根據甲型H1N1流感病毒美國加利福尼亞毒株基因序列(A/California/07/2009(H1N1)),全基因合成甲型流感病毒血凝素(HA)編碼基因,利用輔助病毒依賴型腺病毒載體(HDAd)骨架質粒pSC15B,構建可表達HA基因的HDAd/HA DNA分子載體,以磷酸鈣法轉染293Cre4細胞,與輔助病毒H14連續共感染,獲得HDAd/HA載體,并大量制備和純化,進行形態觀察和體外感染的初步鑒定。透射電鏡下觀察HDAd/HA載體具有典型腺病毒形態;與輔助病毒H14共感染293細胞,RT-PCR檢測HA基因有轉錄,顯示成功構建HDAd/HA重組腺病毒載體,為甲型流感病毒體內免疫效果和免疫保護作用的研究奠定實驗基礎。
引用本文： 張梅, 江彥澤, 陳念華, 付遠輝, 喬偉, 王荷, 何金生. 可表達新型甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白輔助病毒依賴型腺病毒載體的構建. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(1): 157-160. doi: 10.7507/1001-5515.20140031 復制
引言
甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)蛋白是流感病毒包膜上重要的糖蛋白，可使病毒獲得感染性，并能刺激機體產生特異性中和抗體，在抗病毒感染中發揮重要作用。HA是流感病毒基因組第四節段的產物，很容易變異。2009年在墨西哥首先出現的甲型H1Nl流感，很快出現世界范圍內的人與人之間的廣泛傳播。進化分析顯示此次病原體為發生基因重排的，同時含禽、豬、人流感病毒核酸序列的新型甲型H1N1流感病毒[1-3]。
輔助病毒依賴型腺病毒載體(helper-dependent adenoviral vector，HDAd)為第三代腺病毒載體，具有安全、高效、轉移容量大和持續表達等特點，常用于基因治療研究[4]。國外已有報道HDAd用于疫苗研究時，能誘導機體產生更強的針對轉基因的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)及抗體應答能力[5]。本課題組通過滴鼻途徑免疫小鼠也獲得了類似的結果，證實HDAd黏膜疫苗能誘導機體產生更好的轉基因免疫效果，不良反應有所減輕[6]。
本研究以HDAd為基礎，構建可表達新型甲型H1N1流感病毒HA 抗原的輔助病毒依賴型重組腺病毒載體HDAd/HA，為甲型H1N1流感病毒基因工程疫苗的研發奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 質粒、菌株與細胞
HDAd Cre/loxP系統及輔助病毒H14、293Cre4細胞均購自加拿大Microbix公司，pSC15BMBESacⅡ由石長信博士構建[7]，質粒pSC11-CMV、293細胞、E.coli DH5α、E.coli DH10B菌株由本實驗室保存。
1.2 工具酶及主要試劑
限制性內切酶PmeⅠ、I-SceⅠ和I-CeuⅠ購自New England Biolabs公司；其他限制性內切酶、GeneRulermarkerTM 1 kb marker 購自Fermentas公司，Ex Taq DNA聚合酶、DL15000 marker、DL2000 marker購自大連Takara公司；引物由上海生工生物有限公司合成。
1.3 甲型H1N1流感病毒HA全基因合成
根據甲型H1N1流感病毒美國加利福尼亞毒株(A/California/07/2009(H1N1))(GenBank FJ969540.1)基因序列，采用全基因合成的方法合成HA基因，委托上海生工生物有限公司完成，克隆載體為pUC57，以EcoRⅠ和SmaⅠ插入合成基因。
1.4 HDAd重組質粒pSC15B/HA的構建
1.4.1 pSC11/HA重組質粒的構建
以EcoRⅠ和SmaⅠ分別雙酶切重組質粒pUC57/HA和穿梭質粒pSC11-CMV，分別回收HA目的基因和線性化的pSC11-CMV載體片段，連接，轉化E.coli DH5α感受態細菌。挑取單菌落接種液體培養基，小量提取質粒，EcoRⅠ和SmaⅠ雙酶切鑒定。重組質粒命名為pSC11/HA。
1.4.2 HDAd重組質粒pSC15B/HA的構建
