引用本文： 邢小麗, 黃亮瑜, 張哲, 黃欣遠, 王瓊, 李筱榮, 東莉潔. 丁基苯酞對H2O2誘導下視網膜色素上皮細胞凋亡的保護作用. 中華眼底病雜志, 2019, 35(5): 480-487. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2019.05.011 復制
紫外線、高血糖等多種外界因素可導致眼部細胞成分內氧自由基堆積[1-2]。一旦高分子ROS自由基產生過多超出細胞的清除能力，導致氧化與抗氧化系統的失衡，即可誘發細胞結構及功能的異常改變，進而導致青光眼、白內障、糖尿病視網膜病變等眼部病變的發生發展[3-4]。因此，如何有效地抑制或減輕細胞的氧化應激損傷已成為臨床醫生的關注熱點之一。丁基苯酞（NBP）是我國擁有自主知識產權的藥物，可作用于缺血性腦卒中所致腦損傷的多個病理環節，具有較強抗氧化及抗缺血再灌注損傷[5]。其不僅能夠有效增加缺血區血流量、改善全腦缺血后的能量代謝、減輕神經功能損傷的程度等功能[6]，NBP預處理還可以改善全腦缺血引起的遲發性神經元死亡，有效提高神經元細胞的存活率[7]。我們推測氧化應激條件下，NBP或許能對來源于神經外胚層的RPE細胞發揮類似的保護作用。因此，本研究將NBP應用于RPE細胞的氧化損傷體系中，旨在通過探究NBP對于氧化應激損傷RPE細胞的保護作用，挖掘保護RPE細胞免受氧化應激損傷的潛在因子。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料及實驗分組
人ARPE-19細胞系由天津醫科大學眼科醫院李筱榮教授惠贈。NBP（河北石藥集團），Hoechst 33258染色劑、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1，上海翊圣生物科技有限公司），MTT溶液（北京索萊寶科技有限公司），2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA，美國Sigma公司），10%胎牛血清、青霉素/鏈霉素、DMEM basic（1×）（美國Gibco公司）。抗血紅素氧合酶1（HO-1）抗體（BA0605-1，美國Boster公司），DAPI（美國Invitrogen公司），山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor? 488，ab150077，美國Abcam公司）。恒溫培養箱、超凈工作臺（美國賽默飛世爾科技公司），熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。
實驗分為對照組、模型組及NBP組。對照組單純采用完全培養基培養細胞。模型組采用200 μmol/L的H2O2刺激細胞2 h，換液后給予完全培養基培養細胞。NBP組采用200 μmol/L的H2O2及1 μmol/L的NBP共同培養細胞2 h，換液后給予完全培養基聯合1 μmol/L的NBP繼續培養細胞。
1.2 實驗方法
采用MTT法觀察氧化應激刺激后NBP對RPE細胞生長活性的影響[8]。按細胞密度3×104個/孔接種RPE細胞于96孔板中。各組細胞分組培養24、48 h加入MTT溶液孵育4 h，撤除MTT溶液后加入150 μl DMSO，室溫靜置10 min后使用酶標儀檢測波長490 nm處的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。以此作為各組細胞生存力，觀察分析NBP對抗氧化應激的影響。每組設定3個副孔，實驗共重復進行3次。
采用HE染色觀察氧化應激刺激后NBP對RPE細胞形態改變的影響[9]。按細胞密度2.5×104個/孔將RPE細胞種植于24孔板玻璃片上，待細胞生長密度約80%時用于實驗。各組細胞分組培養2 h后中止刺激，4%多聚甲醛室溫固定15 min，更換為破膜水室溫10 min，清水沖洗，將玻片浸泡于蘇木精染液中20 s（浸泡時間根據蘇木精染液使用情況調整），清水沖洗后將玻片移入1%醋酸中1 s，清水沖洗后移入0.5%氨水中1 s，清水沖洗后移入伊紅染液中30 s（浸泡時間根據伊紅染液使用情況調整），過水后進行酒精梯度脫水，每缸30 s，最終將玻片移入二甲苯中1 min，晾干后固定于載玻片上，光學顯微鏡下觀察H2O2氧化應激刺激下RPE細胞形態變化。
