神經干細胞（NSC）是一類能向神經細胞和膠質細胞分化的特殊干細胞。Müller細胞作為視網膜主要內源性NSC，具有在視網膜損傷后進入細胞周期增生并分化為神經細胞的能力。在脊椎動物中，視網膜Müller細胞的內源性NSC自發再生有著很高的效率，而哺乳動物這一能力幾乎完全消失。深入研究發現，Ascl1、Sox2、Lin28、Atoh7等部分轉錄因子具有促進Müller細胞增生并分化為神經細胞的功能。而Ascl1聯合組蛋白脫乙酰酶抑制劑更能使小鼠Müller細胞分化的神經細胞整合進入已有的視網膜并能對光做出反應，從而可能挽救視力。但與斑馬魚相比，哺乳動物Müller細胞增生再生能力依然十分有限。尋找更多能增強Müller細胞分化能力的新因子將成為亟待解決的重要問題。
引用本文： 柯屹峰, 張瓏俐, 李筱榮. 視網膜Müller細胞的內源性神經干細胞特性研究進展. 中華眼底病雜志, 2019, 35(5): 522-525. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2019.05.023 復制
視網膜再生研究的干細胞類型主要包括內源性神經干細胞（NSC）如Müller細胞，以及來自睫狀體邊緣區的視網膜干細胞。外源性干細胞則包括骨髓間充質干細胞、脂肪干細胞、胚胎干細胞和誘導多功能干細胞等[1]。干細胞的長時間自我更新和多向分化能力是實現神經細胞再生的關鍵。干細胞療法提供了一種全新的神經再生方法，在人視網膜疾病中，應用干細胞分化的外源性神經細胞來替代受損的神經細胞，從而挽救視功能。但是這種替代治療是一個復雜的過程，需要再生細胞整合進入原有視網膜與視神經網絡并與其產生正確的突觸連接。此外，外源性細胞移植還可能會激活宿主的免疫反應，從而排斥移植細胞。一個折中的方案是使用自體干細胞移植，但過程仍然十分復雜，必須在干細胞移植后精確控制細胞生長。近期有文獻報道，3例老年性黃斑變性患者在接受自體脂肪干細胞移植1年后視力喪失[2]。因此，動員內源性NSC重新進入增生周期并向神經細胞再生是一種更有前途的方法。NSC是一類能向神經細胞和膠質細胞分化的特殊干細胞[3]。在內源性NSC中，Müller細胞是視網膜主要的NSC，分布于從視網膜內界膜到視網膜下腔的視網膜全層，非常適合作為視網膜再生的儲備細胞。Müller細胞具有在視網膜損傷后進入細胞周期增生并分化為神經細胞的能力，這一功能在既往動物實驗研究中多有報道。現就Müller細胞內源性NSC特性研究進展作一綜述。
1 Müller細胞在斑馬魚視網膜再生中的重編程過程
部分非哺乳動物如魚、雞、蛙類中，視網膜損傷后自發再生有很高的效率[4-6]。而其中最具有代表性的是斑馬魚。斑馬魚視網膜嚴重損傷60 d后，視網膜內核層、外核層、神經節細胞層結構能完全恢復，同時光感受器細胞也逐漸恢復正常形態[4]。斑馬魚視網膜NSC主要是Müller細胞，是一種放射狀膠質細胞并能表達膠質纖維酸性蛋白和谷氨酰胺合成酶。可重新進入細胞增生周期再分化為神經前體細胞，并能向視網膜所有神經細胞再生，最終挽救視功能[7]。在一項中樞神經系統前體細胞的研究中，觀察到放射狀膠質細胞是大腦和視網膜的內源性NSC，NSC為避免過早被損耗通常處于相對靜止狀態。因此，內源性NSC在進行神經細胞再生時，先從靜止狀態進入細胞增生周期再進行分化[8]。在斑馬魚中，少數細胞因子被證實能控制Müller細胞增生和分化。