視網膜退行性病變主要包括老年性黃斑變性、視網膜色素變性、Stargardt病等。雖然其表現形式略有差異，但其發病機制均為光感受器細胞和（或）視網膜色素上皮（RPE）細胞損傷變性。因視網膜光感受器細胞和RPE細胞缺乏自我修復和更新的能力，細胞替代療法成為治療該類疾病積極有效的方法之一。目前用于治療視網膜退行性病變的干細胞有胚胎干細胞（ESC）和多種成體干細胞，如視網膜干細胞（RSC）、誘導多能干細胞（iPSC）、間充質干細胞（MSC）等。了解目前ESC、iPSC、RSC、MSC相關基礎和臨床應用進展，可為視網膜退行性病變治療提供全新的思路。
引用本文： 孫娜, 谷平, 計菁. 干細胞移植治療視網膜退行性病變的研究進展. 中華眼底病雜志, 2018, 34(6): 613-617. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.06.021 復制
視網膜退行性病變主要包括視網膜色素變性（RP）、老年性黃斑變性（AMD）、Stargardt病等[1]。雖然分類不同，但其發病機制均是與光感受器細胞和（或）視網膜色素上皮（RPE）細胞丟失有關。因光感受器細胞和RPE缺乏自我修復和更新的能力，所以細胞替代療法成為治療該類疾病積極有效的方法之一。干細胞因具有自我更新、高度增生、多向分化的潛能，成為視網膜退行性病變細胞替代療法的研究熱點。本文就視網膜退行性病變中常用的視網膜干細胞（RSC）、胚胎干細胞（ESC）、誘導多能干細胞（iPSC）、間充質干細胞（MSC）的相關研究進展作一綜述。
1 干細胞移植治療研究
1.1 RSC的移植治療
RSC是一種在激活后可以增生分化為所有視網膜神經元細胞和膠質細胞的干細胞，主要分布于睫狀邊緣帶（CMZ）和RPE。有研究證實大鼠、雞和兔的CMZ中含有RSC。Tropepe等[2]、Coles等[3]首次提出成人CMZ處睫狀體上皮細胞（CE）是產生RSC的干細胞群體。Coles等[3]將CE來源的RSC注射到雞眼中，檢測到神經外胚層標記物巢蛋白的表達；其后又將RSC注射到小鼠眼中，發現RSC在不同發育時間整合到不同神經元層次，其中視網膜神經節細胞（RGC）首先發生整合而光感受器細胞在后期階段發生整合。分析可能與視網膜前體細胞（RPC）發育為視網膜的過程有關，即按照RGC（POU家族轉錄因子Brn3α陽性）、水平細胞（鈣結合蛋白陽性）、視錐細胞[恢復蛋白（Recoverin）陽性]、無長突細胞（轉錄蛋白2α陽性）、雙極細胞[蛋白激酶C（PKC）-α陽性]、視桿細胞[視紫紅質（RHO）陽性]、Müller細胞（細胞內視黃醛結合蛋白陽性）的順序進行。除嚙齒類動物，Klassen等[4]將家豬RSC移植到豬視網膜下腔，發現轉導蛋白、Recoverin和RHO的表達。此結果表明RSC向光感受器細胞分化。Seiler等[5]將貓胚胎視網膜移植到4只埃塞爾比亞貓眼內，通過眼底血管造影、視網膜電圖、蘇木精-伊紅染色檢查，發現4只貓中2只貓眼內植入物和周圍組織發生了整合，但未觀察到功能改善。其原因可能與觀察時間過短有關。RSC衍生的光感受器在形態上與內源性光感受器相似，且與周圍的視網膜神經元形成突觸連接。Li等[6]將鼠RSC植入到Rd 7突變小鼠眼內；其后又將RSC植入到Rd1突變小鼠眼內，結果顯示小鼠視力得到改善。這一結果證實RSC分化而來的細胞不僅在形態學上與光感受器相似，而且能夠發揮生物學功能。