采用Hoechst33258染色觀察受到H2O2氧化應激刺激時NBP對RPE細胞凋亡的保護作用。按細胞密度3×104個/孔接種RPE細胞于96孔細胞板中，各組細胞分組培養2 h后吸除上清，加入4%多聚甲醛50 μl常溫下固定10 min，PBS清洗（2次/孔），加入Hoechst33258染色劑30 μl進行染色（工作濃度1 μg/ml），10 min后吸除，PBS 清洗（2次/孔），每孔加入PBS 100 μl后，熒光顯微鏡觀察在受到H2O2氧化應激刺激下以及在NBP的作用下，RPE細胞核出現凋亡的情況。每張圖片隨機選取5個視野，計數凋亡細胞核的數量并取其均值。每組設定3個副孔，實驗重復驗證3次。
采用ROS染色觀察受到氧化應激刺激條件下NBP對RPE細胞內質網中ROS表達水平的影響[10]。經細胞計數后將RPE細胞按細胞密度3×104個/孔接種于96孔板中，各組細胞分組培養2 h后換液，刺激后第2天進行ROS染色（工作濃度為DCFH-DA稀釋1000倍）。每孔加入30 μl，放置于37 ℃、5%CO2孵箱避光孵育20 min后取出，使用PBS清洗2次。熒光顯微鏡下觀察受到氧化應激刺激后RPE細胞內質網中ROS的表達以及在NBP作用下ROS表達的水平。每組設定3個副孔，實驗重復驗證3次。
采用JC-1法檢測NBP對RPE細胞早期凋亡的作用。當線粒體膜電位相對較高時，JC-1均聚集于基質當中形成聚合物，此時將會發出紅色熒光；當線粒體膜電位相對較低時，JC-1無法聚集于基質當中，JC-1此時呈單體發出綠色熒光。JC-1法以熒光顏色的轉換觀察線粒體膜電位的變化。參照試劑盒說明書配置JC-1染色劑：稀釋配比量JC-1（200×），按每50 μl JC-1（200×）加入8 ml 超純水的比例稀釋JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-1。再加入2 ml JC-1 染色緩沖液（5×），混勻后即為JC-1 染色工作液。JC-1染色緩沖液（1×）保持4 ℃左右。將RPE細胞以細胞密度3×104個/孔接種于96孔板，各組細胞分組培養2 h后移去刺激物，使用PBS進行清洗，加入預先配好的JC-1染色工作液50 μl/孔，孔板放置于37 ℃、5%CO2孵箱避光孵育20 min，移除JC-1染色工作液，用JC-1緩沖液充分洗滌2次/孔，加入100 μl PBS/孔，熒光顯微鏡下觀察。每一實驗組設定3個副孔，實驗重復驗證3次。
采用免疫熒光染色示蹤NBP對RPE細胞內HO-1表達的影響[11]。分別將各組細胞以PBS清洗，加入4%多聚甲醛于室溫下固定10 min，使用破膜水（PBS+0.1%Triton X-100）常溫環境下10 min，再以PBS充分清洗3次，使用封閉液（PBS+牛血清白蛋白）常溫環境中30 min，使用抗HO-1抗體（1：500）避光于4 ℃濕盒中孵育過夜。第2天取出濕盒，恢復室溫，經PBS洗滌后加入山羊抗兔二抗（1:1000）在室溫下避光孵育2 h。然后用DAPI染色細胞用于細胞核可視化，熒光顯微鏡下觀察拍照。
采用Western blot分析NBP作用0、2、4、12 h時對RPE細胞內HO-1表達的作用[12]。分別收集各組細胞并提取總蛋白，根據BCA試劑盒定量分析得到的蛋白濃度，分別調整不同分組的上樣量體積，每組以40 μg的總蛋白量進行上樣。以10% SDS-PAGE膠通過恒壓電泳來分離蛋白復合物。濃縮膠80 V電壓，分離膠110 V電壓，通過預染蛋白標記物在膠中的分散程度決定分離膠的跑膠時間。待跑膠結束后以半干轉印法將分離的蛋白條帶轉印至PVDF膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，抗HO-1抗體一抗4 ℃過夜孵育，TBST 洗膜10 min，重復3次；加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，PBS洗膜10 min，重復3次；最后加入化學發光底物進行曝光并拍照，以檢測靶蛋白表達。采用Image J圖像分析儀進行灰度分析，以GAPDH作為內參照進行校正，計算目的蛋白的相對表達量。目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。
