本實驗制備采用聚乙烯亞胺修飾的石墨烯基納米銀復合材料(AgNP/rGo-PEI),并對其性能進行評價。其方法是首先制備AgNP/rGo-PEI,然后通過與聚乙烯吡咯烷酮修飾的納米銀(PVP/AgNP)的比較,分析其穩定性、抗菌活性和細胞毒性。研究發現,納米銀(AgNP)在AgNP/rGO-PEI表面的分布相對均勻,其質量分數為4.5%,粒徑為6~13 nm。在無光或光照強度為3 000 lx的低溫光照儀環境下儲存10 d,PVP/AgNP聚集作用較為明顯,而AgNP/rGO-PEI則分散性良好,聚集作用不明顯。AgNP/rGO-PEI具有更加良好的抗菌活性、生物相容性和相對較低的生物毒性。因此AgNP/rGo-PEI質量可靠,性能良好,具有廣闊的應用前景。
引用本文： 申玉璞, 何剪太, 張陽德, 申玉坤, 張龍姣. 石墨烯基納米銀復合材料的制備及性能評價. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(2): 357-360. doi: 10.7507/1001-5515.20140067 復制
引言
石墨烯是一種具有高光學吸收、高強度、極大比表面積、較低生產成本(相對于碳納米管)等優異性質的新型二維碳納米材料，由sp2碳原子組成，是研究碳材料各種晶體理論計算和推導的基礎結構，非常適合于開發高性能的復合材料。由于其本身是由碳元素構成，所以化學性質相對較惰性。石墨烯表面能夠負載納米級別的金屬單質粒子如納米銀、金、銅、鉑、鈀等，還可以負載某些納米級金屬化合物如四氧化三鐵、氧化鋁、氧化鋅等。此時，石墨烯相當于將這些對于某些化學反應具有較好催化效果的納米粒子富集和固定在一起[1]，并且由于其表面有利于電子的遷移，所以能夠大幅度地提高催化效率。氧化石墨烯表面擁有非常豐富的親水性官能團，因此能穩定地分散于水中，并且表面經過良好修飾的氧化石墨烯能夠穩定存在于高鹽溶液和生理條件下，這些特性為其在生物醫學領域中的應用奠定了重要基礎。
聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)是具有眾多氨基和良好水溶性的一種高分子聚合物，它能夠對氧化石墨烯上的各種親水性官能團進行共價修飾，從而獲得水溶性良好的功能化石墨烯基底材料。與此同時，由于其帶有正電荷，因此還能夠對納米銀起到良好的穩定作用[2]。
目前，關于功能化石墨烯的研究還主要集中在物理學、化學等領域，而其在生物醫學領域的研究還相對較少，如靶向藥物輸運、生物檢測、腫瘤治療以及石墨烯生物安全性等的研究還處于剛剛起步的階段[3-6]。
本研究通過對用聚乙烯亞胺修飾的石墨烯基納米銀復合材料(silver nanoparticles/polyethyleneimine-reduction graphene oxide,AgNP/rGo-PEI)進行穩定性、抗菌活性以及生物毒性的研究，以期為發展新型的高效抗菌復合材料提供一個新的思路和方法。
1 實驗部分
1.1 試劑與儀器
1.1.1 試劑
聚乙烯亞胺(長沙晶康新材料科技有限公司)；聚乙烯毗咯烷酮(PVP)(國藥集團化學試劑有限公司)；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCI)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，分析純(Amresco 公司)；硝酸銀和石墨粉(粒徑為40~50 μm)，分析純(上海國藥集團化學試劑有限公司)；營養肉湯和營養瓊脂培養基(上海卒瑞生物科技有限公司)；大腸桿菌(E. coli ) ATCC 8099和金黃色葡萄球菌(S. aureus) ATCC 6538(上海卒瑞生物科技有限公司)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(噻唑藍、MTT)(Sigma-aldrich公司)；人成纖維細胞(中南大學湘雅醫學院)。
1.1.2 儀器
磁力攪拌恒溫水浴鍋(北京維欣儀奧科技發展有限公司)；SIGMA超速冷凍離心機(德國SIGMA公司)；81-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；超聲波清洗器(昆山超聲波清洗器有限公司)；電子分析天平(日本島津公司)；PHS-3C型酸度計(上海雷磁儀器廠)；電感耦合等離子光譜發生儀(美國PE Optima 4300DV);透射電子顯微鏡(H-7650B，日本日立公司)；紫外-可見分光光度儀(美國Thermo公司)。
1.2 氧化石墨烯的制備