早期臨床試驗分別將孕齡15、17周完整胎兒視網膜移植到一例23歲RP白人男性患者和一例72歲RP白人女性患者的左眼，移植后5、6個月2例患者視力均有所改善[7]。目前，美國食品藥品監督管理局（FDA）授權后使用胎兒組織衍生的RPC進行了Ⅰ/Ⅱa試驗（NCT02320812），同時授權使用視網膜下腔移植RPC治療晚期RP患者的臨床試驗[8]。通過動物實驗及早期臨床試驗的良好的效果，進一步證實使用RSC治療視網膜退行性疾病的可行性，而且研究發現該疾病早期通常只影響光感受器細胞，晚期才影響其他細胞。因此疾病早期神經通路是完整的，而光受器細胞只在一個方向與雙極細胞水平細胞形成連接，所以光感覺器細胞替換后更容易形成突觸連接。
1.2 ESC的移植治療
Ikeda等[9]報道小鼠ESC在Wnt和Nodal拮抗劑存在條件下，可分化為具有光感受器分化能力的神經前體細胞。之后Lamba等[10]研究證實，人ESC（hESC）衍生的視網膜祖細胞能夠和Leber先天性紅斑狼瘡小鼠模型的視網膜結構相互結合，并且可以分化成視網膜神經元。Osakada等[11]也報道猴和hESC均可分化為RSC。猴ESC經過成纖維細胞生長因子（FGF）、牛磺酸、音猬因子（Shh）和視黃酸的組合處理后會促進ESC的增生，在DAPT（γ-分泌酶抑制劑）誘導下光感受器前體細胞向光感受器細胞分化。而hESC在結合Dickkopf-1、LeftyA的胚狀體樣聚集體的無血清漂浮培養下分化成RSC，在含有視黃酸，牛磺酸和N2補充物的無血清培養基條件下可以分化成光感受器細胞[12]。其原因可能是由物種的差異導致兩者所需要的誘導分化的培養基不同。
在基礎研究的基礎上對ESC的研究逐漸向臨床轉化。2010年FDA批準使用ESC來源的RPE細胞治療AMD的Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗，且取得良好治療效果[12-13]。Schwartz等[14]采用hESC來源的RPE細胞移植治療Stargardt病及萎縮型AMD。研究者分別選取1例Stargardt病及萎縮型AMD患者，將hESC-RPE移植到患者視網膜下腔，移植后患者視力均有所提高，隨訪中未發現腫瘤形成、視網膜脫離等并發癥的發生。2014年，研究者又分別選取9例Stargardt病及萎縮型AMD患者進行視網膜下移植治療，結果顯示僅1例患者視力下降；1例患者出現眼內表皮葡萄球菌感染，其余患者未發現眼內感染并發癥[15]。上述結果表明hESC-RPE移植到視網膜退行性病變患者的可行性和安全性。但由于試驗樣本數較少，隨訪時間短且研究對象多為白種人，因此hESC的長期安全性仍有待進一步評估。其后，ESC-RPE細胞移植治療萎縮型AMD的臨床試驗在中國、英國、以色列、韓國等逐漸展開。2015年，韓國學者報道將ESC-RPE移植到4例亞洲人視網膜下腔，其中2例萎縮型AMD患者，2例Stargardt病患者；移植后隨訪觀察1個月，3例患者視力提高，1例患者視力保持不變，且未發現任何移植后并發癥[16]。雖然上述臨床試驗患者較少，但其結果仍證實ESC-RPE治療亞洲患者的視網膜退行性病變的可能性。目前，第三軍醫大學陰正勤團隊通過hESC-RPE細胞移植，治療了3例滲出型AMD患者。該項研究中，3例患者在剝除視網膜下新生血管膜后，將ESC-RPE移植到患者視網膜下腔，移植后隨訪3個月，3例患者視力均有所提高，且未觀察到免疫排斥反應[17]。2017年，國家衛生計生委和國家食品藥品監督管理總局首批備案的干細胞臨床研究項目“人ESC來源的視網膜色素上皮細胞治療干性年齡相關性黃斑變性”在鄭州大學第一附屬醫院啟動，進一步推進ESC-RPE的臨床應用。
1.3 iPSC的移植治療
2006年Takahashi和Yamanaka[18]發現小鼠成纖維細胞經過逆轉錄病毒轉導Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4等4種基因后，可得到能表達ESC等標記基因的一種特殊干細胞，被命名為iPSC。2010年，Lamba等[19]從人成纖維細胞誘導產生iPSC，進而誘導其向RSC及光感受器細胞分化，并將這些細胞移植到正常成年小鼠視網膜下腔，觀察到供體細胞能夠整合到受體視網膜下腔并表達視網膜光感受器細胞標記物。