在視網膜受傷后NSC重編程過程中，具有螺旋結構的轉錄因子Ascl1a和RNA結合蛋白Lin28被認為在激活視網膜再生相關信號通路中（包括Wnt和Notch信號通路）起到關鍵作用。早期研究顯示，斑馬魚視網膜損傷6 h后Ascl1a表達上調，并且在損傷36 h內持續升高，最長時間可達7 d之后[9-11]。而Ascl1a基因表達下調則抑制視網膜損傷后的增生和再生能力[9]。Lin28是一種在胚胎干細胞和腫瘤細胞中表達的RNA結合蛋白，在斑馬魚的視網膜損傷后Ascl1a能直接結合到Lin28基因的啟動子上，并且Lin28啟動子的活性隨著Ascl1a表達濃度的升高而增強。而Lin28能抑制let-7 miRNA（一種能調節細胞分化的miRNA）的形成并促進它的降解，從而促進Müller細胞的逆分化[12]。但Ascl1a和Lin28的體內調節機制仍然需要進一步研究。Lin28基因下調不能影響Ascl1a轉錄水平[12]，但在光感受器細胞再生時Lin28基因下調可以阻止Ascl1a蛋白生成[13]，表明可能還有其他細胞因子參與了視網膜再生活動。最近，兩種新地轉錄因子Sox2和Atoh7被發現在受損視網膜的Müller細胞中重新表達。在光損傷1個月后的斑馬魚視網膜中，Sox2在Müller細胞中高表達并刺激Müller細胞增生，而Sox2基因敲除后Müller細胞增生能力大幅下降[14]。在受損傷的青鳉魚視網膜，Atoh7在增生期Müller細胞和神經前體細胞中表達，并通過激活Notch信號通路促使Müller細胞有絲分裂效率提高[15]。此外，Sox2和Atoh7還能使靜止狀態的Müller細胞重新進入細胞周期并分化為神經細胞。值得注意的是，Sox2能誘導Ascl1a和Atoh7表達，且Ascl1a先于Atoh7表達并最后激活Lin28轉錄。然而Atoh基因表達是在Ascl1a下游還是兩者沿兩條平行通路分別表達來調控Lin28仍然未知。明確Sox2- Ascl1a/Atoh7- Lin28信號轉錄級聯反應是控制斑馬魚視網膜損傷后NSC重編程和神經細胞再生的關鍵。
2 哺乳動物Müller再生能力受到限制
Müller細胞在所有脊椎動物視網膜損傷再生中都扮演重要角色，而哺乳動物Müller細胞再生能力幾乎消失。哺乳動物視網膜嚴重損傷主要引發膠質細胞反應性增生，并引起細胞反應性肥大，Müller細胞轉分化為成纖維細胞并最終在視網膜下形成膠質瘢痕[7]。Müller細胞這種膠質增生反應既有神經保護的有利作用，同時也有細胞損傷的有害作用。神經保護作用主要阻止組織損傷和神經細胞死亡，包括平衡鉀離子、攝取谷氨酸、釋放抗氧化劑、一氧化氮（NO）、神經營養因子。而有害作用則增加神經細胞死亡所導致的膠質瘢痕形成，包括釋放炎癥因子TNF，過度生產NO等。重點是相同的膠質增生反應依據持續時間和反應幅度能同時產生有益和有害的效果。慢性過度刺激或膠質增生的異常調節通常會引起有害反應[16]。而魚視網膜損傷后Müller細胞能表達膠質增生相關蛋白，但不會形成膠質瘢痕。其原因是因為魚視網膜損傷后膠質細胞增生被精確調控，保留上皮特性且不進行上皮-間質轉化。雖然斑馬魚Müller細胞具有多潛能干細胞特性，但同時也是視桿細胞前體細胞，因而能同時表達靜止體細胞相關蛋白和干細胞不對稱有絲分裂標記蛋白。因此，魚Müller細胞可以通過對體內穩態信號的反應不對稱分裂，產生視桿細胞的前體細胞或多潛能神經前體細胞。迄今為止，哺乳動物視網膜再生研究主要集中于損傷后Müller細胞的改變。