的C末端為可解離的堿性氨基酸K及其羧基，而在GAV-6形成的纖維中，暴露于水溶液的C末端僅為可解離的羧基。在酸性的短肽溶液中，堿性賴氨酸側鏈的解離程度遠大于C末端羧基的解離程度，因此KGGAAVVK纖維表面帶有強烈的正電荷，纖維之間由于強烈的電荷相互排斥作用而形成交織的網絡結構[9]；而另一方面，GAV-6纖維表面由于C末端羧基的部分解離而僅帶有較弱的負電荷，因此纖維之間的相互排斥作用較弱，易于聚集形成并行排列的纖維束。本文推測的這一模型與經典的淀粉樣纖維基于反平行β-折疊的自組裝模型有較大區別，可能為研究淀粉樣纖維形成的分子機制提供新的思路。
圖5
推測的GAV-6自組裝模型
Figure5.
Proposed self-assembling model of GAV-6
3 總結
在本文的研究中，我們設計了一種由G、A、V三種疏水性氨基酸組成的六肽。該短肽溶于水后能夠迅速自組裝形成光滑不分叉的納米纖維，剛果紅染色/結合實驗和硫磺素T結合實驗均表明該短肽形成的納米纖維具有典型的淀粉樣纖維的特征。考慮到GAV-6與已報道的一些天然淀粉樣短肽基序的相似性，該短肽可能為研究淀粉樣纖維形成的分子機制提供一個簡單的模式分子。同時，我們也在本文研究中提出了一種基于無規則二級結構的以棒狀膠束形式發生自組裝的模型，這可能為闡明淀粉樣纖維形成的分子機制提供一個新的思路。另一方面，GAV-6作為一種新穎的自組裝短肽分子，也可能被進一步改進、開發成為一種新型納米材料，在納米生物技術領域發揮重要作用。
引言
淀粉樣纖維是一類由正常蛋白經錯誤折疊形成的纖維狀聚集體，它們普遍具有光滑不分叉、直徑小于10 nm、經剛果紅染色可出現黃綠色雙折射光等特征。目前已發現淀粉樣纖維與20余種人類疾病密切相關，其中包括阿爾茨海默病、帕金森病等神經退行性疾病，以及Ⅱ型糖尿病、動脈粥樣硬化等慢性疾病[1-2]。從蛋白質分子結構及其組裝形成纖維的機制入手研究這些疾病的起因和治療方法，已成為目前國內外研究的一個熱點。近年來，越來越多的研究表明，在不同的形成淀粉樣纖維的蛋白中，各自存在一些核心的短肽序列。這些短肽在體外能夠自組裝形成具有典型特征的淀粉樣纖維，很可能對蛋白質的異常聚集并最終導致病癥的發生起著決定性作用。其中研究得較多的短肽包括與阿爾茨海默病相關的淀粉樣β蛋白中的KLVFFAE序列[3-4]，與帕金森病相關的α-synuclein蛋白中的VGGAVVTGV序列[5]，以及與Ⅱ型糖尿病相關的胰島淀粉樣多肽中的NFGAILSS序列[6]等。
自組裝短肽作為新型納米材料的研究在近年來受到越來越多的重視，其核心在于通過人工設計合成具有一定結構特征的短肽序列，使其在一定條件下能夠自組裝形成具有一定結構和功能的納米材料[7-8]。在較早的研究中，我們設計了一個序列為KGGAAVVK的短肽分子，在水溶液中能夠自組裝形成光滑、不分叉的長纖維，其形態與典型的淀粉樣纖維非常類似[9]。在之前提出的分子自組裝模型中，我們認為該短肽兩頭帶正電荷、親水的賴氨酸(K)與G、A、V組成的疏水性中間區段形成了一個博拉兩親型短肽，使其能夠以膠束的形式發生自組裝[10]。鑒于該短肽中由G、A、V組成的疏水性序列與文獻報道的GAV基序[5]的相似性，我們推測去除兩端的K后，由G、A、V組成的6肽仍然能夠自組裝形成納米纖維，并且該纖維可能具有典型的淀粉樣纖維的特征。
為此，在本研究中我們設計合成了序列為NH2-GGAAVV-COOH的6肽(命名為GAV-6)，通過圓二色譜(circular dichorism,CD)研究其二級結構，原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)、動態光散射(dynamic light scattering,DLS)研究其自組裝形成納米纖維的能力，再通過剛果紅、硫磺素T結合實驗證明其具有典型的淀粉樣纖維的特征。
1 材料和方法
1.1 短肽樣品的準備
本研究所用短肽由上海波泰生物科技有限公司采用固相合成法合成，經高效液相色譜純化、質譜鑒定，純度在95%以上。將凍干的短肽粉末以2 mg/mL濃度溶于無菌去離子水，室溫下保存于Eppendorf管中備用。所有研究均在短肽溶液配制后的2 d內完成。
1.2 二級結構研究及三維分子模型的建立