用I-SceⅠ和I-CeuⅠ分別雙酶切pSC11/HA和pSC15BMBESacⅡ，回收HA基因片段及載體pSC15BMBESacⅡ，連接，轉化感受態細菌E.coli DH10B，挑取單菌落接種液體培養基，小量提取質粒，分別用BamHⅠ、EcoRⅠ、EcoR Ⅴ、XhoⅠ和NheⅠ進行酶切鑒定，獲得的重組體命名為pSC15B/HA。
1.5 HDAd/HA重組腺病毒載體的獲得、大量制備及純化
Pme Ⅰ酶切消化pSC15B/HA重組質粒，去除其原核復制元件及抗性基因，獲得HDAd/HA DNA分子。常規培養293Cre4細胞，以磷酸鈣共沉淀法進行轉染。次日加入輔助病毒H14，培養2~3 d后，收集病變的細胞及上清，水平離心，留取少量上清及沉淀，重懸，于-70 ℃充分冷凍后取出，以37 ℃水浴快速融化，如此反復凍融3次，使細胞膜裂解，病毒顆粒充分釋放，獲得的HDAd/HA載體粗提液，以1 mL/管分裝入無菌的1.5 mL EP管中，-70 ℃保存備用。取上述1管接種293Cre4細胞，加入輔助病毒，上述同樣操作方法處理，直至獲得第6~7代HDAd/HA載體粗提液，進行大量培養收獲。以CsCl密度梯度及等密度梯度法超速離心純化收獲的HDAd/HA載體兩次，全部轉移到Slide-A-Lyzer透析盒中，4 ℃，24 h，所用透析液體為10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)。透析完成后小心取出載體至無菌Ep管中，加入甘油，-70 ℃保存。詳細操作步驟及條件請見參考文獻[8-9]。
測定純化重組腺病毒載體HDAd/HA的OD260的值，計算其病毒顆粒(virus particle,vp)濃度。
1.6 HDAd/HA電鏡觀察
用電鏡銅網放入純化后的HDAd/HA中約1 min，將銅網取出后在1%的磷鎢酸中染色約1 min，電鏡觀察。加速電壓80 kV，通過CCD數碼相機進行觀察、拍照記錄。
1.7 RT-PCR鑒定
培養293細胞，待豐度達到70%~90%，取HDAd/HA載體與輔助病毒共感染293細胞，培養2~3 d，Trizol法提取細胞總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書操作獲得cDNA模板，并進行HA的PCR擴增。引物設計根據HA基因合成序列，上游引物(nt5-nt28)5′-tgaaggcaatactagtagttctgc-3′，下游引物(nt796-nt819)5′-gaatgcatatctcggtaccactag-3′，預擴增條帶約為820 bp。反應條件為94 ℃，3 min；93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃，1 min，30個循環；72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。同時用總RNA為模板行PCR作為陰性對照。
2 結果
2.1 HA基因合成與重組質粒的鑒定
甲型H1N1流感病毒HA蛋白編碼基因長度為1 701個核苷酸，經比對，上海生工生物有限公司所合成序列與預期HA基因序列完全吻合(序列報告圖略)。HA基因的上下游分別引入了EcoRⅠ和SmaⅠ酶切位點，并以此分別克隆入pUC57載體及pSC11-CMV穿梭載體，因此以EcoRⅠ和SmaⅠ雙酶切pUC57/HA和pSC11/HA重組質粒，均應得到約1 700 bp條帶。瓊脂糖凝膠電泳結果與預期相符(見圖 1)。pSC15B/HA重組質粒分別用XhoⅠ、NheⅠ、EcoRⅠ、EcoR Ⅴ、BamHⅠ單酶切產物行瓊脂糖凝膠電泳，結果均與預期一致(圖略)。
圖1
pSC11/HA和pUC57/HA酶切鑒定
1: DL15000 marker； 2:
1: DL15000 marker; 2: pSC11/HA digested by
2.2 純化的HDAd/HA載體濃度計算[8 ]
病毒顆粒濃度計算公式為：病毒顆粒濃度(vp/mL)=OD260值×稀釋倍數×1.1×1012×36÷HDAd/HA堿基數(kb)。用含0.1% SDS的TE溶液將純化后的HDAd/HA載體稀釋10倍，測得OD260值為0.147，HDAd/HA堿基數約為34.09 kb，計算HDAd/HA的病毒顆粒濃度為：0.147×10×1.1×1012×36÷34.09≈1.7×1012 vp/mL。
2.3 HDAd/HA的電鏡觀察結果
透射電鏡下觀察HDAd/HA載體，其顆粒略呈二十面體結構，直徑約70 nm，屬較為典型的腺病毒形態，未見有其它病毒、支原體、細菌和真菌污染(見圖 2)。
圖2
純化的HDAd/HA的電鏡下形態(JEM-1400)
Figure2.