1.3 統計學方法
采用SPSS18.0軟件進行統計學分析處理。實驗數據以均數±標準差（
）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
MTT法檢測結果顯示，細胞培養24 h時，對照組、模型組、NBP組細胞生存力分別為0.86±0.05、0.36±0.03、0.47±0.04；細胞培養48 h時，對照組、模型組、NBP組細胞生存力分別為1.26±0.11、0.45±0.05、0.82±0.06。細胞培養24、48 h，對照組與模型組細胞生存力之間的差異有統計學意義（t=17.710、13.760，P＜0.000 1、0.000 7）；模型組與NBP組細胞生存力之間的差異有統計學意義（t=4.857、9.225，P＜0.000 1、＜0.000 1）（圖1）。
圖1
對照組、模型組、NBP組細胞生存力比較。*P＜0.05，**P＜0.000 1
光學顯微鏡觀察發現，對照組RPE細胞呈多角形排列，可見邊界清晰細胞質。模型組可見細胞數量明顯減少，細胞質著染色深及細胞皺縮明顯。NBP組可見介于上述兩者間的細胞形態，其細胞數量較對照組少，但較NBP組增多；細胞核較對照組略小，但較模型組增大且細胞漿多（圖2）。
圖2
RPE細胞光學顯微鏡像。2A示對照組；2B示模型組；2C示NBP組。對照組RPE細胞呈多角形排列，可見邊界清晰細胞質；模型組可見細胞數量明顯減少，細胞質染色深及細胞皺縮明顯；NBP組可見介于上述兩者間的細胞形態 HE 標尺：100 μm
熒光顯微鏡觀察發現，對照組細胞核呈圓形，染色均一。模型組細胞核表現為致密濃染，皺縮變小或呈碎塊狀，可見熒光增強的亮點、半月形等形態不一的細胞核，為細胞核固縮及分裂。NBP組部分細胞核呈新月狀，且細胞核碎裂減少（圖3）。對照組、模型組、NBP組凋亡細胞核數分別為（1.33±1.25）、（15.00±2.94）、（8.33±1.25）個。NBP組凋亡細胞核數較對照組明顯增多（t=6.045，P=0.003 8），較模型組明顯降低（t=5.612，P=0.005 0），差異均有統計學意義。
圖3
RPE細胞熒光顯微鏡像。3A示對照組；3B示模型組；3C示NBP組。對照組RPE細胞核染色一致，形態完整；模型組可見細胞核濃縮固縮、碎裂，熒光著染增強；NBP組可見少數細胞核呈新月狀且細胞核碎裂減少，其余細胞染色均勻 Hoechst33258染色 標尺：100 μm
JC-1法檢測結果顯示，對照組、模型組、NBP組聚合物形成的紅色熒光無明顯差異，而模型組可見綠色熒光明顯增強，NBP組無特別強烈增強的綠色熒光（圖4）。對照組、模型組、NBP組細胞的綠色熒光密度分別為2 777.65±1 367.13、16 321.87±6 518.96、9 517.38±2 994.68。NBP組細胞的綠色熒光密度較對照組明顯增加（t=8.180，P＜0.000 1），較模型組明顯降低（t=8.236，P＜0.000 1），差異均有統計學意義。
圖4
RPE細胞熒光顯微鏡像。4A~4C分別示對照組、模型組、NBP組單體；4D~4F分別示對照組、模型組、NBP組聚合物；4G~4I分別示對照組、模型組、NBP組合成圖像。可見3組聚合物形成的紅色熒光無明顯差異；而模型組可見綠色熒光明顯增強，大量細胞呈早期凋亡征；NBP組無特別強烈增強的綠色熒光 JC-1染色 標尺：100 μm
DCFH-DA染色觀察發現，模型組細胞的綠色熒光明顯增多，而NBP組細胞的綠色熒光明顯較模型組降低（圖5）。對照組、模型組、NBP組細胞的ROS表達分別為5 430.36±3 008.58、27 712.73±18 408.36、15 718.63±7 843.46。NBP組細胞的ROS表達較對照組明顯增強（t=6.517，P＜0.000 1），較模型組明顯降低（t=66.278，P＜0.000 1），差異均有統計學意義。
圖5
對照組、模型組、治療組細胞ROS表達熒光顯微鏡像。5A~5C分別示對照組、模型組、NBP組。與對照組及NBP組比較，模型組強綠色熒光著染 DCFH-DA染色 標尺：100 μm
免疫熒光染色觀察發現，NBP組細胞的HO-1熒光強度較對照組明顯增高（圖6）。半定量分析結果顯示，對照組、模型組、NBP組細胞的HO-1熒光強度分別為10 901.33±2 683.18、322 211.67±42 772.26；NBP組與對照組細胞的HO-1熒光強度比較，差異有統計學意義（t=10.270，P=0.000 5）。