iPSC的臨床研究近年來也有突破性進展。2014年，Chakradhar[20]首次將iPSC-RPE移植到1例70歲日本女性萎縮型AMD患者視網膜下腔，隨訪觀察1年，患者視力得到改善，且未觀察到任何不良反應。同年Mandai等[21]成功將從人皮膚成纖維細胞誘導的iPSC- RPE移植到1例77歲新生血管性AMD女性患者視網膜下腔；隨訪1年，移植片保持完整且未發現致瘤性表現，患者最佳矯正視力未改善或惡化，僅有VFQ-25（視功能相關生命質量量表）評分得到改善。雖然此項臨床試驗結果顯示應用hiPSC-RPE治療可延緩疾病進展，在改善病情方面療效欠佳，但證實了基于iPSC進行治療的安全性。近期日本學者通過對獼猴和人iPSC-RPE研究，發現移植的獼猴和人iPSC-RPE只要和宿主免疫相匹配，就不會出現免疫排斥反應[22]。這一發現將為今后iPSC-RPE的移植治療起指導作用。
1.4 MSC的移植治療
MSC是來自中胚層的多能干細胞，因其來源廣泛、獲取方便、免疫原性較低、有一定的抗炎及營養神經的作用等，在治療致盲性疾病中具有廣闊的前景。
Chuang等[23]采用熒光定位證明靜脈注射的帶綠色熒光蛋白的骨髓MSC（BMSC）可以治愈損傷的大鼠視網膜，并與宿主視網膜層發生整合。研究表明，遷移到視網膜的BMSC，可以分化為膠質纖維酸性蛋白、RHO、PKC-α、微管結合蛋白2陽性的神經膠質細胞、光感受細胞、雙極細胞、神經元細胞；將Math5轉入BMSC后，其趨向于類RGC方向分化[24]。此外BMSC分泌的神經營養因子如腦源性神經營養因子等可以更好的維持RGC的功能。目前有文獻報道，牙髓間質干細胞（DPSC）用FGF2和Shh處理同時將其接種在三維纖維蛋白水凝膠上，DPSC顯示出類RGC分化的征象，如RGC相關基因和Brn3b蛋白質的表達。Mead等[25]在青光眼動物模型中，經玻璃體下腔注射DPSC與未注射眼和應用BMSC/脂肪間充質干細胞（ADSC）治療眼相比，通過記錄存活的RGC的數量和視網膜電圖的電活動，發現DPSC不僅可以保護RGC免于死亡，而且還能夠保持模型動物良好的視覺功能。其原因可能與DPSC分泌神經營養因子能力高于BMSC/ADSC有關[26]。此外，在視網膜外植體的條件培養基中，DPSC可被誘導分化為RHO陽性的光感受器細胞[27]。目前，對于DPSC研究尚在探索中，DPSC誘導分化為神經元細胞的具體機制尚不清楚，以及誘導分化后的神經元細胞長期是否能夠保持生物學功能等問題仍值得進一步探索。Rahimzadeh等[28]將人PAX6基因轉入ADSC后，發現將ADSC誘導分化為RSC、RPE、光感受器細胞。最近，Amirpour等[29]將ADSC與Wnt、Nodal和BMP4信號通路的抑制劑共培養后，發現除神經元標記物β-TUB Ⅲ高表達外，特定的眼神經外胚層標記物如PAX6、SIX3等也出現升高，且膠質細胞標記物降低，與BMSC和DPSC相同。這一現象與ADSC分泌的細胞因子有密切關系。
目前BMSC治療AMD在巴西等已進入臨床試驗的Ⅰ/Ⅱ期，目前尚未見BMSC治療的任何副作用報道。但Kuriyan等[30]經玻璃體注射ADSC治療萎縮型AMD患者后，3例患者出現視網膜脫離，并且這種不良反應被認為是與干細胞制劑有關而不是醫生操作引起。值得注意的是將骨髓衍生的CD34+細胞（造血干細胞和內皮祖細胞）注射到視網膜色素變性的小鼠模型后，靶向受損的神經元組織和視網膜脈管系統未見相關安全性問題[31-32]。可能與內皮祖細胞分泌的細胞因子選擇性的募集保護性的巨噬細胞有關。Park等[33]經玻璃體腔注射CD34 +細胞用于治療6例視網膜缺血性疾病或視網膜脫離，隨訪6個月受試者沒有眼內炎癥等不良反應。
