本研究探討新疆維吾爾族、漢族轉化生長因子β3(TGFβ3)基因SfaNI多態性與非綜合征性唇腭裂(NSCL/P)的關系。經PCR擴增出TGFβ3 基因SfaNI片段作為模板,加入SNP序列特異延伸引物進行單堿基延伸反應,產物純化后利用飛行時間質譜技術對SfaNI多態性進行檢測。結果顯示:NSCL/P組與對照組基因型及等位基因頻率分布差異均無統計學意義(P＞0.05);維、漢兩民族內,NSCL/P組和對照組基因型頻率分布差異均無統計學意義(P＞0.05),等位基因A、G的頻率分布在維吾爾族內兩組間無差異(P＞0.05),在漢族內兩組間差異有統計學意義(P＜0.05);無論是NSCL/P患者還是健康人群,在維、漢兩民族間基因型和等位基因頻率的分布差異均無統計學意義(P＞0.05)。本研究表明新疆維吾爾族NSCL/P與TGFβ3基因的SfaNI多態性無關,而漢族NSCL/P的發生可能與TGFβ3基因的SfaNI等位基因A、G的頻率有關。
引用本文： 閆佳, 謝金敏, 洪玉. 新疆維吾爾族和漢族人非綜合征型唇腭裂與轉化生長因子β3基因SfaNI多態性的分析. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(1): 152-156. doi: 10.7507/1001-5515.20140030 復制
引言
非綜合征型唇腭裂(non-syndromic cleft lip with or without cleft palate,NSCL/P)，是指不伴發其它系統器官畸形的，不屬于任何綜合征范圍之內的單純性唇裂、腭裂、唇裂合并腭裂的總稱[1]，是新生兒畸形中最常見的一種,發生率為0.80‰~1.00‰。研究發現[2]NSCL/P的發生是環境和遺傳因素相互作用的結果，但是遺傳因素在唇腭裂的病因中發揮著更重要的作用。目前,已證實6p24、2p13、19q13、1q41、17q21、14q24均與NSCL/P的發生有關聯。轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)β3基因定位于14q24，該基因不僅在小鼠胚胎頭面部發育時期有表達,而且在敲除該基因后小鼠還會出現唇腭裂畸形,是NSCL/P的熱門候選基因之一[3-4]。由于唇腭裂病因的復雜性和遺傳模式的不確定性，不同地區、不同表型 NSCL/P 的候選基因都存在一定的差異，而且有大量的研究數據表明，唇腭裂的發生存在人種和地域的差異。本課題就新疆維吾爾族、漢族的NSCL/P患者TGFβ3基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位點基因型及等位基因頻率的分布情況進行分析，了解民族間是否存在差異，為新疆不同民族NSCL/P的防治提供理論基礎。
1 資料與方法
1.1 研究對象
2011年1月至2012年7月，采用隨機抽樣的方法，隨機抽取就診于新疆醫科大學第一附屬醫院口腔頜面外科和自治區人民醫院口腔科的維吾爾族(50例)、漢族(49例)手術患者，并以正常體檢的維吾爾族、漢族各50例作為對照。
1.1.1 NSCL/P組
共計99例，其中維吾爾族患者50例，漢族患者49例。病例納入標準：① 研究對象為維吾爾族、漢族人群；② 患者為先天性NSCL/P；③ 非綜合征患者伴發的唇腭裂表型患者。病例排除標準：① 合并其它先天性疾病或先天畸形的唇腭裂，如神經管畸形或先天性心臟病伴發的唇腭裂、歌舞伎面譜綜合征、范伍德綜合征、Meckel綜合征、腭心面綜合征等；② 合并高血壓、冠心病等重要臟器疾病的NSCL/P患者。
1.1.2 對照組
共計100例，其中維吾爾族50例，漢族50例。對照組為正常體檢者且家族中無唇腭裂患者，各族人群年齡、性別分布與病例組差異無統計學意義。所有接受基因測試者均獲得受試者同意，簽署知情同意書，并經新疆醫科大學倫理委員會審查批準。
1.2 實驗方法
1.2.1 基因組DNA的制備
取靜脈血5 mL，EDTA抗凝，常規酚氯仿法抽提。
1.2.2 PCR擴增
PCR引物和延伸引物按Hang等報道[5],由上海生工生物工程公司合成。TGFβ3基因rs3917201位點如表 1所示。
表1
單核苷酸多態性分型所需引物
Table1.