采用Hummer法[7]制備氧化石墨烯：移取23 mL濃硫酸，在冰浴條件下放置一段時間使濃硫酸的溫度接近冰浴溫度，然后在不斷攪拌的情況下慢慢將1 g石墨粉加入濃硫酸當中，再稱取3.5 g高錳酸鉀逐漸加入到濃硫酸中，攪拌混勻，保持冰浴內攪拌反應2 h，從冰浴中取出后在室溫條件下繼續攪拌反應1 h，量筒量取46 mL水，逐滴緩慢滴加，保持混合物溫度不要過高，之后將其放在90~100 ℃的水浴中，繼續攪拌反應30 min，從熱水浴中取出之后再加入140 mL水和10 mL 30 wt%雙氧水變成亮黃色，混勻之后離心分離，配制質量分數5%的鹽酸溶液和無水乙醇分別對分離出的產物進行離心清洗至中性，恒溫干燥箱50 ℃下烘干即得氧化石墨烯。
1.3 AgNP/rGO-PEI的制備
首先將 10 mL已經制備好的氧化石墨烯上層清液(25 mg/mL)分散于 45 mL超純水中，然后將 100 mL聚乙烯亞胺溶液(23 mg/mL)、400 mg EDC·HCI和 240 mg NHS依次加入氧化石墨烯上層清液經過水浴超聲2 h后獲得的均勻穩定的分散液中，并調節其pH值到6~7。室溫反應 24 h，之后將 100 mg硝酸銀加入到分散液中并超聲 2 h，不斷攪拌下加入 5 mL質量分數為50%的水合肼之后在30 ℃下還原反應 0.5 h。再加入 50 mL同樣質量分數的水合肼并85 ℃下還原反應 48 h，此時將所得到的墨綠色分散液用直徑為0.22 μm聚碳酸酯膜過濾并不斷用超純水洗滌。所收集到的AgNP/rGO-PEI復合物通過水浴超聲 15 min，重新分散在超純水中備用。
1.4 聚乙烯毗咯烷酮作保護劑的納米銀的制備
稱取 10 g葡萄糖和 3 g聚乙烯吡咯烷酮,溶解在去離子水中配制成 200 mL混合水溶液,利用氫氧化鈉溶液調節其pH值至11; 稱取 3 g硝酸銀配制成 50 mL水溶液。在恒溫水浴鍋中將上述溶液加熱至 70℃,在超聲振蕩和恒溫磁力攪拌下將硝酸銀溶液以30 滴/min的速度均勻地滴加到葡萄糖混合溶液中,攪拌20 min得到黑色懸濁液。將此懸濁液 10 000 r/min離心分離,所得固體沉淀用去離子水和無水醇各洗滌3遍,于 40 ℃下真空干燥3 h,得到聚乙烯吡咯烷酮作保護劑的納米銀粉(PVP/AgNP)。
1.5 抗菌實驗
取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌懸液先稀釋 10倍，確保菌落容易正常生長以及被正確計數，然后各取 0.1 mL置于 9.9 mL各自菌種的液體培養基中,在 10 mL含菌懸液中 (大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌液濃度1×107 cfu/mL),分別加入所制備的樣品,振蕩,使混合均勻,將制備好的稀釋液分別均勻涂在三塊培養基上，并在 37 ℃下放入恒溫培養箱中培養 24 h。每組試驗重復3次。
計算殺菌率的公式如下：
| $24h殺菌率\left( \% \right) = \left( {{N_0} - N} \right)/{N_0} \times 100\% $ |
式中：N0為培養24 h后原始對照組的菌落數; N為培養24 h后試驗組的菌落數。
1.6 細胞毒性實驗
調整人成纖維細胞密度為1×105個/mL,均勻接種到96孔板內,每孔 200 μL,用PVP/AgNP或AgNP/rGO-PEI分別在 37 ℃、5 % CO2條件下處理細胞 24 h。吸棄原培養液,倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。各孔用 DPBS 小心清洗 1 遍,加入DMEM 培養液 200 μL,再加入 5 g/L MTT 溶液 10 μL,繼續培養 4 h 后中止培養,小心吸去孔內培養液,每孔加入100 μL二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min。在酶標儀OD值 570 nm處測量各孔的吸光值。利用反向相差顯微鏡拍照獲得人成纖維細胞的形貌變化。利用SPSS17.0版本軟件進行統計分析。群組間的差異通過方差分析進行評估,檢驗水準為0.05。細胞相對增殖率(relative proliferation rate,RGR) 計算及細胞毒性評價標準參考ISO2109932-5，細胞相對增殖率(%) = 實驗組平均OD值/對照組OD均值×100%。細胞毒性試驗采用5分制法進行細胞毒性分級[8](見表 1)。
表1
材料毒性等級評價表
Table1.
