為研究不同濃度(25、50、100 μg/mL)超順磁性氧化鐵粒子(SPIO)標記對大鼠骨髓間充質干細胞(rMSCs)生物學活性、體外MRI成像效應的影響,采用多聚賴氨酸(PLL)包被的SPIO (PLL-SPIO)標記原代分離培養的rMSCs,24 h后分別進行陽性標記率、MRI成像效應、細胞增殖凋亡以及干細胞細胞分化能力的綜合評價。PLL-SPIO標記陽性率、鐵含量測定結果顯示:鐵標記率可達75%~100%。透射電鏡觀察,可見100 μg/mL組rMSCs細胞質內濃聚細小鐵顆粒的囊泡樣包涵體。采用T1WI、T2WI和T2*WI序列MRI成像掃描顯示:25 μg/mL組即可引起信號的明顯降低。與未標記的對照組細胞相比,25 μg/mL和50 μg/mL組細胞增殖活力、凋亡、干細胞分化能力檢測結果差異皆無統計學意義(P＞0.05),而100 μg/mL組的差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論:25、50 μg/mL SPIO可有效標記rMSCs,100 μg/mL的SPIO對rMSCs增殖活性和分化能力有抑制作用,這為SPIO進一步的體內及臨床MRI分子影像應用提供了基礎。
引用本文： 呂鑫, 聶永梅, 趙志偉, 何學令, 劉艷, 甫拉提·吐爾遜, 吳江. SPIO標記大鼠骨髓間充質干細胞:生物學活性及體外MRI成像效應評價. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(2): 365-372. doi: 10.7507/1001-5515.20140069 復制
引言
近年來，隨著科學技術的發展，分子生物學與現代醫學影像技術相互結合，形成一門新興的邊緣學科--分子影像學(molecular imaging)[1]。目前,分子影像學主要包括核素成像、光學成像和磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)三大類。在這三類成像技術中，MRI以其三維采集成像、高分辨力、高對比等優勢而備受關注。其中，對比劑的更新對MRI貢獻頗大。對比劑的主要作用是改變靶組織的弛豫時間，增強與周圍正常組織的對比，從而實現對疾病特性和種類的早期診斷。超順磁性氧化鐵(superparamagnetic oxide iron,SPIO) 是目前研究比較熱門的一類MRI對比劑，它的有效成分是Fe3O4 晶體核心,被包以組織相溶物，包覆后的SPIO具有一定的超順磁性、生物活性，能明顯縮短周圍組織的T2值，因而SPIO有望用于臨床早期的分子影像診斷。但是，近期國內外的學者研究發現，SPIO在標記細胞的同時，也會對細胞增殖、分化能力等生物學活性產生一定的影響，且隨標記濃度的不同而不同[2]。本實驗以不同濃度的SPIO標記原代分離培養的大鼠骨髓間充質干細胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs)，綜合評價SPIO對rMSCs生物學活性及體外MRI成像效應的影響，為臨床影像對比劑的進一步更新發展提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
成年SPF級SD大鼠，10只。雌雄不限，體質量(150±20)g，購自新疆醫科大學實驗動物中心。
1.2 主要試劑和儀器
SPIO(四川大學化學工程學院趙強教授合成提供)[3]。DMEM-L、PBS、胰蛋白酶、胎牛血清、雙抗(Hyclone)；異丁基甲基黃嘌、CCK-8、吲哚美辛、胰島素、茜素紅、β-磷酸甘油、熒光標記抗大鼠單抗PE-CD45、FITC-CD90、PEcy5-CD29、TGF-β1、bFGF(Sigma)；AKP染色試劑盒、Ⅰ型膠原免疫組化試劑盒、Ⅱ型膠原免疫組化試劑盒(南京建成)；NSE型膠原免疫組化試劑盒、凋亡試劑盒(武漢博士德)。
倒置相差顯微鏡(Olympus)，CO2培養箱(美國Thermo公司)，超凈工作臺(上海設備總廠)，超聲清洗儀(Branson公司)，原子吸收分光光度計(北京第二光學儀器廠)，EPTCSXL-31240型流式細胞儀(Coulter公司)，離心沉淀機(上海醫用分析儀器廠)，3.0T核磁共振系統(GE公司)。
1.3 實驗方法
1.3.1 Brookhaven Zeta粒度分析儀檢測SPIO粒徑
用PBS進一步稀釋SPIO、PLL-SPIO溶液，調整其濃度為25 μg/mL，將2 mL SPIO、PLL-SPIO 溶液加入Brookhaven Zeta粒度分析儀中的比色杯中進行有效粒徑的檢測。
1.3.2 rMSCs分離、培養及鑒定
按照文獻及本課題組的方法獲取原代rMSCs[4]，采用透射電鏡、流式細胞術表面分子標記物CD45、CD90、CD29、分化誘導法等進行干細胞鑒定[3]。采用傳代至第4代的rMSCs進行以下實驗。
1.3.3 不同濃度SPIO標記rMSCs效果檢測
(1) 不同濃度SPIO標記rMSCs：參考文獻[5]方法，將SPIO(50、100、200 μg/mL)和1.5 μg/mL多聚賴氨酸(PLL)等體積混合，室溫振蕩60 min，最后鐵、多聚賴氨酸終濃度分別為25、50、100 μg/mL和0.75 μg/mL。將上述溶液加入第4代rMSCs中,37 ℃、體積分數5% CO2條件下孵育24 h。實驗分組：設置不同濃度(25、50、100 μg/mL)PLL-SPIO標記的rMSCs為實驗組，同時設未標記rMSCs為對照組。
(2) 透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察SPIO標記效果：選取各組細胞，吸掉細胞培養基，用PBS充分沖洗，去除細胞外鐵，胰酶消化。離心后，戊二醛固定，丙酮脫水，環氧樹脂包埋，修塊、切片，枸櫞酸鉛染色，于透射電鏡下觀察SPIO粒子的大小和形態。