Purified HDAd/HA under transmission electron microscope (JEM-1400)
2.4 RT-PCR檢測HA基因的轉錄
RT-PCR檢測顯示，HDAd/HA載體與輔助病毒共感染的293細胞陽性實驗組可見到約800 bp的DNA條帶，未感染的293細胞陰性對照組未見，說明前者中HA基因有轉錄(見圖 3)。
圖3
RT-PCR鑒定HA蛋白基因的轉錄
1： PCR擴增細胞總RNA(陰性對照)；2： RT-PCR 結果；3： DL2000 marker
Figure3. HA gene transcription confirmed by RT-PCR1: PCR result of total RNA (negative control)； 2: product of RT-PCR； 3: DL2000 marker
3 討論
利用傳統的雞胚方法制備的甲型H1N1流感病毒裂解疫苗在我國已進入臨床應用，但因病毒在雞胚中復制效果差導致的疫苗產量不足及病毒變異等問題，難以及時、大規模生產來滿足大量易感人群使用的疫苗。同時，隨著人類感染甲型H1N1流感病毒持續增加，病毒發生抗原漂移(drift)和抗原轉變(shift)的可能性也會隨之增加，由抗原變異產生的新毒株，一方面會導致更高的發病率和死亡率，另一方面也會降低現有疫苗的保護效率。因此，針對變異的毒株，能在短期內迅速更新換代并完成大量制備的流感疫苗顯然具有更大的優勢[10]。
大量動物實驗表明，包括質粒和病毒載體等在內的重組DNA疫苗不僅能有效誘導機體產生體液和細胞免疫，而且能預防多種人類疾病。其中第一代非復制型腺病毒載體(first generation replication deficient recombinant adenoviral vector,FGAd)表達高致病性禽流感病毒HA的重組腺病毒顯示出高效的免疫保護作用[11]。經黏膜途徑應用的FGAd疫苗，具有從頭合成(de novo synthesis)能力，經黏膜應用時，可誘導機體產生的系統及黏膜體液免疫和細胞免疫應答，不僅能同時預防感染和保護下呼吸道，而且細胞免疫還是有效避免疾病增強作用的重要因素，國內外已有報道利用FGAd構建可表達甲型H1N1流感病毒HA蛋白或NA蛋白，開展免疫原性及免疫保護作用的研究[10, 12]。
HDAd是在第一、第二代腺病毒載體的基礎上研制的一種全缺失腺病毒載體，又稱空殼載體。由于缺乏所有腺病毒編碼基因，僅含有腺病毒復制信號(inverted terminal repeats，ITRs)和包裝信號(Ψ)，其復制和包裝需要輔助病毒為其提供所需的全部蛋白。HDAd不僅繼承了傳統腺病毒載體穩定、滴度高、低致病性等優點，并且由于其不表達自身蛋白，極大地降低了細胞毒性和免疫原性，因此比FGAd更安全，表達目的基因持續時間長；HDAd外源基因容納量達36 kb，可同時表達多個基因，具有包裝容量大、更高效等特點。HDAd作為疫苗載體的研究起步較晚。本課題組對HDAd和FGAd載體進行實驗研究發現，以HDAd/EGFP 感染早期的A549細胞，較FGAd/EGFP 有更高的熒光表達率及更高的表達強度，顯示HDAd 載體具有轉基因瞬時高表達的特性，是一種更有價值的疫苗載體[8]。
為提高HA的轉錄和翻譯水平，在進行基因合成時，我們對HA基因進行了適當改造，在其5′端增加了GCCACC，并使用了雙起始密碼子，即在原有的atg之后，增加了纈氨酸密碼子gtg，形成了完整的Kozak序列GCCACCATGG。在HA的3′端使用了雙終止密碼子。
本研究應用HDAd載體系統，將人工合成的新型甲型H1N1流感病毒的HA基因插入到輔助病毒依賴型腺病毒的骨架質粒上，成功完成了HDAd/HA相關質粒的構建、制備及純化的過程，并以HDAd/HA DNA分子轉染293cre4細胞，與輔助病毒共同包裝出含有HA基因的HDAd/HA重組腺病毒載體，電鏡觀察具有典型的腺病毒形態。通過體外感染293細胞，RT-PCR檢測顯示其在正常的哺乳動物細胞中能實現HA基因的正常轉錄，為以HDAd載體系統表達HA蛋白，通過滴鼻途徑開展體內免疫學效果和免疫保護研究奠定了初步基礎。