圖6
RPE細胞HO-1免疫熒光染色像。6A示對照組；6B示NBP組。NBP組細胞的HO-1熒光強度較對照組明顯增高 免疫熒光染色 標尺：100 μm
Western blot檢測結果顯示，NBP以時間依賴性的方式上調HO-1的表達水平。在NBP作用的不同時間點（0、4、8、12 h），HO-1相對表達量依次為0.37±0.01、0.84±0.06、0.96±0.05、1.00±0.02。NBP作用4、8、12 h時HO-1相對表達量較0 h時呈明確升高趨勢，差異有統計學意義（F=164.91，P＜0.05）（圖7）。
圖7
NBP不同作用時間下HO-1表達Western blot檢測像。7A示電泳圖，泳道1~4分別表示NBP作用時間0、2、4、12 h；7B示不同作用時間HO-1蛋白相對表達量比較。*P＜0.05
3 討論
NBP可通過抑制黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶反應系統中超氧陰離子自由基的形成，增加超氧化物歧化酶的含量，以此增加自由基的清除，達到抗自由基的目的，從而對機體細胞、器官發揮一定的保護作用[13-14]。如，NBP可減輕阿爾茲海默病模型動物腦內氧化應激刺激，減輕學習記憶障礙[15]；對于肌萎縮側索硬化癥模型動物，口服NBP可顯著改善運動功能及延長存活時間，并延緩運動神經元的損失[16]；而在雙側頸總動脈閉塞動物模型中，NBP處理組空間學習記憶障礙得到明顯改善，且海馬區缺陷也得到緩解[17]；不僅如此，在急性心肌梗死模型中NBP的作用亦令人鼓舞，不僅可以保護心肌，亦能減輕左心室纖維化，改善左心室功能及減少室性心律失常[18]。目前NBP在眼科領域的應用研究工作方興未艾。有研究發現，在糖尿病大鼠模型中NBP的干預可通過增強NF-E2相關因子2（Nrf2）、Trx和H2O2酶的表達，控制氧化應激的反應，同時延緩糖尿病性白內障的發生發展[7, 19]。但目前針對眼底視網膜疾病方面尚鮮有NBP作用的相關報道。
RPE具有吞噬光感受器外節段，合成及分泌多種生長因子及清除自由基等功能，在維持細胞內外的代謝平衡以及確保視網膜光感受器正常功能等方面發揮至關重要的作用[20-21]。本課題組既往研究發現，H2O2刺激的RPE氧化應激細胞模型中，細胞內出現大量ROS堆積，進而表現為RPE細胞的功能紊亂甚至凋亡[22]。并且我們還發現，NBP可通過抑制ROS的產生緩解H2O2誘導的人視網膜Müller細胞凋亡[23]。因此，本實驗選擇經典的H2O2刺激來復制體外氧化應激誘導模型，觀察NBP對于氧化應激損傷RPE細胞的保護作用。結果顯示，NBP組細胞生存力提高，凋亡細胞核數量減少，氧化應激產物產量降低。這提示NBP可以對抗氧自由基產生及減輕堆積，提高細胞自身抗氧化應激能力來緩解氧化損傷。
為初步了解NBP抑制H2O2誘導的RPE細胞凋亡的分子機制，我們運用了DCFH-DA探針對RPE細胞內ROS的表達進行了檢測。DCFH-DA探針本身不具有任何熒光，且具有自由穿梭細胞膜的特性，在細胞中可被脂酶水解成為DCFH-DA，此變化使其無法自由穿梭細胞膜而被迫固定于細胞內，受ROS的影響，DCFH-DA氧化呈現綠色熒光，且熒光強度與細胞內ROS濃度成正比。我們發現，H2O2處理可誘導綠色熒光明顯增強，表明細胞內確實有ROS與DCFH-DA反應；而NBP組能夠見到綠色熒光強度明顯減弱。由此可見，H2O2刺激后RPE細胞的ROS水平明顯增高，而加入NBP后ROS水平顯著下降。換言之，NBP能夠在RPE細胞面對H2O2氧化應激刺激時，減少ROS的生成及堆積，從而減輕RPE細胞的損傷，發揮一定的保護作用。
氧化應激是指機體內氧化系統與抗氧化體系之間失穩態，進而引發組織損傷的病理反應。HO-1是機體抗氧化系統的重要組成部分，作為Nrf2的下游基因，其具有抗炎、抗氧化及抗細胞凋亡等作用[24-25]。本研究結果顯示，NBP不僅可以上調HO-1的表達，而且NBP對HO-1的表達調控還具有時間的依賴性，即伴隨NBP的作用時間延長，其對HO-1的上調作用隨之提高。由此可見，NBP通過促進HO-1的表達，可有效拮抗H2O2誘導的細胞損傷。