Rank of material toxicity
2 結果與討論
將制作好的AgNP/rGo-PEI稀釋至約 10 mg/mL，滴在裝載在銅網上的碳膜上，置于室溫下干燥后用透射電子顯微鏡表征(見圖 1)。納米銀粒子形態呈球形,直徑為6~13 nm,分散性較好；顏色相對較明亮的區域為銅網上的碳膜基底，而相對較深的部分為rGO-PEI。通過電感耦合等離子光譜發生儀分析出AgNP在AgNP/rGO-PEI中的含量為 4.5 wt%。
圖1
AgNP/rGO-PEI的電鏡照片
Figure1.
AgNP/rGO-PEI by transmission electron microscope
2.1 穩定性分析
取裝有AgNP/rGO-PEI溶液和PVP/AgNP溶液的離心管各兩支，分別保存于避光狀態和光照強度為 3 000 lx的低溫光照儀環境各一支。之前先要對兩種溶液進行一次UV-VIS檢測：分別吸取兩種溶液 20μL，稀釋至 2 mL，置于 1 cm 厚比色皿中，用紫外-可見分光光度計測量從 200 ~ 800 nm 的吸收光譜檢測。10 d之后再分別對兩種狀態下保存的兩種溶液進行紫外-可見分光光度計檢測，結果見圖 2。
圖2
AgNP/rGO-PEI 和 PVP/AgNP 穩定性對比圖
Figure2.
Comparison of stability between AgNP/rGO-PEI and PVP/AgNP
對于抗菌材料來說，穩定性是非常重要的，UV-VIS圖譜中PVP/AgNP曲線的吸收峰從剛開始的 410 nm處移動到10 d以后的 420 nm，在光照條件下的吸收峰更是移動到了425 nm，吸收強度也大幅降低，說明AgNP的團聚現象已經比較明顯；在同樣條件下AgNP/rGO-PEI溶液的吸收峰的位置和強度變化都不大，沒有發現明顯的團聚現象。結果顯示：AgNP/rGO-PEI比PVP/AgNP更加穩定，在實際應用中更容易進行長期保存。
2.2 抗菌活性分析
AgNP/rGO-PEI抗菌性能測試結果如表 2所示。
表2
AgNP/rGO-PEI抗菌活性測試結果
Table2.
Test results of antibacterial activity of AgNP/rGO-PEI
從表 2可以看出，AgNP/rGO-PEI比PVP/AgNP具有更好的抗菌效果。究其原因普遍認為是石墨烯材料具有較大的比表面積這一特性。AgNP/rGO-PEI綜合了石墨烯大比表面積和銀離子抗菌活性的優點，從而使銀離子能夠更有效地與細菌相互作用。
2.3 細胞毒性分析
當PVP/AgNP溶液的濃度分別為 25、50和100 μg/mL時，細胞相對增殖率分別為49%、34%和28%，細胞毒性分級均為3級；AgNP/rGO-PEI在這三種濃度時，細胞相對增殖率分別為68%、53%和45%，濃度為 100 μg/mL時細胞毒性分級為3級，另外兩種濃度下細胞毒性均為2級。
如圖 3所示，人成纖維細胞呈扁平梭形，形態正常,生長良好(見圖 3左)；用AgNP/rGO-PEI處理 24 h之后的人成纖維細胞，形態已經開始發生改變，如細胞皺縮、突觸收起、細胞間距增大(見圖 3中)；用PVP/AgNP處理 24 h之后的成纖維細胞，細胞形態變得更加不規則，并且大多數細胞有損傷，變化更加明顯(見圖 3右)。
圖3
共同培養24 h后人成纖維細胞形態觀察
Figure3.