引言
甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)蛋白是流感病毒包膜上重要的糖蛋白，可使病毒獲得感染性，并能刺激機體產生特異性中和抗體，在抗病毒感染中發揮重要作用。HA是流感病毒基因組第四節段的產物，很容易變異。2009年在墨西哥首先出現的甲型H1Nl流感，很快出現世界范圍內的人與人之間的廣泛傳播。進化分析顯示此次病原體為發生基因重排的，同時含禽、豬、人流感病毒核酸序列的新型甲型H1N1流感病毒[1-3]。
輔助病毒依賴型腺病毒載體(helper-dependent adenoviral vector，HDAd)為第三代腺病毒載體，具有安全、高效、轉移容量大和持續表達等特點，常用于基因治療研究[4]。國外已有報道HDAd用于疫苗研究時，能誘導機體產生更強的針對轉基因的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)及抗體應答能力[5]。本課題組通過滴鼻途徑免疫小鼠也獲得了類似的結果，證實HDAd黏膜疫苗能誘導機體產生更好的轉基因免疫效果，不良反應有所減輕[6]。
本研究以HDAd為基礎，構建可表達新型甲型H1N1流感病毒HA 抗原的輔助病毒依賴型重組腺病毒載體HDAd/HA，為甲型H1N1流感病毒基因工程疫苗的研發奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 質粒、菌株與細胞
HDAd Cre/loxP系統及輔助病毒H14、293Cre4細胞均購自加拿大Microbix公司，pSC15BMBESacⅡ由石長信博士構建[7]，質粒pSC11-CMV、293細胞、E.coli DH5α、E.coli DH10B菌株由本實驗室保存。
1.2 工具酶及主要試劑
限制性內切酶PmeⅠ、I-SceⅠ和I-CeuⅠ購自New England Biolabs公司；其他限制性內切酶、GeneRulermarkerTM 1 kb marker 購自Fermentas公司，Ex Taq DNA聚合酶、DL15000 marker、DL2000 marker購自大連Takara公司；引物由上海生工生物有限公司合成。
1.3 甲型H1N1流感病毒HA全基因合成
根據甲型H1N1流感病毒美國加利福尼亞毒株(A/California/07/2009(H1N1))(GenBank FJ969540.1)基因序列，采用全基因合成的方法合成HA基因，委托上海生工生物有限公司完成，克隆載體為pUC57，以EcoRⅠ和SmaⅠ插入合成基因。
1.4 HDAd重組質粒pSC15B/HA的構建
1.4.1 pSC11/HA重組質粒的構建
以EcoRⅠ和SmaⅠ分別雙酶切重組質粒pUC57/HA和穿梭質粒pSC11-CMV，分別回收HA目的基因和線性化的pSC11-CMV載體片段，連接，轉化E.coli DH5α感受態細菌。挑取單菌落接種液體培養基，小量提取質粒，EcoRⅠ和SmaⅠ雙酶切鑒定。重組質粒命名為pSC11/HA。
1.4.2 HDAd重組質粒pSC15B/HA的構建
用I-SceⅠ和I-CeuⅠ分別雙酶切pSC11/HA和pSC15BMBESacⅡ，回收HA基因片段及載體pSC15BMBESacⅡ，連接，轉化感受態細菌E.coli DH10B，挑取單菌落接種液體培養基，小量提取質粒，分別用BamHⅠ、EcoRⅠ、EcoR Ⅴ、XhoⅠ和NheⅠ進行酶切鑒定，獲得的重組體命名為pSC15B/HA。
1.5 HDAd/HA重組腺病毒載體的獲得、大量制備及純化