(3) 普魯氏藍染色：選取各組細胞，吸掉培養液，PBS漂洗3次，滴加4%多聚甲醛固定15 min。滴加酸性亞鐵氫化鉀溶液(2%亞鐵氫化鉀和2%HCl的體積比為1∶1)孵育30 min，水洗。顯微鏡下觀察并拍照，統計鐵染色陽性率。
(4) 細胞鐵含量檢測：選取各組細胞，吸掉細胞培養基，PBS沖洗細胞2次，胰酶消化細胞，收集實驗組及對照組細胞(1×106)。將細胞放于干燥箱(80 ℃)2 h。后滴加150 μL濃HCl，常溫過夜，接著將細胞放于干燥箱(60 ℃)2 h ，使SPIO顆粒表面葡聚糖近一步消化。滴加PBS稀釋濃HCl 10倍，原子分光光度計測量鐵含量。
(5) 不同濃度SPIO標記rMSCs體外MRI掃描：將各組SPIO標記細胞快速均勻溶于盛有1%瓊脂糖的冷凍管中(A:1×106,B: 0.5×106,C:0.25×106,D:1.25×105,E:6.25×104)，待瓊脂冷卻凝固后，進行MRI掃描。采用3.0TMR，實驗專用線圈。成像序列：① SE序列：T1WI，TR 400.00 ms，TE 15.0 ms，Bandwidth 20.83，NEX 2.0；② 快速自旋回波(FSE)序列：T2WI，TR 4 500 ms，TE 100 ms，Bandwidth 21，NEX 2.0；③ 梯度回波序列(GRE)：T2*WI，TR 400 ms，TE 23.0 ms，Bandwidth 20.83，Fip Angle:15，NEX 2.0。采用3.0 TMRI自動測量系統，測量每種掃描序列圖像上信號強度(signal intensity,SI)，計算每種序列信號強度衰減率(△SI)。△SI=(SPIO標記-SPIO未標記)/SPIO未標記×100%。
1.3.4
不同濃度SPIO對rMSCs生物活性影響
(1) rMSCs核形態學觀察：選取各組細胞，吸棄培養液，PBS清洗3次； 4%多聚甲醛固定15 min，加入熒光染料DAPI/PI，37 ℃避光孵育1 h,激光共聚焦顯微鏡405nm/488nm觀察。
(2) 細胞增殖能力檢測：選取各組細胞，按細胞密度1×103/孔接種于96孔培養板中，置入于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。實驗孔和對照孔每3天換液1次。此后每天固定時間，連續8天測定光吸收值(OD)。以SPIO濃度為橫坐標，以各組8天測定光吸收值(OD)均數為縱坐標,繪制柱狀圖。
(3) 細胞周期測定：取各組細胞，胰酶消化制成單細胞懸液1×106/mL，緩慢加入1.5 mL 75%乙醇(預冷)4 ℃固定過夜，避光加入500 μl RNAse、碘化丙啶并染色30 min，流式細胞儀488 nm檢測G0/G1期細胞占總細胞的百分率。
(4) TUNEL法檢測細胞凋亡: 取各組細胞，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，3% H2O2室溫處理10 min。滴加標記緩沖液(Labeling Buffer) 20 μL，含TdT和DIG-d-UTP 各1 μL，37 ℃標記2 h。封閉液常溫作用30 min，滴加生物素化抗地高辛抗體20 μL，37 ℃反應30 min。滴加SABC 20 μL，37 ℃反應30 min。DAB 顯色，水洗。細胞核染為棕色為陽性細胞。在倒置顯微鏡下,應用Image Pro Plus 5.0專業圖像分析軟件，隨機選取不同視野，計數陽性細胞，并得出細胞凋亡率。
(5) 透射電鏡觀察SPIO標記rMSCs形態：取各組細胞，吸掉細胞培養基，用PBS充分沖洗，去除細胞外鐵，胰酶消化。離心后，戊二醛固定，丙酮脫水，環氧樹脂包埋，修塊、切片，枸櫞酸鉛染色，電鏡觀察rMSCs形態。
1.3.5 不同濃度SPIO對rMSCs分化能力影響
選擇第4代細胞，接種于3.5 cm培養皿，待細胞匯合率達到80%時，用25、50、 100 μg/mL SPIO孵育rMSCs 24 h后，分別進行細胞誘導分化實驗：
(1) 內皮細胞分化誘導劑(10 ng/mL VEGF、2 ng/mL bFGF) 14 d后進行vWF免疫組化染色。應用專業圖像分析軟件，隨機選取不同視野，計數陽性細胞，并得出陽性細胞率。
(2) 成脂誘導(1×10-6mol/L地塞米松、5 mg/L胰島素、1×10-4mol/L IBMX、6×10-7mol/L吲哚美辛)7 d后，進行油紅O染色。
(3) 成骨誘導(1×10-7mol/L地塞米松、1×10-2mol/L β-甘油磷酸鈉、50mg/L維生素C)5、7、10、14 d后，按照堿性磷酸酶(AKP)檢測試劑盒說明進行操作，于酶標儀520 nm波長處進行檢測。AKP含量(金氏U/100mL)=(測定管吸光度/標準管吸光度)×酚標準品濃度×100 mL。誘導21 d后進行茜素紅染色，進行鈣結個數和面積測量。
(4) 成軟骨誘導(10 ng/mL TGF-β1、1×10-7 mol/L地塞米松、50 mg/L維生素C、1% ITS-A)14 d后進行Ⅱ型膠原免疫組化染色；同時選取細胞樣本進行EDTA、Ⅱ型膠原酶、木瓜蛋白酶消化，采用DMB比色法測定軟骨細胞外糖胺聚糖(GAG)含量：按照試劑盒說明書制作硫酸軟骨素標準曲線，根據曲線求得GAG濃度。GAG含量=GAG濃度×液體總量。
1.4 數據統計和結果分析
所有實驗均重復3～4次。所有參數均采用SPSS 16.0統計軟件包進行多個樣本均數單因素方差分析(ANOVA)，并用q檢驗進行比較，P＜0.05代表有統計學意義。
2 結果
2.1 不同濃度SPIO標記rMSCs效果檢測
(1) 粒子形態和粒徑分析: 透射電鏡下，SPIO、PLL-SPIO呈單個分散，偶有聚集現象。核心Fe3O4呈晶體狀，外部可見有機物質包裹，SPIO、PLL-SPIO之間均有相互連接現象(見圖 1)。Brookhaven Zeta粒度分析儀檢測SPIO粒徑：SPIO、PLL-SPIO有效粒徑分別為48、51 nm，分散度分別為0.3、0.4。
圖1
透射電鏡觀測粒子形態
Figure1.