本研究結果表明，NBP通過上調HO-1的表達來減少ROS堆積，從而緩解H2O2導致的RPE細胞凋亡。這為NBP今后應用于眼部缺血性視網膜疾病的預防和治療提供了有力的實驗室依據。
紫外線、高血糖等多種外界因素可導致眼部細胞成分內氧自由基堆積[1-2]。一旦高分子ROS自由基產生過多超出細胞的清除能力，導致氧化與抗氧化系統的失衡，即可誘發細胞結構及功能的異常改變，進而導致青光眼、白內障、糖尿病視網膜病變等眼部病變的發生發展[3-4]。因此，如何有效地抑制或減輕細胞的氧化應激損傷已成為臨床醫生的關注熱點之一。丁基苯酞（NBP）是我國擁有自主知識產權的藥物，可作用于缺血性腦卒中所致腦損傷的多個病理環節，具有較強抗氧化及抗缺血再灌注損傷[5]。其不僅能夠有效增加缺血區血流量、改善全腦缺血后的能量代謝、減輕神經功能損傷的程度等功能[6]，NBP預處理還可以改善全腦缺血引起的遲發性神經元死亡，有效提高神經元細胞的存活率[7]。我們推測氧化應激條件下，NBP或許能對來源于神經外胚層的RPE細胞發揮類似的保護作用。因此，本研究將NBP應用于RPE細胞的氧化損傷體系中，旨在通過探究NBP對于氧化應激損傷RPE細胞的保護作用，挖掘保護RPE細胞免受氧化應激損傷的潛在因子。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料及實驗分組
人ARPE-19細胞系由天津醫科大學眼科醫院李筱榮教授惠贈。NBP（河北石藥集團），Hoechst 33258染色劑、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1，上海翊圣生物科技有限公司），MTT溶液（北京索萊寶科技有限公司），2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA，美國Sigma公司），10%胎牛血清、青霉素/鏈霉素、DMEM basic（1×）（美國Gibco公司）。抗血紅素氧合酶1（HO-1）抗體（BA0605-1，美國Boster公司），DAPI（美國Invitrogen公司），山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor? 488，ab150077，美國Abcam公司）。恒溫培養箱、超凈工作臺（美國賽默飛世爾科技公司），熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。
實驗分為對照組、模型組及NBP組。對照組單純采用完全培養基培養細胞。模型組采用200 μmol/L的H2O2刺激細胞2 h，換液后給予完全培養基培養細胞。NBP組采用200 μmol/L的H2O2及1 μmol/L的NBP共同培養細胞2 h，換液后給予完全培養基聯合1 μmol/L的NBP繼續培養細胞。
1.2 實驗方法
采用MTT法觀察氧化應激刺激后NBP對RPE細胞生長活性的影響[8]。按細胞密度3×104個/孔接種RPE細胞于96孔板中。各組細胞分組培養24、48 h加入MTT溶液孵育4 h，撤除MTT溶液后加入150 μl DMSO，室溫靜置10 min后使用酶標儀檢測波長490 nm處的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。以此作為各組細胞生存力，觀察分析NBP對抗氧化應激的影響。每組設定3個副孔，實驗共重復進行3次。
采用HE染色觀察氧化應激刺激后NBP對RPE細胞形態改變的影響[9]。按細胞密度2.5×104個/孔將RPE細胞種植于24孔板玻璃片上，待細胞生長密度約80%時用于實驗。各組細胞分組培養2 h后中止刺激，4%多聚甲醛室溫固定15 min，更換為破膜水室溫10 min，清水沖洗，將玻片浸泡于蘇木精染液中20 s（浸泡時間根據蘇木精染液使用情況調整），清水沖洗后將玻片移入1%醋酸中1 s，清水沖洗后移入0.5%氨水中1 s，清水沖洗后移入伊紅染液中30 s（浸泡時間根據伊紅染液使用情況調整），過水后進行酒精梯度脫水，每缸30 s，最終將玻片移入二甲苯中1 min，晾干后固定于載玻片上，光學顯微鏡下觀察H2O2氧化應激刺激下RPE細胞形態變化。