Pme Ⅰ酶切消化pSC15B/HA重組質粒，去除其原核復制元件及抗性基因，獲得HDAd/HA DNA分子。常規培養293Cre4細胞，以磷酸鈣共沉淀法進行轉染。次日加入輔助病毒H14，培養2~3 d后，收集病變的細胞及上清，水平離心，留取少量上清及沉淀，重懸，于-70 ℃充分冷凍后取出，以37 ℃水浴快速融化，如此反復凍融3次，使細胞膜裂解，病毒顆粒充分釋放，獲得的HDAd/HA載體粗提液，以1 mL/管分裝入無菌的1.5 mL EP管中，-70 ℃保存備用。取上述1管接種293Cre4細胞，加入輔助病毒，上述同樣操作方法處理，直至獲得第6~7代HDAd/HA載體粗提液，進行大量培養收獲。以CsCl密度梯度及等密度梯度法超速離心純化收獲的HDAd/HA載體兩次，全部轉移到Slide-A-Lyzer透析盒中，4 ℃，24 h，所用透析液體為10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)。透析完成后小心取出載體至無菌Ep管中，加入甘油，-70 ℃保存。詳細操作步驟及條件請見參考文獻[8-9]。
測定純化重組腺病毒載體HDAd/HA的OD260的值，計算其病毒顆粒(virus particle,vp)濃度。
1.6 HDAd/HA電鏡觀察
用電鏡銅網放入純化后的HDAd/HA中約1 min，將銅網取出后在1%的磷鎢酸中染色約1 min，電鏡觀察。加速電壓80 kV，通過CCD數碼相機進行觀察、拍照記錄。
1.7 RT-PCR鑒定
培養293細胞，待豐度達到70%~90%，取HDAd/HA載體與輔助病毒共感染293細胞，培養2~3 d，Trizol法提取細胞總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書操作獲得cDNA模板，并進行HA的PCR擴增。引物設計根據HA基因合成序列，上游引物(nt5-nt28)5′-tgaaggcaatactagtagttctgc-3′，下游引物(nt796-nt819)5′-gaatgcatatctcggtaccactag-3′，預擴增條帶約為820 bp。反應條件為94 ℃，3 min；93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃，1 min，30個循環；72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。同時用總RNA為模板行PCR作為陰性對照。
2 結果
2.1 HA基因合成與重組質粒的鑒定
甲型H1N1流感病毒HA蛋白編碼基因長度為1 701個核苷酸，經比對，上海生工生物有限公司所合成序列與預期HA基因序列完全吻合(序列報告圖略)。HA基因的上下游分別引入了EcoRⅠ和SmaⅠ酶切位點，并以此分別克隆入pUC57載體及pSC11-CMV穿梭載體，因此以EcoRⅠ和SmaⅠ雙酶切pUC57/HA和pSC11/HA重組質粒，均應得到約1 700 bp條帶。瓊脂糖凝膠電泳結果與預期相符(見圖 1)。pSC15B/HA重組質粒分別用XhoⅠ、NheⅠ、EcoRⅠ、EcoR Ⅴ、BamHⅠ單酶切產物行瓊脂糖凝膠電泳，結果均與預期一致(圖略)。
圖1
pSC11/HA和pUC57/HA酶切鑒定
1: DL15000 marker； 2:
1: DL15000 marker; 2: pSC11/HA digested by
2.2 純化的HDAd/HA載體濃度計算[8 ]
病毒顆粒濃度計算公式為：病毒顆粒濃度(vp/mL)=OD260值×稀釋倍數×1.1×1012×36÷HDAd/HA堿基數(kb)。用含0.1% SDS的TE溶液將純化后的HDAd/HA載體稀釋10倍，測得OD260值為0.147，HDAd/HA堿基數約為34.09 kb，計算HDAd/HA的病毒顆粒濃度為：0.147×10×1.1×1012×36÷34.09≈1.7×1012 vp/mL。
2.3 HDAd/HA的電鏡觀察結果
透射電鏡下觀察HDAd/HA載體，其顆粒略呈二十面體結構，直徑約70 nm，屬較為典型的腺病毒形態，未見有其它病毒、支原體、細菌和真菌污染(見圖 2)。
圖2
純化的HDAd/HA的電鏡下形態(JEM-1400)
Figure2.