TEM observation of the particle morphology
SPIO標記rMSCs結果，可見各濃度組細胞胞質內囊泡樣包涵體增多，包涵體內有濃聚細小的鐵顆粒，呈圓形或橢圓形，電子密度較高，相對獨立，與胞核和胞質隔離(25 μg/mL組見圖 2a)。
圖2
SPIO標記rMSCs結果檢測
(a): 25
(a) TEM photo of 25
(2) 普魯氏藍染色：25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL組細胞胞質內均存在藍色顆粒，且顏色依次加深，標記率分別為75%、97%、100%，與對照組比較以及組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)(25μg/mL組見圖 2b)。
(3) 細胞鐵含量的檢測：25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL組細胞內鐵含量分別為(14.4±1.05)、(17.7±0.36)、(20.4±0.97) pg/細胞，與對照組(0.4±0.07) pg/細胞比較以及組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)。
(4) 不同濃度SPIO標記rMSCs體外MRI掃描：MRI(T1WI、T2WI和T2*WI)序列信號均呈低信號：其中，掃描1×106細胞，T1WI、T2WI和T2*WI序列信號分別降低47.9%±9.1%、67.3%±8.4%、82.5%±5.6%(25 μg/mL組)；51.2%±7.9%、71.2%±9.1%、83.6%±2.5%(50 μg/mL組)；57.5%±3.4%、74.7%±5.6%、86.3%±8.2%(100 μg/mL組)。25 μg/mL組、50 μg/mL組、100 μg/mL組信號平均降低65.6%±7.9%、70.2%±0.8%、72.7%±10.3%。以上說明25 μg/mL組就可以明顯引起信號改變，與50 μg/mL組、100 μg/mL組比較差異無統計學意義(P＞0.05)(見表 1、圖 3)。
表1
T1WI、T2WI及T2*WI序列冠狀位圖像各管底部SI值(
圖3
SPIO標記rMSCs體外MRI掃描圖像
Ⅰ：對照組；Ⅱ：100
Ⅰ：Control； Ⅱ：100
2.2 不同濃度SPIO對rMSCs生物活性影響
(1) 激光共聚焦觀察rMSCs核形態學變化：25 μg/mL組和50 μg/mL組細胞均沒有發生明顯凋亡，100 μg/mL組rMSCs發生明顯凋亡，細胞核高度濃縮，體積變小，部分發生裂解(見圖 4)。
圖4
激光共聚焦檢測SPIO標記rMSCs核形態學改變
箭頭所指為核凋亡現象
Figure4. Nuclear morphological changes of SPIO labeled rMSCs by laser confocal detectionarrows indicate the phenomenon of nuclear apoptosis
(2) 細胞增殖能力檢測：25 μg/mL組和50 μg/mL組rMSCs OD平均值分別為0.52±0.25和0.51±0.26，與未標記細胞(0.54±0.16)間差異無統計學意義(P＞0.05)。100 μg/mL組rMSCs OD值為0.44±0.22，與未標記細胞間差異有統計學意義(P＜0.05) 。
(3) 流式細胞儀檢測細胞周期：25 μg/mL組和50 μg/mL組rMSCs分別有61.1%±9.1%、69.8%±4.1%處于G0/G1期，與未標記細胞(66.1%±4.5%)間差異無統計學意義(P＞0.05)。100 μg/mL組rMSCs有80.1%±1.4%處于G0/G1期，與未標記細胞間差異有統計學意義(P＜0.05)。
(4) TUNEL法檢測細胞凋亡: 25、50 、100 μg/mL組rMSCs細胞凋亡個數分別為6.0±1.0、8.0±1.0、17.3±1.5，僅100 μg/mL組細胞凋亡個數與對照組(5.0±2.0)差異有統計學意義(P＜0.05)。
(5) 透射電鏡觀察SPIO標記rMSCs形態:僅100 μg/mL組rMSCs細胞形態較對照組細胞發生明顯改變，表現為細胞體積變小，胞膜皺褶消失，胞質濃縮，細胞器密集，散在包涵物，細胞核有不同程度的凋亡現象：胞核異染色質增多，且高度盤繞，部分細胞核染色體有裂解現象(見圖 5)。
圖5
透射電鏡觀察SPIO標記rMSCs細胞形態(5 600×)
Figure5.
TEM observation of SPIO labeled rMSCs(5 600 ×)
2.3 不同濃度SPIO對rMSCs分化能力影響
(1) 分化誘導(SPIO標記)：① 油紅O染色：對照組、25 μg/mL組、50 μg/mL組陽性細胞數較多，細胞體積較大，胞質內充滿大量串珠狀脂滴。100 μg/mL組陽性細胞數明顯減少，細胞不同程度萎縮，胞質內脂滴也明顯減少。② 茜素紅染色：對照組、25 μg/mL組 、50 μg/mL組細胞形成大量紅色鈣結節,結節直徑可達496 μm; 100 μg/mL組細胞鈣結節形成明顯減少，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。③ Ⅱ型膠原免疫組化：誘導14 d后，對照組、25 μg/mL組、50 μg/mL組、100 μg/mL組細胞Ⅱ型膠原表達均為陽性，但對照組、25 μg/mL組、50 μg/mL組為強陽性，經灰度值半定量分析，100 μg/mL組與其它三組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。④ vWF型膠原免疫組化：對照組、25 μg/mL組、50 μg/mL 組陽性細胞率分別為78%、76%、73%，100 μg/mL組陽性細胞率(51%)顯著低于前三組(P＜0.05)(見圖 6)。
圖6
SPIO標記rMSCs分化誘導染色結果(200×)
油紅O染色: (a)對照組,(b) 25
Oil red O staining: (a) control,(b) 25
(2) AKP測定：對照組、25 μg/mL組、50 μg/mL組、100 μg/mL組AKP值分別為2.9±0.01、2.6±0.017、2.2±0.22、1.9±0.47。100 μg/mL組顯著低于對照組(P＜0.05)(見表 2)。
表2
各組rMSCs AKP測定OD值(±s,n=7)
Table2.