但多數研究顯示，損傷后Müller細胞在基因表達和信號通路改變（如Stat3、肝素結合性表皮生長因子、TNF-α）所導致的膠質細胞增生較神經細胞再生更多。從中可以看出神經源性轉錄因子和神經細胞再生必需的因子如Acsl1a、Pax6、Six3、NeuroD，必須能驅使Müller細胞來源的視網膜前體細胞而不是Müller細胞本身發生增生分化[7]。盡管如此，哺乳動物Müller細胞在體外實驗中也發現具有潛在光感受器細胞前體細胞和雙極神經細胞特征[17-18]，從而揭示其也具有NSC細胞特性。進一步研究表明，在受損傷的小鼠視網膜，外源性神經前轉錄因子Ascl1的高表達具有提高Müller細胞增生并再生無長突神經細胞、雙級神經細胞和光感受器細胞的能力[19]。但是Müller細胞這種增生能力僅限制在幼鼠，因為外源基因進入染色體的能力在成年小鼠中受到廣泛限制。然而最新研究表明，視網膜Müller細胞中Ascl1的過表達聯合組蛋白脫乙酰酶抑制劑能繞開這些限制，促進成年小鼠視網膜損傷后新的神經細胞再生[20]。這些再生的神經細胞能整合進入已有的神經網絡并能對光做出反應，從而挽救視力。雖然這一結果極有前途，但哺乳動物與斑馬魚相比，其Müller細胞增生再生能力十分有限。總之，尋找除Ascl1外能增強哺乳動物視網膜Müller細胞有絲分裂能力的新因子以再生完整的視網膜是今后視網膜再生非常有前景的研究方向。
3 MicroRNA（miR）與Müller細胞再生
有研究表明，miR-9在斑馬魚Müller細胞中的表達能調控視網膜NSC增生和分化，miR-9的耗損能提高斑馬魚視網膜神經前體細胞和神經細胞的數量；進一步研究發現，miR-9下游目的基因TLX和ONECUT mRNAs的過表達能提高斑馬魚NSC向神經細胞分化的能力[21]。有趣的是，能提高視網膜NSC增生能力的Lin28是miR-9的靶目標[22]。miR-9的表達能抑制視網膜前體細胞生成，表明miR-9作為Sox2-Ascl1a/Atoh7-Lin28信號通路的負調節單元阻止了Müller細胞增生，而miR-9下游的目的基因能促進NSC增生和分化。在哺乳動物中，miRlet-7、miR-9是小鼠視網膜前體細胞向晚期發育成熟的關鍵調節因子，并能促使整個視網膜發育加快。而這些miR的靶基因Protogenin和Lin28表達升高能抑制視網膜前體細胞的進一步發育[22]。證實miRlet-7、miR-9作為Sox2-Ascl1a/Atoh7-Lin28信號通路的負調節單元同樣能阻止小鼠Müller細胞增生。在轉染的HEK293細胞中，miRlet-7能抑制再生相關基因Ascl1a、Hspd1、Lin-28、Pax6b和Oct4的表達[12]，在小鼠NSC中，miRlet-7b（let-7 microRNA家族成員）能通過作用于干細胞調節因子TLX和細胞周期調節因子CyclinD而抑制NSC的增生[23]。總之，這一發現支持了miR-9/ miRlet-7-TLX-ONECUT通路作為內源性Müller細胞重編程分化為有功能的視網膜神經細胞所發揮的重要作用。
4 未來展望