用無菌去離子水將新鮮配制的短肽溶液稀釋為0.2 mg/mL，取800 μL于光徑為2 mm的石英比色杯中，在圓二色譜儀(Model 400 Circular Dichroism Spectrophotometer,Aviv Biomedical,Inc.)中測量其185~260 nm的遠紫外區CD光譜，連續測量3次取其平均值。根據測得的CD光譜推測短肽二級結構，將二級結構、氨基酸序列等信息導入Molsoft ICM-Pro軟件，構建其三維分子模型。
1.3 AFM觀察
取5 μL短肽溶液滴加于新撕開的云母片表面，在室溫下孵育8 h以便更多的納米結構能夠沉積于云母表面。然后用槍頭輕輕吸去短肽溶液，使云母片曝露在空氣中徹底干燥。將附著有樣品的云母片置于AFM(SPA400,SII Nanotechnology,Inc.)下，用探針以輕敲模式掃描樣品表面獲得其形貌圖。
1.4 DLS分析
為驗證AFM觀察到的納米結構在溶液狀態下存在，我們同時采用動態光散射儀(HORIBA LB-550)分析短肽溶液的納米粒度。在光徑為1 cm的石英比色杯中加入約2 mL新鮮配制的短肽溶液，靜置平衡20 s后開始測量，測量結果為連續30次掃描的平均值。
1.5 剛果紅染色
用80%無水乙醇配制飽和的剛果紅溶液作為染色液。取10 μL短肽溶液滴于潔凈的載玻片表面，待其在空氣中晾干后，滴加10 μL剛果紅染液染色5 min，然后用去離子水輕輕沖掉多余的染液。待載玻片徹底干燥后，在帶有起偏器的光學顯微鏡(Leica DM4000 B)下觀察其雙折射光。
1.6 剛果紅結合實驗
用去離子水配制濃度為1 mmol/L的剛果紅母液，取10 μL滴加到990 μL短肽溶液或作為對照的去離子水中，使剛果紅終濃度為10 μmol/L。溶液混合均勻后在室溫條件下避光靜置1 h，然后用紫外/可見分光光度計(DU 800 Nucleic acid/protein analyzer,Beckman Coulter)測定其400~600 nm的吸收光譜。每個樣品測量3次取其平均值。
1.7 硫磺素T結合實驗
用去離子水配制濃度為1 mmol/L的硫磺素T母液，取10 μL滴加到990 μL短肽溶液或作為對照的去離子水中，使硫磺素T終濃度為10 μmol/L。溶液混合均勻后在室溫條件下避光靜置1 h，然后用熒光分光度計(Hitachi F-7000)在激發波長為450 nm的條件下測量其460~600 nm的熒光光譜。每個樣品測量3次取其平均值。
2 結果和討論
2.1 GAV-6的分子結構和三維模型
GAV-6短肽的化學結構如圖 1(a)所示。該短肽由三種疏水性氨基酸G、A、V構成其疏水區段，可解離的N末端氨基和C末端羧基形成親水性的頭部，因此在結構上為典型的博拉兩親型分子。如圖 1(b)所示，CD光譜顯示GAV-6在195 nm處有一負峰，表現為無規則的二級結構。根據GAV-6的氨基酸序列及其無規則的二級結構，用Molsoft ICM-Pro軟件模擬出該短肽的三維分子模型如圖 1(c)所示。由于組成短肽的三種氨基酸的體積大小為G＜A＜V，因此GAV-6分子的體積從N端到C端依次變大，在空間幾何形狀上呈現出楔形結構。
圖1
GAV-6的分子結構
(a)化學結構示意圖；(b)CD光譜；(c)三維分子模型
Figure1. Molecular structure of GAV-6(a) scheme of chemical structure; (b) CD spectrum; (c) 3D molecular model
2.2 GAV-6的自組裝結構
GAV-6的自組裝結構如圖 2所示。AFM觀察發現GAV-6可形成直徑約為4 nm、長度達幾微米的長纖維，這些光滑、不分叉的長纖維在形態和尺度上與典型的淀粉樣纖維十分接近[見圖 2(a)]。另一方面，如圖 2(a)中的箭頭所示，這些纖維又可進一步形成并行排列的纖維束，表現出與淀粉樣纖維類似的聚集行為。為了證實這些納米纖維是由GAV-6在溶液中自組裝形成的，而非與云母片表面相互作用的結果，我們進一步分析了GAV-6在溶液狀態下的納米粒度。如圖 2(b)所示，DLS結果顯示GAV-6的粒徑分布出現在100~300 nm的范圍內，證實了納米結構在溶液中的存在。由于DLS主要用于表征顆粒形狀的納米結構的大小，并不能精確反映納米纖維的尺寸，所以100~300 nm這一數據與AFM觀察到的纖維直徑和長度并不矛盾。圖 2所示的AFM形貌圖和DLS數據聯合起來，證實了GAV-6能夠在溶液中自組裝形成具有淀粉樣纖維形態特征的納米纖維。
圖2
GAV-6的自組裝結構
(a)AFM形貌圖(比例尺：1