OD value of AKP in rMSCs (±s,n=7)
3 討論
3.1 不同濃度SPIO標記rMSCs的效果分析
SPIO有效成分是Fe3O4 晶體核心,被包以葡聚糖右旋糖酐或其他物質，包覆后的SPIO具有一定的超順磁性、生物活性，能明顯縮短周圍組織的T2值，因此它是目前研究比較熱門的一類MRI對比劑，但是SPIO顆粒帶有負電荷，會與細胞膜發生排斥，影響標記率[5]。目前，在臨床試驗上多采用聚陽離子轉染劑、脂質體、受體介導等方法對氧化鐵進行修飾來提高標記率[6]。本實驗采用0.75 μg/mL PLL包被SPIO，中和SPIO表面負電荷，來提高標記率。結果發現，普魯氏藍染色：25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL組SPIO標記率分別為75%、97%、100%。細胞鐵含量的檢測：25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL組細胞鐵含量分別為(14.4±1.05)、(17.7±0.36)、(20.4±0.97) pg/cell。透射電鏡觀察SPIO標記rMSCs：胞質內見許多囊泡樣包涵體，且隨SPIO濃度的增加而增加。這與Barczewska等[7]的研究結果一致。盡管SPIO 顆粒具有很好的細胞相容性和生物可利用度，但是由于其帶有負電荷，而rMSCs細胞膜表面也帶有負電荷，兩者可能互相排斥，所以往往導致SPIO 顆粒標記率較低。我們采用帶正電荷的PLL生物化SPIO 顆粒表面，形成復合物PLL-SPIO，更有利于rMSCs的內吞，進而達到干細胞的有效標記。綜合本實驗結果可見，通過使用PLL包被SPIO來提高標記率，是有效的。
為能進一步檢測出MRI(T1WI、T2WI和T2*WI)序列對不同濃度SPIO標記細胞具體的成像差異，我們將含SPIO細胞均勻溶解在瓊脂糖中行MRI掃描。結果顯示，MRI(T1WI、T2WI和T2*WI)序列信號均呈低信號：其中，掃描相同濃度標記細胞，T2*WI序列信號降低最明顯；25 μg/mL組就可以明顯引起信號改變，與50 μg/mL組、100 μg/mL組差異無統計學意義。這與譚延斌等[8]對SPIO標記血管內皮細胞MRI效應相關性的研究是一致的。Hu等[9]采用7、14、28、56 μg/mL濃度的SPIO標記MSCs后進行示蹤，發現各濃度組可有效標記細胞，且MRI掃描結果顯示體內動物脊髓損傷處T2弛豫信號降低。可見，適宜濃度SPIO標記細胞是可行的。
3.2 不同濃度SPIO對rMSCs生物學活性影響
SPIO由于具有典型的晶體結構,被包以組織相容物，所以具有其他對比劑無可比擬的超順磁性及組織細胞相容性。但是，SPIO在標記細胞的同時，也會對細胞產生一定的生物學影響[10]。本部分實驗就以不同負荷濃度的SPIO標記細胞，透射電鏡觀察SPIO標記rMSCs形態，僅100 μg/mL組rMSCs細胞形態較對照組細胞發生明顯改變，表現為胞核異染色質增多，且高度盤繞，部分細胞核染色體有裂解現象。細胞增殖能力檢測：僅100 μg/mL組rMSCs OD值與未標記細胞間差異有統計學意義(P＜0.05)。TUNEL法檢測細胞凋亡: 僅100 μg/mL組rMSC細胞凋亡個數與未標記細胞間差異有統計學意義(P＜0.05)。劉佳等[11]發現，當SPIO濃度為25 μg/mL,MSCs細胞增殖能力沒有明顯改變，當SPIO濃度為75 μg/mL時,細胞增殖能力明顯減弱。提示高濃度的SPIO標記干細胞時，對細胞生物學活性是有一定影響的。
3.3 不同濃度SPIO對rMSCs分化能力影響
MSCs主要存在于骨髓基質中,屬于成體干細胞，具有多項分化能力，可分化為神經元和神經膠質細胞、成骨細胞、脂肪細胞和內皮細胞等。MSCs在組織再生、藥物生物控釋方面處于不可替代的重要地位，然而干細胞進行相關應用時究竟在體內的轉歸如何，這值得我們深入探討。目前，分子影像技術可實時、動態地觀察細胞或分子在體內的影像變化，在干細胞示蹤方面發揮著重要作用。SPIO在標記細胞的同時，是否會影響細胞分化能力，成為干細胞體內轉歸研究的一個重點。本實驗對SPIO標記的rMSCs進行成骨、成脂、成軟骨、成內皮多向分化誘導，結果發現，25 μg/mL、50 μg/mL濃度標記時，rMSCs的各向分化能力未受影響，僅100 μg/mL組rMSCs分化能力明顯減弱(P＜0.05)。Reddy等[12]采用殼聚糖修飾SPIO (Chitosan-SPIO)標記MSCs，發現濃度增加至200 μg/mL時，Chitosan-SPIO對細胞體外遷移和分化能力都無明顯影響。與本研究結果不一致的原因，可能與殼聚糖的修飾有關。
綜上，本研究采用不同濃度的SPIO 標記rMSCs，發現25 μg/mL和50 μg/mL濃度的PLL-SPIO可有效標記rMSCs，100 μg/mL濃度的PLL-SPIO對rMSCs增殖活性和分化能力有抑制作用。本實驗采用美國FDA已經批準使用的"生物化"物質，制備PLL-SPIO復合物，既能提高rMSCs的標記率，也不影響細胞增殖和分化活性，這為SPIO進一步的臨床MRI分子影像應用提供了實驗依據。然而，干細胞體內示蹤涉及到細胞在體內的再循環，其體內外的運動遷徙能力以及體內細胞轉歸如何仍需我們進一步深入研究。