Human fibroblast morphology observation after co-cultured for 24 h
唐秋莎等[9]用聚乙烯亞胺修飾錳鋅鐵氧體磁性納米粒子，發現修飾后的納米粒子之間的團聚現象明顯減輕，等電點從 pH=7.0 提升到 pH=11.5。本文采用聚乙烯亞胺修飾石墨烯，然后將納米銀負載于其上，得到了石墨烯基納米銀復合抗菌材料，并且經過研究發現其具有良好的穩定性、抗菌活性，以及較低的生物毒性，生物安全性相對較高。
3 結論
本試驗結果表明,AgNP/rGO-PEI綜合了石墨烯的極大比表面積、高強度、高光學吸收的優點和納米銀優秀的殺菌性能，并且不是二者簡單的相加，相對于納米銀，AgNP/rGO-PEI具有更加良好的抗菌活性和生物相容性以及相對較低的生物毒性，這為我國發展新型高效抗菌復合材料提供了一個新的思路和方法，具有廣闊的應用前景。
引言
石墨烯是一種具有高光學吸收、高強度、極大比表面積、較低生產成本(相對于碳納米管)等優異性質的新型二維碳納米材料，由sp2碳原子組成，是研究碳材料各種晶體理論計算和推導的基礎結構，非常適合于開發高性能的復合材料。由于其本身是由碳元素構成，所以化學性質相對較惰性。石墨烯表面能夠負載納米級別的金屬單質粒子如納米銀、金、銅、鉑、鈀等，還可以負載某些納米級金屬化合物如四氧化三鐵、氧化鋁、氧化鋅等。此時，石墨烯相當于將這些對于某些化學反應具有較好催化效果的納米粒子富集和固定在一起[1]，并且由于其表面有利于電子的遷移，所以能夠大幅度地提高催化效率。氧化石墨烯表面擁有非常豐富的親水性官能團，因此能穩定地分散于水中，并且表面經過良好修飾的氧化石墨烯能夠穩定存在于高鹽溶液和生理條件下，這些特性為其在生物醫學領域中的應用奠定了重要基礎。
聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)是具有眾多氨基和良好水溶性的一種高分子聚合物，它能夠對氧化石墨烯上的各種親水性官能團進行共價修飾，從而獲得水溶性良好的功能化石墨烯基底材料。與此同時，由于其帶有正電荷，因此還能夠對納米銀起到良好的穩定作用[2]。
目前，關于功能化石墨烯的研究還主要集中在物理學、化學等領域，而其在生物醫學領域的研究還相對較少，如靶向藥物輸運、生物檢測、腫瘤治療以及石墨烯生物安全性等的研究還處于剛剛起步的階段[3-6]。
本研究通過對用聚乙烯亞胺修飾的石墨烯基納米銀復合材料(silver nanoparticles/polyethyleneimine-reduction graphene oxide,AgNP/rGo-PEI)進行穩定性、抗菌活性以及生物毒性的研究，以期為發展新型的高效抗菌復合材料提供一個新的思路和方法。
1 實驗部分
1.1 試劑與儀器
1.1.1 試劑
聚乙烯亞胺(長沙晶康新材料科技有限公司)；聚乙烯毗咯烷酮(PVP)(國藥集團化學試劑有限公司)；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCI)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，分析純(Amresco 公司)；硝酸銀和石墨粉(粒徑為40~50 μm)，分析純(上海國藥集團化學試劑有限公司)；營養肉湯和營養瓊脂培養基(上海卒瑞生物科技有限公司)；大腸桿菌(E. coli ) ATCC 8099和金黃色葡萄球菌(S. aureus) ATCC 6538(上海卒瑞生物科技有限公司)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(噻唑藍、MTT)(Sigma-aldrich公司)；人成纖維細胞(中南大學湘雅醫學院)。
1.1.2 儀器
磁力攪拌恒溫水浴鍋(北京維欣儀奧科技發展有限公司)；SIGMA超速冷凍離心機(德國SIGMA公司)；81-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；超聲波清洗器(昆山超聲波清洗器有限公司)；電子分析天平(日本島津公司)；PHS-3C型酸度計(上海雷磁儀器廠)；電感耦合等離子光譜發生儀(美國PE Optima 4300DV);透射電子顯微鏡(H-7650B，日本日立公司)；紫外-可見分光光度儀(美國Thermo公司)。
1.2 氧化石墨烯的制備