2 細胞移植治療中的缺陷
2.1 RSC
目前應用RSC主要面臨數量較少、轉化率低以及倫理學問題。解決方案主要有：（1）使用其他干細胞穩定誘導分化為RSC，尋求更多的干細胞的來源。近期有文獻報道，Müller細胞不僅在魚類、小雞、大鼠、猴等具有再生特性，在成年哺乳動物也是內源性的RSC的來源[34-36]。（2）解決轉化率低的問題，主要集中在調節分泌的細胞因子和相關受體等方面，如表皮生長因子（EGF）受體[37]、內源性EGF和FGF2、生長和分化因子11[38]、胰島素樣生長因子1[39]等。近期，Xu等[40]發現RSC可以在未激活神經膠質細胞的作用下分化成神經元樣細胞。在干細胞移植中調節小膠質細胞活性可能會成為促進視網膜修復和干細胞移植成功的潛在方法[41-42]。此外，使用小分子核糖核酸解決移植RSC中增生和分化如22個核苷酸的單鏈非編碼RNA成為近期熱點[43-44]。
2.2 ESC
ESC應用中存在的主要問題是致瘤性、轉化率低、異體干細胞移植帶來的免疫排斥反應；ESC提取會損傷人類的胚胎，而對于胚胎是否是一個完整意義上的人國內外仍有爭議，因此存在著倫理問題；臨床試驗參與人數少、規模小、隨訪觀察時間短且所招募的對象具有一定地域性和種族性等問題。針對上訴問題的解決方案有：（1）通過在不破壞ESC的情況下生產出ESC，如卵裂球的提取，生物制品及最近新興的3D打印技術[45]。（2）通過微小核糖核酸調節ESC的增生和分化，如對let-7家族的研究等[46]。（3）通過調節視網膜下微環境實現對ESC分化的調節[47]。（4）生物可降解支架為ESC分化為視網膜細胞提供條件[48]，并且可作為一種運載工具將細胞遞送至視網膜下腔。（5）轉入自殺基因可降低致瘤性，但安全性有待評估。
2.3 iPSC
雖然iPSC不存在倫理問題，但在使用iPSC時仍存在以下一些問題：培養周期長、消耗時間多、費用高；誘導分化借助于病毒，尚缺乏一定安全性；通過基因重編程向神經外胚層轉化，難度大且效率低。針對上述存在的問題，目前可選擇的解決方案有：（1）通過新興3D打印技術，如雙光子聚合生產iPSC-RPE進行移植治療，可以滿足移植治療細胞數目的要求。但是值得一提的是由于視網膜結構復雜，打印出的視網膜細胞必須能形成突觸連接[49]，以確保視覺信息在視網膜中的傳播。（2）iPSC來源的RGC在可降解的生物多聚物材料構成的支架已經實現形成突觸連接[50]，將為其他視網膜細胞與材料結合提供基礎，也將會成為未來研究的一個重點方向。
2.4 MSC
MSC在實際應用中的局限性主要集中在： MSC的主要作用機制似乎是旁分泌營養效應而不是直接細胞替換；MSC進行多系分化，效率較低；收獲的MSC是具有異質性的混合干細胞；雖然國際細胞療法協會（ISCT）建立了鑒定MSC的標準，但僅通過CD105、CD73和CD90進行鑒定仍舊欠缺特異性；部分臨床前試驗發現移植MSC后會出現視網膜脫離等并發癥。針對上訴問題我們歸納出的一些處理方法：（1）繼續探究MSC多系分化的具體信號通路，進一步明確分子機制，以便誘導其向特定的細胞分化。（2）尋找MSC特定的標記物，增加獲取的細胞的純度。（3）靜脈注射MSC易阻塞到毛細血管床，玻璃體注射和視網膜下腔注射逐步完善將有望降低治療后并發癥。
3 展望