現階段研究主要的限制還在于NSC分化效率的不高。尋找新的能提高NSC分化效率的因子成為重中之重，如Ascl1對小鼠Müller細胞重編程過程只誘導了中等程度的雙極細胞再生[20]。表明其他控制Müller細胞增生和分化的因子很可能沒有受Ascl1的調節。然而已有研究確認，Müller細胞在斑馬魚視網膜損傷后少數細胞因子能提高Müller細胞的再生能力[24]。由于哺乳動物Müller細胞再生和分化能力的有限，需要找出哪種因子能高效促進Müller細胞在斑馬魚視網膜中的再生并將其移植到人視網膜再生過程中。最后怎樣將位于上游或平行于Ascl1的不同轉錄因子聯合起來并促進神經細胞增生和分化將成為一個重要的待解決問題。未來幾年，隨著高通量檢測技術的廣泛應用，促進Müller細胞再生和分化的候選基因將被篩選出，如果能找到這樣的基因，并整合各個轉錄因子，將極大提高Müller細胞分化為神經細胞的能力，為視網膜再生的臨床應用帶來切實可行的希望。
視網膜再生研究的干細胞類型主要包括內源性神經干細胞（NSC）如Müller細胞，以及來自睫狀體邊緣區的視網膜干細胞。外源性干細胞則包括骨髓間充質干細胞、脂肪干細胞、胚胎干細胞和誘導多功能干細胞等[1]。干細胞的長時間自我更新和多向分化能力是實現神經細胞再生的關鍵。干細胞療法提供了一種全新的神經再生方法，在人視網膜疾病中，應用干細胞分化的外源性神經細胞來替代受損的神經細胞，從而挽救視功能。但是這種替代治療是一個復雜的過程，需要再生細胞整合進入原有視網膜與視神經網絡并與其產生正確的突觸連接。此外，外源性細胞移植還可能會激活宿主的免疫反應，從而排斥移植細胞。一個折中的方案是使用自體干細胞移植，但過程仍然十分復雜，必須在干細胞移植后精確控制細胞生長。近期有文獻報道，3例老年性黃斑變性患者在接受自體脂肪干細胞移植1年后視力喪失[2]。因此，動員內源性NSC重新進入增生周期并向神經細胞再生是一種更有前途的方法。NSC是一類能向神經細胞和膠質細胞分化的特殊干細胞[3]。在內源性NSC中，Müller細胞是視網膜主要的NSC，分布于從視網膜內界膜到視網膜下腔的視網膜全層，非常適合作為視網膜再生的儲備細胞。Müller細胞具有在視網膜損傷后進入細胞周期增生并分化為神經細胞的能力，這一功能在既往動物實驗研究中多有報道。現就Müller細胞內源性NSC特性研究進展作一綜述。
1 Müller細胞在斑馬魚視網膜再生中的重編程過程
部分非哺乳動物如魚、雞、蛙類中，視網膜損傷后自發再生有很高的效率[4-6]。而其中最具有代表性的是斑馬魚。斑馬魚視網膜嚴重損傷60 d后，視網膜內核層、外核層、神經節細胞層結構能完全恢復，同時光感受器細胞也逐漸恢復正常形態[4]。斑馬魚視網膜NSC主要是Müller細胞，是一種放射狀膠質細胞并能表達膠質纖維酸性蛋白和谷氨酰胺合成酶。可重新進入細胞增生周期再分化為神經前體細胞，并能向視網膜所有神經細胞再生，最終挽救視功能[7]。在一項中樞神經系統前體細胞的研究中，觀察到放射狀膠質細胞是大腦和視網膜的內源性NSC，NSC為避免過早被損耗通常處于相對靜止狀態。因此，內源性NSC在進行神經細胞再生時，先從靜止狀態進入細胞增生周期再進行分化[8]。在斑馬魚中，少數細胞因子被證實能控制Müller細胞增生和分化。在視網膜受傷后NSC重編程過程中，具有螺旋結構的轉錄因子Ascl1a和RNA結合蛋白Lin28被認為在激活視網膜再生相關信號通路中（包括Wnt和Notch信號通路）起到關鍵作用。早期研究顯示，斑馬魚視網膜損傷6 h后Ascl1a表達上調，并且在損傷36 h內持續升高，最長時間可達7 d之后[9-11]。而Ascl1a基因表達下調則抑制視網膜損傷后的增生和再生能力[9]。Lin28是一種在胚胎干細胞和腫瘤細胞中表達的RNA結合蛋白，在斑馬魚的視網膜損傷后Ascl1a能直接結合到Lin28基因的啟動子上，并且Lin28啟動子的活性隨著Ascl1a表達濃度的升高而增強。