采用Hoechst33258染色觀察受到H2O2氧化應激刺激時NBP對RPE細胞凋亡的保護作用。按細胞密度3×104個/孔接種RPE細胞于96孔細胞板中，各組細胞分組培養2 h后吸除上清，加入4%多聚甲醛50 μl常溫下固定10 min，PBS清洗（2次/孔），加入Hoechst33258染色劑30 μl進行染色（工作濃度1 μg/ml），10 min后吸除，PBS 清洗（2次/孔），每孔加入PBS 100 μl后，熒光顯微鏡觀察在受到H2O2氧化應激刺激下以及在NBP的作用下，RPE細胞核出現凋亡的情況。每張圖片隨機選取5個視野，計數凋亡細胞核的數量并取其均值。每組設定3個副孔，實驗重復驗證3次。
采用ROS染色觀察受到氧化應激刺激條件下NBP對RPE細胞內質網中ROS表達水平的影響[10]。經細胞計數后將RPE細胞按細胞密度3×104個/孔接種于96孔板中，各組細胞分組培養2 h后換液，刺激后第2天進行ROS染色（工作濃度為DCFH-DA稀釋1000倍）。每孔加入30 μl，放置于37 ℃、5%CO2孵箱避光孵育20 min后取出，使用PBS清洗2次。熒光顯微鏡下觀察受到氧化應激刺激后RPE細胞內質網中ROS的表達以及在NBP作用下ROS表達的水平。每組設定3個副孔，實驗重復驗證3次。
采用JC-1法檢測NBP對RPE細胞早期凋亡的作用。當線粒體膜電位相對較高時，JC-1均聚集于基質當中形成聚合物，此時將會發出紅色熒光；當線粒體膜電位相對較低時，JC-1無法聚集于基質當中，JC-1此時呈單體發出綠色熒光。JC-1法以熒光顏色的轉換觀察線粒體膜電位的變化。參照試劑盒說明書配置JC-1染色劑：稀釋配比量JC-1（200×），按每50 μl JC-1（200×）加入8 ml 超純水的比例稀釋JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-1。再加入2 ml JC-1 染色緩沖液（5×），混勻后即為JC-1 染色工作液。JC-1染色緩沖液（1×）保持4 ℃左右。將RPE細胞以細胞密度3×104個/孔接種于96孔板，各組細胞分組培養2 h后移去刺激物，使用PBS進行清洗，加入預先配好的JC-1染色工作液50 μl/孔，孔板放置于37 ℃、5%CO2孵箱避光孵育20 min，移除JC-1染色工作液，用JC-1緩沖液充分洗滌2次/孔，加入100 μl PBS/孔，熒光顯微鏡下觀察。每一實驗組設定3個副孔，實驗重復驗證3次。
采用免疫熒光染色示蹤NBP對RPE細胞內HO-1表達的影響[11]。分別將各組細胞以PBS清洗，加入4%多聚甲醛于室溫下固定10 min，使用破膜水（PBS+0.1%Triton X-100）常溫環境下10 min，再以PBS充分清洗3次，使用封閉液（PBS+牛血清白蛋白）常溫環境中30 min，使用抗HO-1抗體（1：500）避光于4 ℃濕盒中孵育過夜。第2天取出濕盒，恢復室溫，經PBS洗滌后加入山羊抗兔二抗（1:1000）在室溫下避光孵育2 h。然后用DAPI染色細胞用于細胞核可視化，熒光顯微鏡下觀察拍照。
采用Western blot分析NBP作用0、2、4、12 h時對RPE細胞內HO-1表達的作用[12]。分別收集各組細胞并提取總蛋白，根據BCA試劑盒定量分析得到的蛋白濃度，分別調整不同分組的上樣量體積，每組以40 μg的總蛋白量進行上樣。以10% SDS-PAGE膠通過恒壓電泳來分離蛋白復合物。濃縮膠80 V電壓，分離膠110 V電壓，通過預染蛋白標記物在膠中的分散程度決定分離膠的跑膠時間。待跑膠結束后以半干轉印法將分離的蛋白條帶轉印至PVDF膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，抗HO-1抗體一抗4 ℃過夜孵育，TBST 洗膜10 min，重復3次；加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，PBS洗膜10 min，重復3次；最后加入化學發光底物進行曝光并拍照，以檢測靶蛋白表達。采用Image J圖像分析儀進行灰度分析，以GAPDH作為內參照進行校正，計算目的蛋白的相對表達量。目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。
1.3 統計學方法
采用SPSS18.0軟件進行統計學分析處理。實驗數據以均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