引言
近年來，隨著科學技術的發展，分子生物學與現代醫學影像技術相互結合，形成一門新興的邊緣學科--分子影像學(molecular imaging)[1]。目前,分子影像學主要包括核素成像、光學成像和磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)三大類。在這三類成像技術中，MRI以其三維采集成像、高分辨力、高對比等優勢而備受關注。其中，對比劑的更新對MRI貢獻頗大。對比劑的主要作用是改變靶組織的弛豫時間，增強與周圍正常組織的對比，從而實現對疾病特性和種類的早期診斷。超順磁性氧化鐵(superparamagnetic oxide iron,SPIO) 是目前研究比較熱門的一類MRI對比劑，它的有效成分是Fe3O4 晶體核心,被包以組織相溶物，包覆后的SPIO具有一定的超順磁性、生物活性，能明顯縮短周圍組織的T2值，因而SPIO有望用于臨床早期的分子影像診斷。但是，近期國內外的學者研究發現，SPIO在標記細胞的同時，也會對細胞增殖、分化能力等生物學活性產生一定的影響，且隨標記濃度的不同而不同[2]。本實驗以不同濃度的SPIO標記原代分離培養的大鼠骨髓間充質干細胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs)，綜合評價SPIO對rMSCs生物學活性及體外MRI成像效應的影響，為臨床影像對比劑的進一步更新發展提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
成年SPF級SD大鼠，10只。雌雄不限，體質量(150±20)g，購自新疆醫科大學實驗動物中心。
1.2 主要試劑和儀器
SPIO(四川大學化學工程學院趙強教授合成提供)[3]。DMEM-L、PBS、胰蛋白酶、胎牛血清、雙抗(Hyclone)；異丁基甲基黃嘌、CCK-8、吲哚美辛、胰島素、茜素紅、β-磷酸甘油、熒光標記抗大鼠單抗PE-CD45、FITC-CD90、PEcy5-CD29、TGF-β1、bFGF(Sigma)；AKP染色試劑盒、Ⅰ型膠原免疫組化試劑盒、Ⅱ型膠原免疫組化試劑盒(南京建成)；NSE型膠原免疫組化試劑盒、凋亡試劑盒(武漢博士德)。
倒置相差顯微鏡(Olympus)，CO2培養箱(美國Thermo公司)，超凈工作臺(上海設備總廠)，超聲清洗儀(Branson公司)，原子吸收分光光度計(北京第二光學儀器廠)，EPTCSXL-31240型流式細胞儀(Coulter公司)，離心沉淀機(上海醫用分析儀器廠)，3.0T核磁共振系統(GE公司)。
1.3 實驗方法
1.3.1 Brookhaven Zeta粒度分析儀檢測SPIO粒徑
用PBS進一步稀釋SPIO、PLL-SPIO溶液，調整其濃度為25 μg/mL，將2 mL SPIO、PLL-SPIO 溶液加入Brookhaven Zeta粒度分析儀中的比色杯中進行有效粒徑的檢測。
1.3.2 rMSCs分離、培養及鑒定
按照文獻及本課題組的方法獲取原代rMSCs[4]，采用透射電鏡、流式細胞術表面分子標記物CD45、CD90、CD29、分化誘導法等進行干細胞鑒定[3]。采用傳代至第4代的rMSCs進行以下實驗。
1.3.3 不同濃度SPIO標記rMSCs效果檢測
(1) 不同濃度SPIO標記rMSCs：參考文獻[5]方法，將SPIO(50、100、200 μg/mL)和1.5 μg/mL多聚賴氨酸(PLL)等體積混合，室溫振蕩60 min，最后鐵、多聚賴氨酸終濃度分別為25、50、100 μg/mL和0.75 μg/mL。將上述溶液加入第4代rMSCs中,37 ℃、體積分數5% CO2條件下孵育24 h。實驗分組：設置不同濃度(25、50、100 μg/mL)PLL-SPIO標記的rMSCs為實驗組，同時設未標記rMSCs為對照組。
(2) 透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察SPIO標記效果：選取各組細胞，吸掉細胞培養基，用PBS充分沖洗，去除細胞外鐵，胰酶消化。離心后，戊二醛固定，丙酮脫水，環氧樹脂包埋，修塊、切片，枸櫞酸鉛染色，于透射電鏡下觀察SPIO粒子的大小和形態。
(3) 普魯氏藍染色：選取各組細胞，吸掉培養液，PBS漂洗3次，滴加4%多聚甲醛固定15 min。滴加酸性亞鐵氫化鉀溶液(2%亞鐵氫化鉀和2%HCl的體積比為1∶1)孵育30 min，水洗。顯微鏡下觀察并拍照，統計鐵染色陽性率。
(4) 細胞鐵含量檢測：選取各組細胞，吸掉細胞培養基，PBS沖洗細胞2次，胰酶消化細胞，收集實驗組及對照組細胞(1×106)。將細胞放于干燥箱(80 ℃)2 h。后滴加150 μL濃HCl，常溫過夜，接著將細胞放于干燥箱(60 ℃)2 h ，使SPIO顆粒表面葡聚糖近一步消化。滴加PBS稀釋濃HCl 10倍，原子分光光度計測量鐵含量。