而Lin28能抑制let-7 miRNA（一種能調節細胞分化的miRNA）的形成并促進它的降解，從而促進Müller細胞的逆分化[12]。但Ascl1a和Lin28的體內調節機制仍然需要進一步研究。Lin28基因下調不能影響Ascl1a轉錄水平[12]，但在光感受器細胞再生時Lin28基因下調可以阻止Ascl1a蛋白生成[13]，表明可能還有其他細胞因子參與了視網膜再生活動。最近，兩種新地轉錄因子Sox2和Atoh7被發現在受損視網膜的Müller細胞中重新表達。在光損傷1個月后的斑馬魚視網膜中，Sox2在Müller細胞中高表達并刺激Müller細胞增生，而Sox2基因敲除后Müller細胞增生能力大幅下降[14]。在受損傷的青鳉魚視網膜，Atoh7在增生期Müller細胞和神經前體細胞中表達，并通過激活Notch信號通路促使Müller細胞有絲分裂效率提高[15]。此外，Sox2和Atoh7還能使靜止狀態的Müller細胞重新進入細胞周期并分化為神經細胞。值得注意的是，Sox2能誘導Ascl1a和Atoh7表達，且Ascl1a先于Atoh7表達并最后激活Lin28轉錄。然而Atoh基因表達是在Ascl1a下游還是兩者沿兩條平行通路分別表達來調控Lin28仍然未知。明確Sox2- Ascl1a/Atoh7- Lin28信號轉錄級聯反應是控制斑馬魚視網膜損傷后NSC重編程和神經細胞再生的關鍵。
2 哺乳動物Müller再生能力受到限制
Müller細胞在所有脊椎動物視網膜損傷再生中都扮演重要角色，而哺乳動物Müller細胞再生能力幾乎消失。哺乳動物視網膜嚴重損傷主要引發膠質細胞反應性增生，并引起細胞反應性肥大，Müller細胞轉分化為成纖維細胞并最終在視網膜下形成膠質瘢痕[7]。Müller細胞這種膠質增生反應既有神經保護的有利作用，同時也有細胞損傷的有害作用。神經保護作用主要阻止組織損傷和神經細胞死亡，包括平衡鉀離子、攝取谷氨酸、釋放抗氧化劑、一氧化氮（NO）、神經營養因子。而有害作用則增加神經細胞死亡所導致的膠質瘢痕形成，包括釋放炎癥因子TNF，過度生產NO等。重點是相同的膠質增生反應依據持續時間和反應幅度能同時產生有益和有害的效果。慢性過度刺激或膠質增生的異常調節通常會引起有害反應[16]。而魚視網膜損傷后Müller細胞能表達膠質增生相關蛋白，但不會形成膠質瘢痕。其原因是因為魚視網膜損傷后膠質細胞增生被精確調控，保留上皮特性且不進行上皮-間質轉化。雖然斑馬魚Müller細胞具有多潛能干細胞特性，但同時也是視桿細胞前體細胞，因而能同時表達靜止體細胞相關蛋白和干細胞不對稱有絲分裂標記蛋白。因此，魚Müller細胞可以通過對體內穩態信號的反應不對稱分裂，產生視桿細胞的前體細胞或多潛能神經前體細胞。迄今為止，哺乳動物視網膜再生研究主要集中于損傷后Müller細胞的改變。但多數研究顯示，損傷后Müller細胞在基因表達和信號通路改變（如Stat3、肝素結合性表皮生長因子、TNF-α）所導致的膠質細胞增生較神經細胞再生更多。從中可以看出神經源性轉錄因子和神經細胞再生必需的因子如Acsl1a、Pax6、Six3、NeuroD，必須能驅使Müller細胞來源的視網膜前體細胞而不是Müller細胞本身發生增生分化[7]。盡管如此，哺乳動物Müller細胞在體外實驗中也發現具有潛在光感受器細胞前體細胞和雙極神經細胞特征[17-18]，從而揭示其也具有NSC細胞特性。