Single nucleotide polymorphism genotyping primers required
PCR反應體系中包含:0.95 μL水、0.625 μL PCR緩沖液(含15 mmol/L MgCl2)、1 μL的2.5 mmol/L DNA、0.325 μL的25 mmol/L MgCl2、1 μL PCR 引物以及0.1 μL HotStarTaq酶。反應條件:94 ℃ 15 min，94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共45個循環，72 ℃延伸3 min，4 ℃終止。
1.2.3 SAP處理
反應體系包括1.53 μL水、0.17 μL SAP緩沖液、0.3 U堿性磷酸酶。反應條件：37 ℃進行40 min，然后85 ℃下5 min使酶失活，4 ℃終止。
1.2.4 延伸反應
反應體系包括: 0.755 μL水、0.2 μL 10×iPlex緩沖液、0.2 μL終止混合物、0.804 μL 10 μmol/L的延伸引物、0.041 μL iPlex酶。反應條件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s 5個循環，共40個循環。72 ℃延伸3 min，4 ℃終止。
1.2.5 樹脂除鹽純化
在終止反應物中加入6 mg陽離子交換樹脂脫鹽，混合后加入25 μL水懸浮。
1.2.6 飛行時間質譜檢測
將樣品轉移到MassARRAY SpectroCHIP芯片，放入質譜儀進行檢測，每個檢測點只需3~5 s，全自動分析。TYPER軟件分析實驗結果，獲得分型數據。
1.2.7 統計學處理
本研究為病例-對照研究，所有數據均采用SPSS 17.0軟件包進行分析。病例組和對照組基因型運用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律確定吻合度檢驗，采用χ2 檢驗進行病例組和對照組基因型和等位基因型頻率以及維、漢兩民族內和民族間頻率分布差異的比較。
2 結果
2.1 TGFβ3 基因rs3917201位點分型結果
經飛行質譜技術獲得飛行質譜圖。TGFβ3基因rs3917201位點分型結果如圖 1所示，圖 1(a)為純合型AA,圖 1(b)為雜合型AG,圖 1(c)為野生型GG。
圖1
TGFβ3基因rs3917201位點基因型MALDI-TOF MS圖
(a)基因型AA;(b)基因型AG;(c)基因型GG
Figure1. TGFβ3 gene rs3917201 locus genotypes by MALDI-TOF MS(a) genotypes AA; (b) genotypes AG; (c) genotypes GG
2.2 TGFβ3基因rs3917201位點病例組與對照組基因型Hardy-Weinberg平衡檢測
經Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗，NSCL/P組和對照組基因型分布均符合Hardy-Weinberg的平衡法則，吻合度檢驗良好(P=0.080 88，P＞0.05)。
2.3 NSCL/P組與對照組TGFβ3基因rs3917201位點基因型及等位基因頻率分布的比較
從表 2可以看出: NSCL/P組和對照組基因型分布均以AG型頻率最高，AA型次之，GG型最低；等位基因均為A等位基因頻率較高。其中，NSCL/P組GG基因型頻率及G等位基因頻率高于對照組，但兩組間比較TGFβ3基因rs3917201位點基因型及等位基因頻率的分布差異沒有統計學意義(P＞0.05)。
表2
NSCL/P組與對照組TGFβ3基因rs3917201位點基因型及等位基因頻率分布的比較[例，(%)]
Table2.