MTT法檢測結果顯示，細胞培養24 h時，對照組、模型組、NBP組細胞生存力分別為0.86±0.05、0.36±0.03、0.47±0.04；細胞培養48 h時，對照組、模型組、NBP組細胞生存力分別為1.26±0.11、0.45±0.05、0.82±0.06。細胞培養24、48 h，對照組與模型組細胞生存力之間的差異有統計學意義（t=17.710、13.760，P＜0.000 1、0.000 7）；模型組與NBP組細胞生存力之間的差異有統計學意義（t=4.857、9.225，P＜0.000 1、＜0.000 1）（圖1）。
圖1
對照組、模型組、NBP組細胞生存力比較。*P＜0.05，**P＜0.000 1
光學顯微鏡觀察發現，對照組RPE細胞呈多角形排列，可見邊界清晰細胞質。模型組可見細胞數量明顯減少，細胞質著染色深及細胞皺縮明顯。NBP組可見介于上述兩者間的細胞形態，其細胞數量較對照組少，但較NBP組增多；細胞核較對照組略小，但較模型組增大且細胞漿多（圖2）。
圖2
RPE細胞光學顯微鏡像。2A示對照組；2B示模型組；2C示NBP組。對照組RPE細胞呈多角形排列，可見邊界清晰細胞質；模型組可見細胞數量明顯減少，細胞質染色深及細胞皺縮明顯；NBP組可見介于上述兩者間的細胞形態 HE 標尺：100 μm
熒光顯微鏡觀察發現，對照組細胞核呈圓形，染色均一。模型組細胞核表現為致密濃染，皺縮變小或呈碎塊狀，可見熒光增強的亮點、半月形等形態不一的細胞核，為細胞核固縮及分裂。NBP組部分細胞核呈新月狀，且細胞核碎裂減少（圖3）。對照組、模型組、NBP組凋亡細胞核數分別為（1.33±1.25）、（15.00±2.94）、（8.33±1.25）個。NBP組凋亡細胞核數較對照組明顯增多（t=6.045，P=0.003 8），較模型組明顯降低（t=5.612，P=0.005 0），差異均有統計學意義。
圖3
RPE細胞熒光顯微鏡像。3A示對照組；3B示模型組；3C示NBP組。對照組RPE細胞核染色一致，形態完整；模型組可見細胞核濃縮固縮、碎裂，熒光著染增強；NBP組可見少數細胞核呈新月狀且細胞核碎裂減少，其余細胞染色均勻 Hoechst33258染色 標尺：100 μm
JC-1法檢測結果顯示，對照組、模型組、NBP組聚合物形成的紅色熒光無明顯差異，而模型組可見綠色熒光明顯增強，NBP組無特別強烈增強的綠色熒光（圖4）。對照組、模型組、NBP組細胞的綠色熒光密度分別為2 777.65±1 367.13、16 321.87±6 518.96、9 517.38±2 994.68。NBP組細胞的綠色熒光密度較對照組明顯增加（t=8.180，P＜0.000 1），較模型組明顯降低（t=8.236，P＜0.000 1），差異均有統計學意義。
圖4
RPE細胞熒光顯微鏡像。4A~4C分別示對照組、模型組、NBP組單體；4D~4F分別示對照組、模型組、NBP組聚合物；4G~4I分別示對照組、模型組、NBP組合成圖像。可見3組聚合物形成的紅色熒光無明顯差異；而模型組可見綠色熒光明顯增強，大量細胞呈早期凋亡征；NBP組無特別強烈增強的綠色熒光 JC-1染色 標尺：100 μm
DCFH-DA染色觀察發現，模型組細胞的綠色熒光明顯增多，而NBP組細胞的綠色熒光明顯較模型組降低（圖5）。對照組、模型組、NBP組細胞的ROS表達分別為5 430.36±3 008.58、27 712.73±18 408.36、15 718.63±7 843.46。NBP組細胞的ROS表達較對照組明顯增強（t=6.517，P＜0.000 1），較模型組明顯降低（t=66.278，P＜0.000 1），差異均有統計學意義。
圖5
對照組、模型組、治療組細胞ROS表達熒光顯微鏡像。5A~5C分別示對照組、模型組、NBP組。與對照組及NBP組比較，模型組強綠色熒光著染 DCFH-DA染色 標尺：100 μm
免疫熒光染色觀察發現，NBP組細胞的HO-1熒光強度較對照組明顯增高（圖6）。半定量分析結果顯示，對照組、模型組、NBP組細胞的HO-1熒光強度分別為10 901.33±2 683.18、322 211.67±42 772.26；NBP組與對照組細胞的HO-1熒光強度比較，差異有統計學意義（t=10.270，P=0.000 5）。
圖6