雖然在使用干細胞治療視網膜退行性病變仍舊面臨著諸多問題，首先種子細胞（如RSC）的來源較少，取材受限；其次移植到宿主的干細胞（如ESC）可能存在免疫排斥，同時細胞內環境的改變也會使細胞存活率降低；此外，移植后存活的細胞是否能與周圍組織發生整合，整合的細胞是否能定向分化為特定的神經元細胞，分化的神經元細胞如何快速準確的鑒定以及鑒定出的神經元細胞是否能真正地行使功能等問題仍舊困擾著科研工作者們。隨著多學科交叉合作，干細胞方向人才的培養，結合生物醫學、分子生物學、3D打印技術及支架材料的迅猛發展，相信找到一種切實可行的批量生產干細胞的技術指日可待，干細胞技術解決視網膜退行性疾病這一愿景也將在不遠的未來實現。
視網膜退行性病變主要包括視網膜色素變性（RP）、老年性黃斑變性（AMD）、Stargardt病等[1]。雖然分類不同，但其發病機制均是與光感受器細胞和（或）視網膜色素上皮（RPE）細胞丟失有關。因光感受器細胞和RPE缺乏自我修復和更新的能力，所以細胞替代療法成為治療該類疾病積極有效的方法之一。干細胞因具有自我更新、高度增生、多向分化的潛能，成為視網膜退行性病變細胞替代療法的研究熱點。本文就視網膜退行性病變中常用的視網膜干細胞（RSC）、胚胎干細胞（ESC）、誘導多能干細胞（iPSC）、間充質干細胞（MSC）的相關研究進展作一綜述。
1 干細胞移植治療研究
1.1 RSC的移植治療
RSC是一種在激活后可以增生分化為所有視網膜神經元細胞和膠質細胞的干細胞，主要分布于睫狀邊緣帶（CMZ）和RPE。有研究證實大鼠、雞和兔的CMZ中含有RSC。Tropepe等[2]、Coles等[3]首次提出成人CMZ處睫狀體上皮細胞（CE）是產生RSC的干細胞群體。Coles等[3]將CE來源的RSC注射到雞眼中，檢測到神經外胚層標記物巢蛋白的表達；其后又將RSC注射到小鼠眼中，發現RSC在不同發育時間整合到不同神經元層次，其中視網膜神經節細胞（RGC）首先發生整合而光感受器細胞在后期階段發生整合。分析可能與視網膜前體細胞（RPC）發育為視網膜的過程有關，即按照RGC（POU家族轉錄因子Brn3α陽性）、水平細胞（鈣結合蛋白陽性）、視錐細胞[恢復蛋白（Recoverin）陽性]、無長突細胞（轉錄蛋白2α陽性）、雙極細胞[蛋白激酶C（PKC）-α陽性]、視桿細胞[視紫紅質（RHO）陽性]、Müller細胞（細胞內視黃醛結合蛋白陽性）的順序進行。除嚙齒類動物，Klassen等[4]將家豬RSC移植到豬視網膜下腔，發現轉導蛋白、Recoverin和RHO的表達。此結果表明RSC向光感受器細胞分化。Seiler等[5]將貓胚胎視網膜移植到4只埃塞爾比亞貓眼內，通過眼底血管造影、視網膜電圖、蘇木精-伊紅染色檢查，發現4只貓中2只貓眼內植入物和周圍組織發生了整合，但未觀察到功能改善。其原因可能與觀察時間過短有關。RSC衍生的光感受器在形態上與內源性光感受器相似，且與周圍的視網膜神經元形成突觸連接。Li等[6]將鼠RSC植入到Rd 7突變小鼠眼內；其后又將RSC植入到Rd1突變小鼠眼內，結果顯示小鼠視力得到改善。這一結果證實RSC分化而來的細胞不僅在形態學上與光感受器相似，而且能夠發揮生物學功能。
早期臨床試驗分別將孕齡15、17周完整胎兒視網膜移植到一例23歲RP白人男性患者和一例72歲RP白人女性患者的左眼，移植后5、6個月2例患者視力均有所改善[7]。目前，美國食品藥品監督管理局（FDA）授權后使用胎兒組織衍生的RPC進行了Ⅰ/Ⅱa試驗（NCT02320812），同時授權使用視網膜下腔移植RPC治療晚期RP患者的臨床試驗[8]。通過動物實驗及早期臨床試驗的良好的效果，進一步證實使用RSC治療視網膜退行性疾病的可行性，而且研究發現該疾病早期通常只影響光感受器細胞，晚期才影響其他細胞。因此疾病早期神經通路是完整的，而光受器細胞只在一個方向與雙極細胞水平細胞形成連接，所以光感覺器細胞替換后更容易形成突觸連接。
1.2 ESC的移植治療