Purified HDAd/HA under transmission electron microscope (JEM-1400)
2.4 RT-PCR檢測HA基因的轉錄
RT-PCR檢測顯示，HDAd/HA載體與輔助病毒共感染的293細胞陽性實驗組可見到約800 bp的DNA條帶，未感染的293細胞陰性對照組未見，說明前者中HA基因有轉錄(見圖 3)。
圖3
RT-PCR鑒定HA蛋白基因的轉錄
1： PCR擴增細胞總RNA(陰性對照)；2： RT-PCR 結果；3： DL2000 marker
Figure3. HA gene transcription confirmed by RT-PCR1: PCR result of total RNA (negative control)； 2: product of RT-PCR； 3: DL2000 marker
3 討論
利用傳統的雞胚方法制備的甲型H1N1流感病毒裂解疫苗在我國已進入臨床應用，但因病毒在雞胚中復制效果差導致的疫苗產量不足及病毒變異等問題，難以及時、大規模生產來滿足大量易感人群使用的疫苗。同時，隨著人類感染甲型H1N1流感病毒持續增加，病毒發生抗原漂移(drift)和抗原轉變(shift)的可能性也會隨之增加，由抗原變異產生的新毒株，一方面會導致更高的發病率和死亡率，另一方面也會降低現有疫苗的保護效率。因此，針對變異的毒株，能在短期內迅速更新換代并完成大量制備的流感疫苗顯然具有更大的優勢[10]。
大量動物實驗表明，包括質粒和病毒載體等在內的重組DNA疫苗不僅能有效誘導機體產生體液和細胞免疫，而且能預防多種人類疾病。其中第一代非復制型腺病毒載體(first generation replication deficient recombinant adenoviral vector,FGAd)表達高致病性禽流感病毒HA的重組腺病毒顯示出高效的免疫保護作用[11]。經黏膜途徑應用的FGAd疫苗，具有從頭合成(de novo synthesis)能力，經黏膜應用時，可誘導機體產生的系統及黏膜體液免疫和細胞免疫應答，不僅能同時預防感染和保護下呼吸道，而且細胞免疫還是有效避免疾病增強作用的重要因素，國內外已有報道利用FGAd構建可表達甲型H1N1流感病毒HA蛋白或NA蛋白，開展免疫原性及免疫保護作用的研究[10, 12]。
HDAd是在第一、第二代腺病毒載體的基礎上研制的一種全缺失腺病毒載體，又稱空殼載體。由于缺乏所有腺病毒編碼基因，僅含有腺病毒復制信號(inverted terminal repeats，ITRs)和包裝信號(Ψ)，其復制和包裝需要輔助病毒為其提供所需的全部蛋白。HDAd不僅繼承了傳統腺病毒載體穩定、滴度高、低致病性等優點，并且由于其不表達自身蛋白，極大地降低了細胞毒性和免疫原性，因此比FGAd更安全，表達目的基因持續時間長；HDAd外源基因容納量達36 kb，可同時表達多個基因，具有包裝容量大、更高效等特點。HDAd作為疫苗載體的研究起步較晚。本課題組對HDAd和FGAd載體進行實驗研究發現，以HDAd/EGFP 感染早期的A549細胞，較FGAd/EGFP 有更高的熒光表達率及更高的表達強度，顯示HDAd 載體具有轉基因瞬時高表達的特性，是一種更有價值的疫苗載體[8]。
為提高HA的轉錄和翻譯水平，在進行基因合成時，我們對HA基因進行了適當改造，在其5′端增加了GCCACC，并使用了雙起始密碼子，即在原有的atg之后，增加了纈氨酸密碼子gtg，形成了完整的Kozak序列GCCACCATGG。在HA的3′端使用了雙終止密碼子。
本研究應用HDAd載體系統，將人工合成的新型甲型H1N1流感病毒的HA基因插入到輔助病毒依賴型腺病毒的骨架質粒上，成功完成了HDAd/HA相關質粒的構建、制備及純化的過程，并以HDAd/HA DNA分子轉染293cre4細胞，與輔助病毒共同包裝出含有HA基因的HDAd/HA重組腺病毒載體，電鏡觀察具有典型的腺病毒形態。通過體外感染293細胞，RT-PCR檢測顯示其在正常的哺乳動物細胞中能實現HA基因的正常轉錄，為以HDAd載體系統表達HA蛋白，通過滴鼻途徑開展體內免疫學效果和免疫保護研究奠定了初步基礎。