(5) 不同濃度SPIO標記rMSCs體外MRI掃描：將各組SPIO標記細胞快速均勻溶于盛有1%瓊脂糖的冷凍管中(A:1×106,B: 0.5×106,C:0.25×106,D:1.25×105,E:6.25×104)，待瓊脂冷卻凝固后，進行MRI掃描。采用3.0TMR，實驗專用線圈。成像序列：① SE序列：T1WI，TR 400.00 ms，TE 15.0 ms，Bandwidth 20.83，NEX 2.0；② 快速自旋回波(FSE)序列：T2WI，TR 4 500 ms，TE 100 ms，Bandwidth 21，NEX 2.0；③ 梯度回波序列(GRE)：T2*WI，TR 400 ms，TE 23.0 ms，Bandwidth 20.83，Fip Angle:15，NEX 2.0。采用3.0 TMRI自動測量系統，測量每種掃描序列圖像上信號強度(signal intensity,SI)，計算每種序列信號強度衰減率(△SI)。△SI=(SPIO標記-SPIO未標記)/SPIO未標記×100%。
1.3.4
不同濃度SPIO對rMSCs生物活性影響
(1) rMSCs核形態學觀察：選取各組細胞，吸棄培養液，PBS清洗3次； 4%多聚甲醛固定15 min，加入熒光染料DAPI/PI，37 ℃避光孵育1 h,激光共聚焦顯微鏡405nm/488nm觀察。
(2) 細胞增殖能力檢測：選取各組細胞，按細胞密度1×103/孔接種于96孔培養板中，置入于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。實驗孔和對照孔每3天換液1次。此后每天固定時間，連續8天測定光吸收值(OD)。以SPIO濃度為橫坐標，以各組8天測定光吸收值(OD)均數為縱坐標,繪制柱狀圖。
(3) 細胞周期測定：取各組細胞，胰酶消化制成單細胞懸液1×106/mL，緩慢加入1.5 mL 75%乙醇(預冷)4 ℃固定過夜，避光加入500 μl RNAse、碘化丙啶并染色30 min，流式細胞儀488 nm檢測G0/G1期細胞占總細胞的百分率。
(4) TUNEL法檢測細胞凋亡: 取各組細胞，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，3% H2O2室溫處理10 min。滴加標記緩沖液(Labeling Buffer) 20 μL，含TdT和DIG-d-UTP 各1 μL，37 ℃標記2 h。封閉液常溫作用30 min，滴加生物素化抗地高辛抗體20 μL，37 ℃反應30 min。滴加SABC 20 μL，37 ℃反應30 min。DAB 顯色，水洗。細胞核染為棕色為陽性細胞。在倒置顯微鏡下,應用Image Pro Plus 5.0專業圖像分析軟件，隨機選取不同視野，計數陽性細胞，并得出細胞凋亡率。
(5) 透射電鏡觀察SPIO標記rMSCs形態：取各組細胞，吸掉細胞培養基，用PBS充分沖洗，去除細胞外鐵，胰酶消化。離心后，戊二醛固定，丙酮脫水，環氧樹脂包埋，修塊、切片，枸櫞酸鉛染色，電鏡觀察rMSCs形態。
1.3.5 不同濃度SPIO對rMSCs分化能力影響
選擇第4代細胞，接種于3.5 cm培養皿，待細胞匯合率達到80%時，用25、50、 100 μg/mL SPIO孵育rMSCs 24 h后，分別進行細胞誘導分化實驗：
(1) 內皮細胞分化誘導劑(10 ng/mL VEGF、2 ng/mL bFGF) 14 d后進行vWF免疫組化染色。應用專業圖像分析軟件，隨機選取不同視野，計數陽性細胞，并得出陽性細胞率。
(2) 成脂誘導(1×10-6mol/L地塞米松、5 mg/L胰島素、1×10-4mol/L IBMX、6×10-7mol/L吲哚美辛)7 d后，進行油紅O染色。
(3) 成骨誘導(1×10-7mol/L地塞米松、1×10-2mol/L β-甘油磷酸鈉、50mg/L維生素C)5、7、10、14 d后，按照堿性磷酸酶(AKP)檢測試劑盒說明進行操作，于酶標儀520 nm波長處進行檢測。AKP含量(金氏U/100mL)=(測定管吸光度/標準管吸光度)×酚標準品濃度×100 mL。誘導21 d后進行茜素紅染色，進行鈣結個數和面積測量。
(4) 成軟骨誘導(10 ng/mL TGF-β1、1×10-7 mol/L地塞米松、50 mg/L維生素C、1% ITS-A)14 d后進行Ⅱ型膠原免疫組化染色；同時選取細胞樣本進行EDTA、Ⅱ型膠原酶、木瓜蛋白酶消化，采用DMB比色法測定軟骨細胞外糖胺聚糖(GAG)含量：按照試劑盒說明書制作硫酸軟骨素標準曲線，根據曲線求得GAG濃度。GAG含量=GAG濃度×液體總量。
1.4 數據統計和結果分析
所有實驗均重復3～4次。所有參數均采用SPSS 16.0統計軟件包進行多個樣本均數單因素方差分析(ANOVA)，并用q檢驗進行比較，P＜0.05代表有統計學意義。
2 結果
2.1 不同濃度SPIO標記rMSCs效果檢測
(1) 粒子形態和粒徑分析: 透射電鏡下，SPIO、PLL-SPIO呈單個分散，偶有聚集現象。核心Fe3O4呈晶體狀，外部可見有機物質包裹，SPIO、PLL-SPIO之間均有相互連接現象(見圖 1)。Brookhaven Zeta粒度分析儀檢測SPIO粒徑：SPIO、PLL-SPIO有效粒徑分別為48、51 nm，分散度分別為0.3、0.4。
圖1
透射電鏡觀測粒子形態
Figure1.