進一步研究表明，在受損傷的小鼠視網膜，外源性神經前轉錄因子Ascl1的高表達具有提高Müller細胞增生并再生無長突神經細胞、雙級神經細胞和光感受器細胞的能力[19]。但是Müller細胞這種增生能力僅限制在幼鼠，因為外源基因進入染色體的能力在成年小鼠中受到廣泛限制。然而最新研究表明，視網膜Müller細胞中Ascl1的過表達聯合組蛋白脫乙酰酶抑制劑能繞開這些限制，促進成年小鼠視網膜損傷后新的神經細胞再生[20]。這些再生的神經細胞能整合進入已有的神經網絡并能對光做出反應，從而挽救視力。雖然這一結果極有前途，但哺乳動物與斑馬魚相比，其Müller細胞增生再生能力十分有限。總之，尋找除Ascl1外能增強哺乳動物視網膜Müller細胞有絲分裂能力的新因子以再生完整的視網膜是今后視網膜再生非常有前景的研究方向。
3 MicroRNA（miR）與Müller細胞再生
有研究表明，miR-9在斑馬魚Müller細胞中的表達能調控視網膜NSC增生和分化，miR-9的耗損能提高斑馬魚視網膜神經前體細胞和神經細胞的數量；進一步研究發現，miR-9下游目的基因TLX和ONECUT mRNAs的過表達能提高斑馬魚NSC向神經細胞分化的能力[21]。有趣的是，能提高視網膜NSC增生能力的Lin28是miR-9的靶目標[22]。miR-9的表達能抑制視網膜前體細胞生成，表明miR-9作為Sox2-Ascl1a/Atoh7-Lin28信號通路的負調節單元阻止了Müller細胞增生，而miR-9下游的目的基因能促進NSC增生和分化。在哺乳動物中，miRlet-7、miR-9是小鼠視網膜前體細胞向晚期發育成熟的關鍵調節因子，并能促使整個視網膜發育加快。而這些miR的靶基因Protogenin和Lin28表達升高能抑制視網膜前體細胞的進一步發育[22]。證實miRlet-7、miR-9作為Sox2-Ascl1a/Atoh7-Lin28信號通路的負調節單元同樣能阻止小鼠Müller細胞增生。在轉染的HEK293細胞中，miRlet-7能抑制再生相關基因Ascl1a、Hspd1、Lin-28、Pax6b和Oct4的表達[12]，在小鼠NSC中，miRlet-7b（let-7 microRNA家族成員）能通過作用于干細胞調節因子TLX和細胞周期調節因子CyclinD而抑制NSC的增生[23]。總之，這一發現支持了miR-9/ miRlet-7-TLX-ONECUT通路作為內源性Müller細胞重編程分化為有功能的視網膜神經細胞所發揮的重要作用。
4 未來展望
現階段研究主要的限制還在于NSC分化效率的不高。尋找新的能提高NSC分化效率的因子成為重中之重，如Ascl1對小鼠Müller細胞重編程過程只誘導了中等程度的雙極細胞再生[20]。表明其他控制Müller細胞增生和分化的因子很可能沒有受Ascl1的調節。然而已有研究確認，Müller細胞在斑馬魚視網膜損傷后少數細胞因子能提高Müller細胞的再生能力[24]。由于哺乳動物Müller細胞再生和分化能力的有限，需要找出哪種因子能高效促進Müller細胞在斑馬魚視網膜中的再生并將其移植到人視網膜再生過程中。最后怎樣將位于上游或平行于Ascl1的不同轉錄因子聯合起來并促進神經細胞增生和分化將成為一個重要的待解決問題。未來幾年，隨著高通量檢測技術的廣泛應用，促進Müller細胞再生和分化的候選基因將被篩選出，如果能找到這樣的基因，并整合各個轉錄因子，將極大提高Müller細胞分化為神經細胞的能力，為視網膜再生的臨床應用帶來切實可行的希望。