Comparison of the distribution of TGFβ3 gene rs3917201 locus genotypes and allele frequencies of the NSCL/P group and control group [case,(%)]
2.4 新疆維、漢兩民族內NSCL/P組與對照組TGFβ3基因rs3917201位點基因型和等位基因頻率分布的比較
由表 3可以看出：維吾爾族中，NSCL/P 組AA、GG基因型及G等位基因頻率高于對照組，但兩組間基因型及等位基因頻率的分布差異無統計學意義(P＞0.05)；漢族中，NSCL/P 組GG基因型及等位基因G頻率高于對照組，但兩組間基因型頻率的分布差異無統計學意義(P＞0.05)，而等位基因A和G的頻率分布差異有統計學意義(P＜0.05)。
表3
新疆維、漢兩民族內NSCL/P組與對照組TGFβ3基因rs3917201位點基因型及等位基因頻率分布的比較[例，(%)]
Table3.
Comparison of the distribution of TGFβ3 gene rs3917201 locus genotypes and allele frequencies of the NSCL/P group and control group within Xinjiang Uygurs and Hans [case,(%)]
2.5 新疆維、漢兩民族間TGFβ3基因rs3917201位點基因型和等位基因頻率分布的比較
由表 4可以看出：NSCL/P患者中維族AA基因型及A等位基因頻率高于漢族，但兩民族間基因型和等位基因頻率的分布差異無統計學意義(P＞0.05)。健康人群中維族AG基因型及G等位基因頻率高于漢族，但兩民族間基因型和等位基因頻率的分布差異也無統計學意義(P＞0.05)。
表4
新疆維、漢兩民族間TGFβ3基因rs3917201位點基因型及等位基因頻率分布的比較[例，(%)]
Table4.
Comparison of the distribution of TGFβ3 gene rs3917201 locus genotypes and allele frequencies of Uygurs and Hans population in XinJiang [case,(%)]
3 討論
近年來研究表明，新生兒畸形率呈上升趨勢，而唇腭裂畸形發生率上升較為迅速，我國的發病率為0.182%[6]。TGFβ3是一種多功能的生物活性調節因子，廣泛調控細胞增殖與分化、機體的生長和發育、組織修復、各種癌變等生理和實驗過程，具有重要的生物學功能。同時，它對細胞生長起雙向調節作用，對大多數間充質細胞、胚胎成纖維細胞、上皮角化細胞、T和B淋巴細胞以及內皮細胞，是一種強有效的生長抑制劑。它在腭板正常融合所需要的腭板中縫上皮細胞中呈特異性表達，對腮板中縫上皮細胞的融合及腭板中線的消失也起到作用。
關于TGFβ3與人類的NSCL/P發生是否有關，國內外已有的研究結論不一。Ulucan等[7]對土耳其的68個病例和114個對照研究發現TGF β 3SfaNI多態性與NSCL/P發生相關，其GG基因型及G等位基因分布頻率在病例組和對照組有顯著差異。Suazo等[8]對智利89個具有NSCL/P 先證者的獨立家系中篩查到的150例NSCL/P 患者及其父母的TGFβ3基因進行等位基因遺傳不平衡檢驗，發現TGFβ3SfaNI基因多態性與NSCL/P也有關。Kim等[9]在韓國人群中也發現TGFβ3SfaNI多態性與韓國人群NSCL/P有關聯。而劉寧等[10]對48個核心家庭的48例NSCL/P患者的TGFβ3基因SfaNI多態性進行檢測，發現其與中國人群NSCL/P發生無相關性。