TEM observation of the particle morphology
SPIO標記rMSCs結果，可見各濃度組細胞胞質內囊泡樣包涵體增多，包涵體內有濃聚細小的鐵顆粒，呈圓形或橢圓形，電子密度較高，相對獨立，與胞核和胞質隔離(25 μg/mL組見圖 2a)。
圖2
SPIO標記rMSCs結果檢測
(a): 25
(a) TEM photo of 25
(2) 普魯氏藍染色：25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL組細胞胞質內均存在藍色顆粒，且顏色依次加深，標記率分別為75%、97%、100%，與對照組比較以及組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)(25μg/mL組見圖 2b)。
(3) 細胞鐵含量的檢測：25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL組細胞內鐵含量分別為(14.4±1.05)、(17.7±0.36)、(20.4±0.97) pg/細胞，與對照組(0.4±0.07) pg/細胞比較以及組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)。
(4) 不同濃度SPIO標記rMSCs體外MRI掃描：MRI(T1WI、T2WI和T2*WI)序列信號均呈低信號：其中，掃描1×106細胞，T1WI、T2WI和T2*WI序列信號分別降低47.9%±9.1%、67.3%±8.4%、82.5%±5.6%(25 μg/mL組)；51.2%±7.9%、71.2%±9.1%、83.6%±2.5%(50 μg/mL組)；57.5%±3.4%、74.7%±5.6%、86.3%±8.2%(100 μg/mL組)。25 μg/mL組、50 μg/mL組、100 μg/mL組信號平均降低65.6%±7.9%、70.2%±0.8%、72.7%±10.3%。以上說明25 μg/mL組就可以明顯引起信號改變，與50 μg/mL組、100 μg/mL組比較差異無統計學意義(P＞0.05)(見表 1、圖 3)。
表1
T1WI、T2WI及T2*WI序列冠狀位圖像各管底部SI值(
圖3
SPIO標記rMSCs體外MRI掃描圖像
Ⅰ：對照組；Ⅱ：100
Ⅰ：Control； Ⅱ：100
2.2 不同濃度SPIO對rMSCs生物活性影響
(1) 激光共聚焦觀察rMSCs核形態學變化：25 μg/mL組和50 μg/mL組細胞均沒有發生明顯凋亡，100 μg/mL組rMSCs發生明顯凋亡，細胞核高度濃縮，體積變小，部分發生裂解(見圖 4)。
圖4
激光共聚焦檢測SPIO標記rMSCs核形態學改變
箭頭所指為核凋亡現象
Figure4. Nuclear morphological changes of SPIO labeled rMSCs by laser confocal detectionarrows indicate the phenomenon of nuclear apoptosis
(2) 細胞增殖能力檢測：25 μg/mL組和50 μg/mL組rMSCs OD平均值分別為0.52±0.25和0.51±0.26，與未標記細胞(0.54±0.16)間差異無統計學意義(P＞0.05)。100 μg/mL組rMSCs OD值為0.44±0.22，與未標記細胞間差異有統計學意義(P＜0.05) 。
(3) 流式細胞儀檢測細胞周期：25 μg/mL組和50 μg/mL組rMSCs分別有61.1%±9.1%、69.8%±4.1%處于G0/G1期，與未標記細胞(66.1%±4.5%)間差異無統計學意義(P＞0.05)。100 μg/mL組rMSCs有80.1%±1.4%處于G0/G1期，與未標記細胞間差異有統計學意義(P＜0.05)。
(4) TUNEL法檢測細胞凋亡: 25、50 、100 μg/mL組rMSCs細胞凋亡個數分別為6.0±1.0、8.0±1.0、17.3±1.5，僅100 μg/mL組細胞凋亡個數與對照組(5.0±2.0)差異有統計學意義(P＜0.05)。
(5) 透射電鏡觀察SPIO標記rMSCs形態:僅100 μg/mL組rMSCs細胞形態較對照組細胞發生明顯改變，表現為細胞體積變小，胞膜皺褶消失，胞質濃縮，細胞器密集，散在包涵物，細胞核有不同程度的凋亡現象：胞核異染色質增多，且高度盤繞，部分細胞核染色體有裂解現象(見圖 5)。
圖5
透射電鏡觀察SPIO標記rMSCs細胞形態(5 600×)
Figure5.
TEM observation of SPIO labeled rMSCs(5 600 ×)
2.3 不同濃度SPIO對rMSCs分化能力影響
(1) 分化誘導(SPIO標記)：① 油紅O染色：對照組、25 μg/mL組、50 μg/mL組陽性細胞數較多，細胞體積較大，胞質內充滿大量串珠狀脂滴。100 μg/mL組陽性細胞數明顯減少，細胞不同程度萎縮，胞質內脂滴也明顯減少。② 茜素紅染色：對照組、25 μg/mL組 、50 μg/mL組細胞形成大量紅色鈣結節,結節直徑可達496 μm; 100 μg/mL組細胞鈣結節形成明顯減少，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。③ Ⅱ型膠原免疫組化：誘導14 d后，對照組、25 μg/mL組、50 μg/mL組、100 μg/mL組細胞Ⅱ型膠原表達均為陽性，但對照組、25 μg/mL組、50 μg/mL組為強陽性，經灰度值半定量分析，100 μg/mL組與其它三組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。④ vWF型膠原免疫組化：對照組、25 μg/mL組、50 μg/mL 組陽性細胞率分別為78%、76%、73%，100 μg/mL組陽性細胞率(51%)顯著低于前三組(P＜0.05)(見圖 6)。
圖6
SPIO標記rMSCs分化誘導染色結果(200×)
油紅O染色: (a)對照組,(b) 25
Oil red O staining: (a) control,(b) 25
(2) AKP測定：對照組、25 μg/mL組、50 μg/mL組、100 μg/mL組AKP值分別為2.9±0.01、2.6±0.017、2.2±0.22、1.9±0.47。100 μg/mL組顯著低于對照組(P＜0.05)(見表 2)。
表2
各組rMSCs AKP測定OD值(±s,n=7)
Table2.