Ikeda等[9]報道小鼠ESC在Wnt和Nodal拮抗劑存在條件下，可分化為具有光感受器分化能力的神經前體細胞。之后Lamba等[10]研究證實，人ESC（hESC）衍生的視網膜祖細胞能夠和Leber先天性紅斑狼瘡小鼠模型的視網膜結構相互結合，并且可以分化成視網膜神經元。Osakada等[11]也報道猴和hESC均可分化為RSC。猴ESC經過成纖維細胞生長因子（FGF）、牛磺酸、音猬因子（Shh）和視黃酸的組合處理后會促進ESC的增生，在DAPT（γ-分泌酶抑制劑）誘導下光感受器前體細胞向光感受器細胞分化。而hESC在結合Dickkopf-1、LeftyA的胚狀體樣聚集體的無血清漂浮培養下分化成RSC，在含有視黃酸，牛磺酸和N2補充物的無血清培養基條件下可以分化成光感受器細胞[12]。其原因可能是由物種的差異導致兩者所需要的誘導分化的培養基不同。
在基礎研究的基礎上對ESC的研究逐漸向臨床轉化。2010年FDA批準使用ESC來源的RPE細胞治療AMD的Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗，且取得良好治療效果[12-13]。Schwartz等[14]采用hESC來源的RPE細胞移植治療Stargardt病及萎縮型AMD。研究者分別選取1例Stargardt病及萎縮型AMD患者，將hESC-RPE移植到患者視網膜下腔，移植后患者視力均有所提高，隨訪中未發現腫瘤形成、視網膜脫離等并發癥的發生。2014年，研究者又分別選取9例Stargardt病及萎縮型AMD患者進行視網膜下移植治療，結果顯示僅1例患者視力下降；1例患者出現眼內表皮葡萄球菌感染，其余患者未發現眼內感染并發癥[15]。上述結果表明hESC-RPE移植到視網膜退行性病變患者的可行性和安全性。但由于試驗樣本數較少，隨訪時間短且研究對象多為白種人，因此hESC的長期安全性仍有待進一步評估。其后，ESC-RPE細胞移植治療萎縮型AMD的臨床試驗在中國、英國、以色列、韓國等逐漸展開。2015年，韓國學者報道將ESC-RPE移植到4例亞洲人視網膜下腔，其中2例萎縮型AMD患者，2例Stargardt病患者；移植后隨訪觀察1個月，3例患者視力提高，1例患者視力保持不變，且未發現任何移植后并發癥[16]。雖然上述臨床試驗患者較少，但其結果仍證實ESC-RPE治療亞洲患者的視網膜退行性病變的可能性。目前，第三軍醫大學陰正勤團隊通過hESC-RPE細胞移植，治療了3例滲出型AMD患者。該項研究中，3例患者在剝除視網膜下新生血管膜后，將ESC-RPE移植到患者視網膜下腔，移植后隨訪3個月，3例患者視力均有所提高，且未觀察到免疫排斥反應[17]。2017年，國家衛生計生委和國家食品藥品監督管理總局首批備案的干細胞臨床研究項目“人ESC來源的視網膜色素上皮細胞治療干性年齡相關性黃斑變性”在鄭州大學第一附屬醫院啟動，進一步推進ESC-RPE的臨床應用。
1.3 iPSC的移植治療
2006年Takahashi和Yamanaka[18]發現小鼠成纖維細胞經過逆轉錄病毒轉導Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4等4種基因后，可得到能表達ESC等標記基因的一種特殊干細胞，被命名為iPSC。2010年，Lamba等[19]從人成纖維細胞誘導產生iPSC，進而誘導其向RSC及光感受器細胞分化，并將這些細胞移植到正常成年小鼠視網膜下腔，觀察到供體細胞能夠整合到受體視網膜下腔并表達視網膜光感受器細胞標記物。