本研究納入新疆維吾爾族、漢族NSCL/P患者及健康人對照，通過飛行時間質譜檢測分析顯示：新疆NSCL/P患者和健康人群之間，TGFβ3基因Sfa NI基因型和等位基因頻率的分布差異無統計學意義(P＞0.05)，這與劉寧[10]對48個核心家庭人群NSCL/P的報道一致；在新疆維吾爾族中，NSCL/P組和對照組TGFβ3基因SfaNI位點基因型及等位基因分布差異均無統計學意義(P＞0.05)；在維吾爾族、漢族兩民族間無論是NSCL/P患者還是正常人群，TGFβ3基因SfaNI位點基因型和等位基因頻率的分布差異亦沒有統計學意義(P＞0.05)。因此，我們初步認為新疆維吾爾族人群NSCL/P 與TGFβ3基因的SfaNI多態性無關，而漢族人群NSCL/P的發生與SfaNI多態性中等位基因A、G的頻率有關，分析其原因可能是NSCL/P跟種族、地域、樣本含量以及研究方法的不同有關；NSCL/P是多基因遺傳病，是基因-基因或基因-環境共同作用的結果，還可能是多個基因協同作用的結果。因此，關于對新疆維、漢民族NSCL/P的發病機制是否具有差異，以及TGFβ3基因的其他位點與NSCL/P的發生是否有關聯性，還有待進一步的大樣本研究。
引言
非綜合征型唇腭裂(non-syndromic cleft lip with or without cleft palate,NSCL/P)，是指不伴發其它系統器官畸形的，不屬于任何綜合征范圍之內的單純性唇裂、腭裂、唇裂合并腭裂的總稱[1]，是新生兒畸形中最常見的一種,發生率為0.80‰~1.00‰。研究發現[2]NSCL/P的發生是環境和遺傳因素相互作用的結果，但是遺傳因素在唇腭裂的病因中發揮著更重要的作用。目前,已證實6p24、2p13、19q13、1q41、17q21、14q24均與NSCL/P的發生有關聯。轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)β3基因定位于14q24，該基因不僅在小鼠胚胎頭面部發育時期有表達,而且在敲除該基因后小鼠還會出現唇腭裂畸形,是NSCL/P的熱門候選基因之一[3-4]。由于唇腭裂病因的復雜性和遺傳模式的不確定性，不同地區、不同表型 NSCL/P 的候選基因都存在一定的差異，而且有大量的研究數據表明，唇腭裂的發生存在人種和地域的差異。本課題就新疆維吾爾族、漢族的NSCL/P患者TGFβ3基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位點基因型及等位基因頻率的分布情況進行分析，了解民族間是否存在差異，為新疆不同民族NSCL/P的防治提供理論基礎。
1 資料與方法
1.1 研究對象
2011年1月至2012年7月，采用隨機抽樣的方法，隨機抽取就診于新疆醫科大學第一附屬醫院口腔頜面外科和自治區人民醫院口腔科的維吾爾族(50例)、漢族(49例)手術患者，并以正常體檢的維吾爾族、漢族各50例作為對照。
1.1.1 NSCL/P組
共計99例，其中維吾爾族患者50例，漢族患者49例。病例納入標準：① 研究對象為維吾爾族、漢族人群；② 患者為先天性NSCL/P；③ 非綜合征患者伴發的唇腭裂表型患者。病例排除標準：① 合并其它先天性疾病或先天畸形的唇腭裂，如神經管畸形或先天性心臟病伴發的唇腭裂、歌舞伎面譜綜合征、范伍德綜合征、Meckel綜合征、腭心面綜合征等；② 合并高血壓、冠心病等重要臟器疾病的NSCL/P患者。
1.1.2 對照組
共計100例，其中維吾爾族50例，漢族50例。對照組為正常體檢者且家族中無唇腭裂患者，各族人群年齡、性別分布與病例組差異無統計學意義。所有接受基因測試者均獲得受試者同意，簽署知情同意書，并經新疆醫科大學倫理委員會審查批準。
1.2 實驗方法
1.2.1 基因組DNA的制備
取靜脈血5 mL，EDTA抗凝，常規酚氯仿法抽提。
1.2.2 PCR擴增
PCR引物和延伸引物按Hang等報道[5],由上海生工生物工程公司合成。TGFβ3基因rs3917201位點如表 1所示。
表1
單核苷酸多態性分型所需引物
Table1.