采用Hummer法[7]制備氧化石墨烯：移取23 mL濃硫酸，在冰浴條件下放置一段時間使濃硫酸的溫度接近冰浴溫度，然后在不斷攪拌的情況下慢慢將1 g石墨粉加入濃硫酸當中，再稱取3.5 g高錳酸鉀逐漸加入到濃硫酸中，攪拌混勻，保持冰浴內攪拌反應2 h，從冰浴中取出后在室溫條件下繼續攪拌反應1 h，量筒量取46 mL水，逐滴緩慢滴加，保持混合物溫度不要過高，之后將其放在90~100 ℃的水浴中，繼續攪拌反應30 min，從熱水浴中取出之后再加入140 mL水和10 mL 30 wt%雙氧水變成亮黃色，混勻之后離心分離，配制質量分數5%的鹽酸溶液和無水乙醇分別對分離出的產物進行離心清洗至中性，恒溫干燥箱50 ℃下烘干即得氧化石墨烯。
1.3 AgNP/rGO-PEI的制備
首先將 10 mL已經制備好的氧化石墨烯上層清液(25 mg/mL)分散于 45 mL超純水中，然后將 100 mL聚乙烯亞胺溶液(23 mg/mL)、400 mg EDC·HCI和 240 mg NHS依次加入氧化石墨烯上層清液經過水浴超聲2 h后獲得的均勻穩定的分散液中，并調節其pH值到6~7。室溫反應 24 h，之后將 100 mg硝酸銀加入到分散液中并超聲 2 h，不斷攪拌下加入 5 mL質量分數為50%的水合肼之后在30 ℃下還原反應 0.5 h。再加入 50 mL同樣質量分數的水合肼并85 ℃下還原反應 48 h，此時將所得到的墨綠色分散液用直徑為0.22 μm聚碳酸酯膜過濾并不斷用超純水洗滌。所收集到的AgNP/rGO-PEI復合物通過水浴超聲 15 min，重新分散在超純水中備用。
1.4 聚乙烯毗咯烷酮作保護劑的納米銀的制備
稱取 10 g葡萄糖和 3 g聚乙烯吡咯烷酮,溶解在去離子水中配制成 200 mL混合水溶液,利用氫氧化鈉溶液調節其pH值至11; 稱取 3 g硝酸銀配制成 50 mL水溶液。在恒溫水浴鍋中將上述溶液加熱至 70℃,在超聲振蕩和恒溫磁力攪拌下將硝酸銀溶液以30 滴/min的速度均勻地滴加到葡萄糖混合溶液中,攪拌20 min得到黑色懸濁液。將此懸濁液 10 000 r/min離心分離,所得固體沉淀用去離子水和無水醇各洗滌3遍,于 40 ℃下真空干燥3 h,得到聚乙烯吡咯烷酮作保護劑的納米銀粉(PVP/AgNP)。
1.5 抗菌實驗
取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌懸液先稀釋 10倍，確保菌落容易正常生長以及被正確計數，然后各取 0.1 mL置于 9.9 mL各自菌種的液體培養基中,在 10 mL含菌懸液中 (大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌液濃度1×107 cfu/mL),分別加入所制備的樣品,振蕩,使混合均勻,將制備好的稀釋液分別均勻涂在三塊培養基上，并在 37 ℃下放入恒溫培養箱中培養 24 h。每組試驗重復3次。
計算殺菌率的公式如下：
| $24h殺菌率\left( \% \right) = \left( {{N_0} - N} \right)/{N_0} \times 100\% $ |
式中：N0為培養24 h后原始對照組的菌落數; N為培養24 h后試驗組的菌落數。
1.6 細胞毒性實驗
調整人成纖維細胞密度為1×105個/mL,均勻接種到96孔板內,每孔 200 μL,用PVP/AgNP或AgNP/rGO-PEI分別在 37 ℃、5 % CO2條件下處理細胞 24 h。吸棄原培養液,倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。各孔用 DPBS 小心清洗 1 遍,加入DMEM 培養液 200 μL,再加入 5 g/L MTT 溶液 10 μL,繼續培養 4 h 后中止培養,小心吸去孔內培養液,每孔加入100 μL二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min。在酶標儀OD值 570 nm處測量各孔的吸光值。利用反向相差顯微鏡拍照獲得人成纖維細胞的形貌變化。利用SPSS17.0版本軟件進行統計分析。群組間的差異通過方差分析進行評估,檢驗水準為0.05。細胞相對增殖率(relative proliferation rate,RGR) 計算及細胞毒性評價標準參考ISO2109932-5，細胞相對增殖率(%) = 實驗組平均OD值/對照組OD均值×100%。細胞毒性試驗采用5分制法進行細胞毒性分級[8](見表 1)。
表1
材料毒性等級評價表
Table1.