iPSC的臨床研究近年來也有突破性進展。2014年，Chakradhar[20]首次將iPSC-RPE移植到1例70歲日本女性萎縮型AMD患者視網膜下腔，隨訪觀察1年，患者視力得到改善，且未觀察到任何不良反應。同年Mandai等[21]成功將從人皮膚成纖維細胞誘導的iPSC- RPE移植到1例77歲新生血管性AMD女性患者視網膜下腔；隨訪1年，移植片保持完整且未發現致瘤性表現，患者最佳矯正視力未改善或惡化，僅有VFQ-25（視功能相關生命質量量表）評分得到改善。雖然此項臨床試驗結果顯示應用hiPSC-RPE治療可延緩疾病進展，在改善病情方面療效欠佳，但證實了基于iPSC進行治療的安全性。近期日本學者通過對獼猴和人iPSC-RPE研究，發現移植的獼猴和人iPSC-RPE只要和宿主免疫相匹配，就不會出現免疫排斥反應[22]。這一發現將為今后iPSC-RPE的移植治療起指導作用。
1.4 MSC的移植治療
MSC是來自中胚層的多能干細胞，因其來源廣泛、獲取方便、免疫原性較低、有一定的抗炎及營養神經的作用等，在治療致盲性疾病中具有廣闊的前景。
Chuang等[23]采用熒光定位證明靜脈注射的帶綠色熒光蛋白的骨髓MSC（BMSC）可以治愈損傷的大鼠視網膜，并與宿主視網膜層發生整合。研究表明，遷移到視網膜的BMSC，可以分化為膠質纖維酸性蛋白、RHO、PKC-α、微管結合蛋白2陽性的神經膠質細胞、光感受細胞、雙極細胞、神經元細胞；將Math5轉入BMSC后，其趨向于類RGC方向分化[24]。此外BMSC分泌的神經營養因子如腦源性神經營養因子等可以更好的維持RGC的功能。目前有文獻報道，牙髓間質干細胞（DPSC）用FGF2和Shh處理同時將其接種在三維纖維蛋白水凝膠上，DPSC顯示出類RGC分化的征象，如RGC相關基因和Brn3b蛋白質的表達。Mead等[25]在青光眼動物模型中，經玻璃體下腔注射DPSC與未注射眼和應用BMSC/脂肪間充質干細胞（ADSC）治療眼相比，通過記錄存活的RGC的數量和視網膜電圖的電活動，發現DPSC不僅可以保護RGC免于死亡，而且還能夠保持模型動物良好的視覺功能。其原因可能與DPSC分泌神經營養因子能力高于BMSC/ADSC有關[26]。此外，在視網膜外植體的條件培養基中，DPSC可被誘導分化為RHO陽性的光感受器細胞[27]。目前，對于DPSC研究尚在探索中，DPSC誘導分化為神經元細胞的具體機制尚不清楚，以及誘導分化后的神經元細胞長期是否能夠保持生物學功能等問題仍值得進一步探索。Rahimzadeh等[28]將人PAX6基因轉入ADSC后，發現將ADSC誘導分化為RSC、RPE、光感受器細胞。最近，Amirpour等[29]將ADSC與Wnt、Nodal和BMP4信號通路的抑制劑共培養后，發現除神經元標記物β-TUB Ⅲ高表達外，特定的眼神經外胚層標記物如PAX6、SIX3等也出現升高，且膠質細胞標記物降低，與BMSC和DPSC相同。這一現象與ADSC分泌的細胞因子有密切關系。
目前BMSC治療AMD在巴西等已進入臨床試驗的Ⅰ/Ⅱ期，目前尚未見BMSC治療的任何副作用報道。但Kuriyan等[30]經玻璃體注射ADSC治療萎縮型AMD患者后，3例患者出現視網膜脫離，并且這種不良反應被認為是與干細胞制劑有關而不是醫生操作引起。值得注意的是將骨髓衍生的CD34+細胞（造血干細胞和內皮祖細胞）注射到視網膜色素變性的小鼠模型后，靶向受損的神經元組織和視網膜脈管系統未見相關安全性問題[31-32]。可能與內皮祖細胞分泌的細胞因子選擇性的募集保護性的巨噬細胞有關。Park等[33]經玻璃體腔注射CD34 +細胞用于治療6例視網膜缺血性疾病或視網膜脫離，隨訪6個月受試者沒有眼內炎癥等不良反應。
2 細胞移植治療中的缺陷
2.1 RSC