Single nucleotide polymorphism genotyping primers required
PCR反應體系中包含:0.95 μL水、0.625 μL PCR緩沖液(含15 mmol/L MgCl2)、1 μL的2.5 mmol/L DNA、0.325 μL的25 mmol/L MgCl2、1 μL PCR 引物以及0.1 μL HotStarTaq酶。反應條件:94 ℃ 15 min，94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共45個循環，72 ℃延伸3 min，4 ℃終止。
1.2.3 SAP處理
反應體系包括1.53 μL水、0.17 μL SAP緩沖液、0.3 U堿性磷酸酶。反應條件：37 ℃進行40 min，然后85 ℃下5 min使酶失活，4 ℃終止。
1.2.4 延伸反應
反應體系包括: 0.755 μL水、0.2 μL 10×iPlex緩沖液、0.2 μL終止混合物、0.804 μL 10 μmol/L的延伸引物、0.041 μL iPlex酶。反應條件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s 5個循環，共40個循環。72 ℃延伸3 min，4 ℃終止。
1.2.5 樹脂除鹽純化
在終止反應物中加入6 mg陽離子交換樹脂脫鹽，混合后加入25 μL水懸浮。
1.2.6 飛行時間質譜檢測
將樣品轉移到MassARRAY SpectroCHIP芯片，放入質譜儀進行檢測，每個檢測點只需3~5 s，全自動分析。TYPER軟件分析實驗結果，獲得分型數據。
1.2.7 統計學處理
本研究為病例-對照研究，所有數據均采用SPSS 17.0軟件包進行分析。病例組和對照組基因型運用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律確定吻合度檢驗，采用χ2 檢驗進行病例組和對照組基因型和等位基因型頻率以及維、漢兩民族內和民族間頻率分布差異的比較。
2 結果
2.1 TGFβ3 基因rs3917201位點分型結果
經飛行質譜技術獲得飛行質譜圖。TGFβ3基因rs3917201位點分型結果如圖 1所示，圖 1(a)為純合型AA,圖 1(b)為雜合型AG,圖 1(c)為野生型GG。
圖1
TGFβ3基因rs3917201位點基因型MALDI-TOF MS圖
(a)基因型AA;(b)基因型AG;(c)基因型GG
Figure1. TGFβ3 gene rs3917201 locus genotypes by MALDI-TOF MS(a) genotypes AA; (b) genotypes AG; (c) genotypes GG
2.2 TGFβ3基因rs3917201位點病例組與對照組基因型Hardy-Weinberg平衡檢測
經Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗，NSCL/P組和對照組基因型分布均符合Hardy-Weinberg的平衡法則，吻合度檢驗良好(P=0.080 88，P＞0.05)。
2.3 NSCL/P組與對照組TGFβ3基因rs3917201位點基因型及等位基因頻率分布的比較
從表 2可以看出: NSCL/P組和對照組基因型分布均以AG型頻率最高，AA型次之，GG型最低；等位基因均為A等位基因頻率較高。其中，NSCL/P組GG基因型頻率及G等位基因頻率高于對照組，但兩組間比較TGFβ3基因rs3917201位點基因型及等位基因頻率的分布差異沒有統計學意義(P＞0.05)。
表2
NSCL/P組與對照組TGFβ3基因rs3917201位點基因型及等位基因頻率分布的比較[例，(%)]
Table2.
Comparison of the distribution of TGFβ3 gene rs3917201 locus genotypes and allele frequencies of the NSCL/P group and control group [case,(%)]
2.4 新疆維、漢兩民族內NSCL/P組與對照組TGFβ3基因rs3917201位點基因型和等位基因頻率分布的比較
由表 3可以看出：維吾爾族中，NSCL/P 組AA、GG基因型及G等位基因頻率高于對照組，但兩組間基因型及等位基因頻率的分布差異無統計學意義(P＞0.05)；漢族中，NSCL/P 組GG基因型及等位基因G頻率高于對照組，但兩組間基因型頻率的分布差異無統計學意義(P＞0.05)，而等位基因A和G的頻率分布差異有統計學意義(P＜0.05)。
表3
新疆維、漢兩民族內NSCL/P組與對照組TGFβ3基因rs3917201位點基因型及等位基因頻率分布的比較[例，(%)]
Table3.