RPE細胞HO-1免疫熒光染色像。6A示對照組；6B示NBP組。NBP組細胞的HO-1熒光強度較對照組明顯增高 免疫熒光染色 標尺：100 μm
Western blot檢測結果顯示，NBP以時間依賴性的方式上調HO-1的表達水平。在NBP作用的不同時間點（0、4、8、12 h），HO-1相對表達量依次為0.37±0.01、0.84±0.06、0.96±0.05、1.00±0.02。NBP作用4、8、12 h時HO-1相對表達量較0 h時呈明確升高趨勢，差異有統計學意義（F=164.91，P＜0.05）（圖7）。
圖7
NBP不同作用時間下HO-1表達Western blot檢測像。7A示電泳圖，泳道1~4分別表示NBP作用時間0、2、4、12 h；7B示不同作用時間HO-1蛋白相對表達量比較。*P＜0.05
3 討論
NBP可通過抑制黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶反應系統中超氧陰離子自由基的形成，增加超氧化物歧化酶的含量，以此增加自由基的清除，達到抗自由基的目的，從而對機體細胞、器官發揮一定的保護作用[13-14]。如，NBP可減輕阿爾茲海默病模型動物腦內氧化應激刺激，減輕學習記憶障礙[15]；對于肌萎縮側索硬化癥模型動物，口服NBP可顯著改善運動功能及延長存活時間，并延緩運動神經元的損失[16]；而在雙側頸總動脈閉塞動物模型中，NBP處理組空間學習記憶障礙得到明顯改善，且海馬區缺陷也得到緩解[17]；不僅如此，在急性心肌梗死模型中NBP的作用亦令人鼓舞，不僅可以保護心肌，亦能減輕左心室纖維化，改善左心室功能及減少室性心律失常[18]。目前NBP在眼科領域的應用研究工作方興未艾。有研究發現，在糖尿病大鼠模型中NBP的干預可通過增強NF-E2相關因子2（Nrf2）、Trx和H2O2酶的表達，控制氧化應激的反應，同時延緩糖尿病性白內障的發生發展[7, 19]。但目前針對眼底視網膜疾病方面尚鮮有NBP作用的相關報道。
RPE具有吞噬光感受器外節段，合成及分泌多種生長因子及清除自由基等功能，在維持細胞內外的代謝平衡以及確保視網膜光感受器正常功能等方面發揮至關重要的作用[20-21]。本課題組既往研究發現，H2O2刺激的RPE氧化應激細胞模型中，細胞內出現大量ROS堆積，進而表現為RPE細胞的功能紊亂甚至凋亡[22]。并且我們還發現，NBP可通過抑制ROS的產生緩解H2O2誘導的人視網膜Müller細胞凋亡[23]。因此，本實驗選擇經典的H2O2刺激來復制體外氧化應激誘導模型，觀察NBP對于氧化應激損傷RPE細胞的保護作用。結果顯示，NBP組細胞生存力提高，凋亡細胞核數量減少，氧化應激產物產量降低。這提示NBP可以對抗氧自由基產生及減輕堆積，提高細胞自身抗氧化應激能力來緩解氧化損傷。
為初步了解NBP抑制H2O2誘導的RPE細胞凋亡的分子機制，我們運用了DCFH-DA探針對RPE細胞內ROS的表達進行了檢測。DCFH-DA探針本身不具有任何熒光，且具有自由穿梭細胞膜的特性，在細胞中可被脂酶水解成為DCFH-DA，此變化使其無法自由穿梭細胞膜而被迫固定于細胞內，受ROS的影響，DCFH-DA氧化呈現綠色熒光，且熒光強度與細胞內ROS濃度成正比。我們發現，H2O2處理可誘導綠色熒光明顯增強，表明細胞內確實有ROS與DCFH-DA反應；而NBP組能夠見到綠色熒光強度明顯減弱。由此可見，H2O2刺激后RPE細胞的ROS水平明顯增高，而加入NBP后ROS水平顯著下降。換言之，NBP能夠在RPE細胞面對H2O2氧化應激刺激時，減少ROS的生成及堆積，從而減輕RPE細胞的損傷，發揮一定的保護作用。
氧化應激是指機體內氧化系統與抗氧化體系之間失穩態，進而引發組織損傷的病理反應。HO-1是機體抗氧化系統的重要組成部分，作為Nrf2的下游基因，其具有抗炎、抗氧化及抗細胞凋亡等作用[24-25]。本研究結果顯示，NBP不僅可以上調HO-1的表達，而且NBP對HO-1的表達調控還具有時間的依賴性，即伴隨NBP的作用時間延長，其對HO-1的上調作用隨之提高。由此可見，NBP通過促進HO-1的表達，可有效拮抗H2O2誘導的細胞損傷。
本研究結果表明，NBP通過上調HO-1的表達來減少ROS堆積，從而緩解H2O2導致的RPE細胞凋亡。這為NBP今后應用于眼部缺血性視網膜疾病的預防和治療提供了有力的實驗室依據。