目前應用RSC主要面臨數量較少、轉化率低以及倫理學問題。解決方案主要有：（1）使用其他干細胞穩定誘導分化為RSC，尋求更多的干細胞的來源。近期有文獻報道，Müller細胞不僅在魚類、小雞、大鼠、猴等具有再生特性，在成年哺乳動物也是內源性的RSC的來源[34-36]。（2）解決轉化率低的問題，主要集中在調節分泌的細胞因子和相關受體等方面，如表皮生長因子（EGF）受體[37]、內源性EGF和FGF2、生長和分化因子11[38]、胰島素樣生長因子1[39]等。近期，Xu等[40]發現RSC可以在未激活神經膠質細胞的作用下分化成神經元樣細胞。在干細胞移植中調節小膠質細胞活性可能會成為促進視網膜修復和干細胞移植成功的潛在方法[41-42]。此外，使用小分子核糖核酸解決移植RSC中增生和分化如22個核苷酸的單鏈非編碼RNA成為近期熱點[43-44]。
2.2 ESC
ESC應用中存在的主要問題是致瘤性、轉化率低、異體干細胞移植帶來的免疫排斥反應；ESC提取會損傷人類的胚胎，而對于胚胎是否是一個完整意義上的人國內外仍有爭議，因此存在著倫理問題；臨床試驗參與人數少、規模小、隨訪觀察時間短且所招募的對象具有一定地域性和種族性等問題。針對上訴問題的解決方案有：（1）通過在不破壞ESC的情況下生產出ESC，如卵裂球的提取，生物制品及最近新興的3D打印技術[45]。（2）通過微小核糖核酸調節ESC的增生和分化，如對let-7家族的研究等[46]。（3）通過調節視網膜下微環境實現對ESC分化的調節[47]。（4）生物可降解支架為ESC分化為視網膜細胞提供條件[48]，并且可作為一種運載工具將細胞遞送至視網膜下腔。（5）轉入自殺基因可降低致瘤性，但安全性有待評估。
2.3 iPSC
雖然iPSC不存在倫理問題，但在使用iPSC時仍存在以下一些問題：培養周期長、消耗時間多、費用高；誘導分化借助于病毒，尚缺乏一定安全性；通過基因重編程向神經外胚層轉化，難度大且效率低。針對上述存在的問題，目前可選擇的解決方案有：（1）通過新興3D打印技術，如雙光子聚合生產iPSC-RPE進行移植治療，可以滿足移植治療細胞數目的要求。但是值得一提的是由于視網膜結構復雜，打印出的視網膜細胞必須能形成突觸連接[49]，以確保視覺信息在視網膜中的傳播。（2）iPSC來源的RGC在可降解的生物多聚物材料構成的支架已經實現形成突觸連接[50]，將為其他視網膜細胞與材料結合提供基礎，也將會成為未來研究的一個重點方向。
2.4 MSC
MSC在實際應用中的局限性主要集中在： MSC的主要作用機制似乎是旁分泌營養效應而不是直接細胞替換；MSC進行多系分化，效率較低；收獲的MSC是具有異質性的混合干細胞；雖然國際細胞療法協會（ISCT）建立了鑒定MSC的標準，但僅通過CD105、CD73和CD90進行鑒定仍舊欠缺特異性；部分臨床前試驗發現移植MSC后會出現視網膜脫離等并發癥。針對上訴問題我們歸納出的一些處理方法：（1）繼續探究MSC多系分化的具體信號通路，進一步明確分子機制，以便誘導其向特定的細胞分化。（2）尋找MSC特定的標記物，增加獲取的細胞的純度。（3）靜脈注射MSC易阻塞到毛細血管床，玻璃體注射和視網膜下腔注射逐步完善將有望降低治療后并發癥。
3 展望
雖然在使用干細胞治療視網膜退行性病變仍舊面臨著諸多問題，首先種子細胞（如RSC）的來源較少，取材受限；其次移植到宿主的干細胞（如ESC）可能存在免疫排斥，同時細胞內環境的改變也會使細胞存活率降低；此外，移植后存活的細胞是否能與周圍組織發生整合，整合的細胞是否能定向分化為特定的神經元細胞，分化的神經元細胞如何快速準確的鑒定以及鑒定出的神經元細胞是否能真正地行使功能等問題仍舊困擾著科研工作者們。隨著多學科交叉合作，干細胞方向人才的培養，結合生物醫學、分子生物學、3D打印技術及支架材料的迅猛發展，相信找到一種切實可行的批量生產干細胞的技術指日可待，干細胞技術解決視網膜退行性疾病這一愿景也將在不遠的未來實現。