Comparison of the distribution of TGFβ3 gene rs3917201 locus genotypes and allele frequencies of the NSCL/P group and control group within Xinjiang Uygurs and Hans [case,(%)]
2.5 新疆維、漢兩民族間TGFβ3基因rs3917201位點基因型和等位基因頻率分布的比較
由表 4可以看出：NSCL/P患者中維族AA基因型及A等位基因頻率高于漢族，但兩民族間基因型和等位基因頻率的分布差異無統計學意義(P＞0.05)。健康人群中維族AG基因型及G等位基因頻率高于漢族，但兩民族間基因型和等位基因頻率的分布差異也無統計學意義(P＞0.05)。
表4
新疆維、漢兩民族間TGFβ3基因rs3917201位點基因型及等位基因頻率分布的比較[例，(%)]
Table4.
Comparison of the distribution of TGFβ3 gene rs3917201 locus genotypes and allele frequencies of Uygurs and Hans population in XinJiang [case,(%)]
3 討論
近年來研究表明，新生兒畸形率呈上升趨勢，而唇腭裂畸形發生率上升較為迅速，我國的發病率為0.182%[6]。TGFβ3是一種多功能的生物活性調節因子，廣泛調控細胞增殖與分化、機體的生長和發育、組織修復、各種癌變等生理和實驗過程，具有重要的生物學功能。同時，它對細胞生長起雙向調節作用，對大多數間充質細胞、胚胎成纖維細胞、上皮角化細胞、T和B淋巴細胞以及內皮細胞，是一種強有效的生長抑制劑。它在腭板正常融合所需要的腭板中縫上皮細胞中呈特異性表達，對腮板中縫上皮細胞的融合及腭板中線的消失也起到作用。
關于TGFβ3與人類的NSCL/P發生是否有關，國內外已有的研究結論不一。Ulucan等[7]對土耳其的68個病例和114個對照研究發現TGF β 3SfaNI多態性與NSCL/P發生相關，其GG基因型及G等位基因分布頻率在病例組和對照組有顯著差異。Suazo等[8]對智利89個具有NSCL/P 先證者的獨立家系中篩查到的150例NSCL/P 患者及其父母的TGFβ3基因進行等位基因遺傳不平衡檢驗，發現TGFβ3SfaNI基因多態性與NSCL/P也有關。Kim等[9]在韓國人群中也發現TGFβ3SfaNI多態性與韓國人群NSCL/P有關聯。而劉寧等[10]對48個核心家庭的48例NSCL/P患者的TGFβ3基因SfaNI多態性進行檢測，發現其與中國人群NSCL/P發生無相關性。
本研究納入新疆維吾爾族、漢族NSCL/P患者及健康人對照，通過飛行時間質譜檢測分析顯示：新疆NSCL/P患者和健康人群之間，TGFβ3基因Sfa NI基因型和等位基因頻率的分布差異無統計學意義(P＞0.05)，這與劉寧[10]對48個核心家庭人群NSCL/P的報道一致；在新疆維吾爾族中，NSCL/P組和對照組TGFβ3基因SfaNI位點基因型及等位基因分布差異均無統計學意義(P＞0.05)；在維吾爾族、漢族兩民族間無論是NSCL/P患者還是正常人群，TGFβ3基因SfaNI位點基因型和等位基因頻率的分布差異亦沒有統計學意義(P＞0.05)。因此，我們初步認為新疆維吾爾族人群NSCL/P 與TGFβ3基因的SfaNI多態性無關，而漢族人群NSCL/P的發生與SfaNI多態性中等位基因A、G的頻率有關，分析其原因可能是NSCL/P跟種族、地域、樣本含量以及研究方法的不同有關；NSCL/P是多基因遺傳病，是基因-基因或基因-環境共同作用的結果，還可能是多個基因協同作用的結果。因此，關于對新疆維、漢民族NSCL/P的發病機制是否具有差異，以及TGFβ3基因的其他位點與NSCL/P的發生是否有關聯性，還有待進一步的大樣本研究。