OD value of AKP in rMSCs (±s,n=7)
3 討論
3.1 不同濃度SPIO標記rMSCs的效果分析
SPIO有效成分是Fe3O4 晶體核心,被包以葡聚糖右旋糖酐或其他物質，包覆后的SPIO具有一定的超順磁性、生物活性，能明顯縮短周圍組織的T2值，因此它是目前研究比較熱門的一類MRI對比劑，但是SPIO顆粒帶有負電荷，會與細胞膜發生排斥，影響標記率[5]。目前，在臨床試驗上多采用聚陽離子轉染劑、脂質體、受體介導等方法對氧化鐵進行修飾來提高標記率[6]。本實驗采用0.75 μg/mL PLL包被SPIO，中和SPIO表面負電荷，來提高標記率。結果發現，普魯氏藍染色：25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL組SPIO標記率分別為75%、97%、100%。細胞鐵含量的檢測：25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL組細胞鐵含量分別為(14.4±1.05)、(17.7±0.36)、(20.4±0.97) pg/cell。透射電鏡觀察SPIO標記rMSCs：胞質內見許多囊泡樣包涵體，且隨SPIO濃度的增加而增加。這與Barczewska等[7]的研究結果一致。盡管SPIO 顆粒具有很好的細胞相容性和生物可利用度，但是由于其帶有負電荷，而rMSCs細胞膜表面也帶有負電荷，兩者可能互相排斥，所以往往導致SPIO 顆粒標記率較低。我們采用帶正電荷的PLL生物化SPIO 顆粒表面，形成復合物PLL-SPIO，更有利于rMSCs的內吞，進而達到干細胞的有效標記。綜合本實驗結果可見，通過使用PLL包被SPIO來提高標記率，是有效的。
為能進一步檢測出MRI(T1WI、T2WI和T2*WI)序列對不同濃度SPIO標記細胞具體的成像差異，我們將含SPIO細胞均勻溶解在瓊脂糖中行MRI掃描。結果顯示，MRI(T1WI、T2WI和T2*WI)序列信號均呈低信號：其中，掃描相同濃度標記細胞，T2*WI序列信號降低最明顯；25 μg/mL組就可以明顯引起信號改變，與50 μg/mL組、100 μg/mL組差異無統計學意義。這與譚延斌等[8]對SPIO標記血管內皮細胞MRI效應相關性的研究是一致的。Hu等[9]采用7、14、28、56 μg/mL濃度的SPIO標記MSCs后進行示蹤，發現各濃度組可有效標記細胞，且MRI掃描結果顯示體內動物脊髓損傷處T2弛豫信號降低。可見，適宜濃度SPIO標記細胞是可行的。
3.2 不同濃度SPIO對rMSCs生物學活性影響
SPIO由于具有典型的晶體結構,被包以組織相容物，所以具有其他對比劑無可比擬的超順磁性及組織細胞相容性。但是，SPIO在標記細胞的同時，也會對細胞產生一定的生物學影響[10]。本部分實驗就以不同負荷濃度的SPIO標記細胞，透射電鏡觀察SPIO標記rMSCs形態，僅100 μg/mL組rMSCs細胞形態較對照組細胞發生明顯改變，表現為胞核異染色質增多，且高度盤繞，部分細胞核染色體有裂解現象。細胞增殖能力檢測：僅100 μg/mL組rMSCs OD值與未標記細胞間差異有統計學意義(P＜0.05)。TUNEL法檢測細胞凋亡: 僅100 μg/mL組rMSC細胞凋亡個數與未標記細胞間差異有統計學意義(P＜0.05)。劉佳等[11]發現，當SPIO濃度為25 μg/mL,MSCs細胞增殖能力沒有明顯改變，當SPIO濃度為75 μg/mL時,細胞增殖能力明顯減弱。提示高濃度的SPIO標記干細胞時，對細胞生物學活性是有一定影響的。
3.3 不同濃度SPIO對rMSCs分化能力影響
MSCs主要存在于骨髓基質中,屬于成體干細胞，具有多項分化能力，可分化為神經元和神經膠質細胞、成骨細胞、脂肪細胞和內皮細胞等。MSCs在組織再生、藥物生物控釋方面處于不可替代的重要地位，然而干細胞進行相關應用時究竟在體內的轉歸如何，這值得我們深入探討。目前，分子影像技術可實時、動態地觀察細胞或分子在體內的影像變化，在干細胞示蹤方面發揮著重要作用。SPIO在標記細胞的同時，是否會影響細胞分化能力，成為干細胞體內轉歸研究的一個重點。本實驗對SPIO標記的rMSCs進行成骨、成脂、成軟骨、成內皮多向分化誘導，結果發現，25 μg/mL、50 μg/mL濃度標記時，rMSCs的各向分化能力未受影響，僅100 μg/mL組rMSCs分化能力明顯減弱(P＜0.05)。Reddy等[12]采用殼聚糖修飾SPIO (Chitosan-SPIO)標記MSCs，發現濃度增加至200 μg/mL時，Chitosan-SPIO對細胞體外遷移和分化能力都無明顯影響。與本研究結果不一致的原因，可能與殼聚糖的修飾有關。
綜上，本研究采用不同濃度的SPIO 標記rMSCs，發現25 μg/mL和50 μg/mL濃度的PLL-SPIO可有效標記rMSCs，100 μg/mL濃度的PLL-SPIO對rMSCs增殖活性和分化能力有抑制作用。本實驗采用美國FDA已經批準使用的"生物化"物質，制備PLL-SPIO復合物，既能提高rMSCs的標記率，也不影響細胞增殖和分化活性，這為SPIO進一步的臨床MRI分子影像應用提供了實驗依據。然而，干細胞體內示蹤涉及到細胞在體內的再循環，其體內外的運動遷徙能力以及體內細胞轉歸如何仍需我們進一步深入研究。