Rank of material toxicity
2 結果與討論
將制作好的AgNP/rGo-PEI稀釋至約 10 mg/mL，滴在裝載在銅網上的碳膜上，置于室溫下干燥后用透射電子顯微鏡表征(見圖 1)。納米銀粒子形態呈球形,直徑為6~13 nm,分散性較好；顏色相對較明亮的區域為銅網上的碳膜基底，而相對較深的部分為rGO-PEI。通過電感耦合等離子光譜發生儀分析出AgNP在AgNP/rGO-PEI中的含量為 4.5 wt%。
圖1
AgNP/rGO-PEI的電鏡照片
Figure1.
AgNP/rGO-PEI by transmission electron microscope
2.1 穩定性分析
取裝有AgNP/rGO-PEI溶液和PVP/AgNP溶液的離心管各兩支，分別保存于避光狀態和光照強度為 3 000 lx的低溫光照儀環境各一支。之前先要對兩種溶液進行一次UV-VIS檢測：分別吸取兩種溶液 20μL，稀釋至 2 mL，置于 1 cm 厚比色皿中，用紫外-可見分光光度計測量從 200 ~ 800 nm 的吸收光譜檢測。10 d之后再分別對兩種狀態下保存的兩種溶液進行紫外-可見分光光度計檢測，結果見圖 2。
圖2
AgNP/rGO-PEI 和 PVP/AgNP 穩定性對比圖
Figure2.
Comparison of stability between AgNP/rGO-PEI and PVP/AgNP
對于抗菌材料來說，穩定性是非常重要的，UV-VIS圖譜中PVP/AgNP曲線的吸收峰從剛開始的 410 nm處移動到10 d以后的 420 nm，在光照條件下的吸收峰更是移動到了425 nm，吸收強度也大幅降低，說明AgNP的團聚現象已經比較明顯；在同樣條件下AgNP/rGO-PEI溶液的吸收峰的位置和強度變化都不大，沒有發現明顯的團聚現象。結果顯示：AgNP/rGO-PEI比PVP/AgNP更加穩定，在實際應用中更容易進行長期保存。
2.2 抗菌活性分析
AgNP/rGO-PEI抗菌性能測試結果如表 2所示。
表2
AgNP/rGO-PEI抗菌活性測試結果
Table2.
Test results of antibacterial activity of AgNP/rGO-PEI
從表 2可以看出，AgNP/rGO-PEI比PVP/AgNP具有更好的抗菌效果。究其原因普遍認為是石墨烯材料具有較大的比表面積這一特性。AgNP/rGO-PEI綜合了石墨烯大比表面積和銀離子抗菌活性的優點，從而使銀離子能夠更有效地與細菌相互作用。
2.3 細胞毒性分析
當PVP/AgNP溶液的濃度分別為 25、50和100 μg/mL時，細胞相對增殖率分別為49%、34%和28%，細胞毒性分級均為3級；AgNP/rGO-PEI在這三種濃度時，細胞相對增殖率分別為68%、53%和45%，濃度為 100 μg/mL時細胞毒性分級為3級，另外兩種濃度下細胞毒性均為2級。
如圖 3所示，人成纖維細胞呈扁平梭形，形態正常,生長良好(見圖 3左)；用AgNP/rGO-PEI處理 24 h之后的人成纖維細胞，形態已經開始發生改變，如細胞皺縮、突觸收起、細胞間距增大(見圖 3中)；用PVP/AgNP處理 24 h之后的成纖維細胞，細胞形態變得更加不規則，并且大多數細胞有損傷，變化更加明顯(見圖 3右)。
圖3
共同培養24 h后人成纖維細胞形態觀察
Figure3.
Human fibroblast morphology observation after co-cultured for 24 h
唐秋莎等[9]用聚乙烯亞胺修飾錳鋅鐵氧體磁性納米粒子，發現修飾后的納米粒子之間的團聚現象明顯減輕，等電點從 pH=7.0 提升到 pH=11.5。本文采用聚乙烯亞胺修飾石墨烯，然后將納米銀負載于其上，得到了石墨烯基納米銀復合抗菌材料，并且經過研究發現其具有良好的穩定性、抗菌活性，以及較低的生物毒性，生物安全性相對較高。
3 結論
本試驗結果表明,AgNP/rGO-PEI綜合了石墨烯的極大比表面積、高強度、高光學吸收的優點和納米銀優秀的殺菌性能，并且不是二者簡單的相加，相對于納米銀，AgNP/rGO-PEI具有更加良好的抗菌活性和生物相容性以及相對較低的生物毒性，這為我國發展新型高效抗菌復合材料提供了一個新的思路和方法，具有廣闊的應用前景。