(a) AFM topographical image (Scale bar: 1
2.3 GAV-6納米纖維與標志性染料的結合
在研究了GAV-6納米纖維形態特征的基礎上，我們進一步研究其與特殊染料的結合情況，分析其是否具有淀粉樣纖維的其它特征。剛果紅是鑒定淀粉樣纖維的一種經典染料，當其與淀粉樣纖維結合后，能夠在偏光顯微鏡下呈現出蘋果綠或亮黃色的雙折射光[11-12]。如圖 3所示，經剛果紅染色后，GAV-6短肽在偏光顯微鏡下呈現出淀粉樣纖維特有的雙折射光。
圖3
GAV-6經剛果紅染色后的顯微照片
(a)普通光視野；(b)偏振光視野(比例尺：500
(a) normal field; (b) polarized light field (Scale bars: 500
淀粉樣纖維與剛果紅結合后的另一特征是它能顯著改變剛果紅的吸收光譜。如圖 4(a)所示，剛果紅純品的吸收峰出現在495 nm左右；而當其與GAV-6納米纖維結合后，該吸收峰紅移至510 nm左右，并且伴隨峰值的大幅增加，同時在約540 nm處產生了一個新的吸收峰，這與文獻描述的典型的淀粉樣纖維的行為非常一致[13-14]。硫磺素T是另一個用于鑒定淀粉樣纖維的染料，與淀粉樣纖維結合后能產生特征性的熒光光譜。如圖 4(b)所示，在450 nm波長的激發光條件下，硫磺素T純品不具有熒光性；而當其與GAV-6納米纖維結合后，在490 nm附近出現了強烈的熒光峰。這一現象同樣與文獻報道的淀粉樣纖維與硫磺素T的結合行為非常一致[15-16]。
圖4
GAV-6短肽與標志性染料的結合
(a)與剛果紅結合后的吸收光譜；(b)與硫磺素T結合后的熒光光譜
Figure4. Binding behavior of GAV-6 peptide with indicative dyes(a) absorbance of Congo red after binding with GAV-6; (b) fluorescence of thioflavin-T after binding with GAV-6
2.4 推測的自組裝模型
上述研究結果表明，GAV-6自組裝形成的納米纖維在形態、與標志性染料的結合等方面都具有典型的淀粉樣纖維的特征。不同的是，文獻報道的淀粉樣纖維大多是由天然蛋白質或短肽在β-折疊二級結構的基礎上形成的，而本研究的GAV-6短肽卻是無規則的二級結構。因此，我們推測GAV-6短肽可能有其獨特的自組裝模式。圖 5為我們根據GAV-6三維分子模型及其形成纖維的形態特征推測的自組裝模型。由于分子單體為楔形，GAV-6短肽非常容易以棒狀膠束的形式發生自組裝，將主體疏水段包裹于膠束內部，只在表面暴露親水性的C末端，從而形成具有極高縱橫比的納米纖維。這一模型與我們[9]在之前研究中報道的KGGAAVVK短肽的自組裝模型是基本一致的，其區別在于在KGGAAVVK形成的纖維中，暴露于水溶液的C末端為可解離的堿性氨基酸K及其羧基，而在GAV-6形成的纖維中，暴露于水溶液的C末端僅為可解離的羧基。在酸性的短肽溶液中，堿性賴氨酸側鏈的解離程度遠大于C末端羧基的解離程度，因此KGGAAVVK纖維表面帶有強烈的正電荷，纖維之間由于強烈的電荷相互排斥作用而形成交織的網絡結構[9]；而另一方面，GAV-6纖維表面由于C末端羧基的部分解離而僅帶有較弱的負電荷，因此纖維之間的相互排斥作用較弱，易于聚集形成并行排列的纖維束。本文推測的這一模型與經典的淀粉樣纖維基于反平行β-折疊的自組裝模型有較大區別，可能為研究淀粉樣纖維形成的分子機制提供新的思路。
圖5
推測的GAV-6自組裝模型
Figure5.
Proposed self-assembling model of GAV-6
3 總結
在本文的研究中，我們設計了一種由G、A、V三種疏水性氨基酸組成的六肽。該短肽溶于水后能夠迅速自組裝形成光滑不分叉的納米纖維，剛果紅染色/結合實驗和硫磺素T結合實驗均表明該短肽形成的納米纖維具有典型的淀粉樣纖維的特征。考慮到GAV-6與已報道的一些天然淀粉樣短肽基序的相似性，該短肽可能為研究淀粉樣纖維形成的分子機制提供一個簡單的模式分子。同時，我們也在本文研究中提出了一種基于無規則二級結構的以棒狀膠束形式發生自組裝的模型，這可能為闡明淀粉樣纖維形成的分子機制提供一個新的思路。另一方面，GAV-6作為一種新穎的自組裝短肽分子，也可能被進一步改進、開發成為一種新型納米材料，在納米生物技術領域發揮重要作用。
