視網膜色素變性（RP）是一種嚴重影響視力的疾病，主要累及視桿細胞從而導致夜盲，疾病終末期由于視錐細胞同時受累造成患者中心視力和周邊視力喪失，目前尚無有效治療手段。但有研究發現，在RP病理過程中雖然喪失了光感受器的功能，雙極細胞和神經節細胞的功能以及與視覺中樞的神經連接卻得以保存，為光遺傳學在其治療上的應用提供了條件。光遺傳學通過在神經元上表達以視紫紅質離子通道蛋白-2為代表的光敏蛋白，控制神經元興奮性，在重塑視網膜感光功能方面表現出了極大的應用前景，也為RP這一類視網膜變性疾病的治療提供了一種有效的治療選擇。
引用本文： 張軼, 黃熙, 張軍軍. 光遺傳學在視網膜色素變性治療中的研究進展. 中華眼底病雜志, 2018, 34(6): 601-604. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.06.018 復制
視網膜色素變性（RP）是一類嚴重影響視力的視網膜變性疾病，可引起光感受器不可逆性進行性死亡。目前針對RP尚無有效治療手段。光遺傳學是一項結合光學和遺傳學相關知識，利用基因編碼光敏蛋白并通過光控制細胞興奮性的技術，目前主要用于神經元研究。視紫紅質離子通道蛋白-2（ChR2）是其中極為重要的一種光敏蛋白。視網膜作為中樞神經系統的一部分，具有三級神經元結構，在RP的病理過程中雖然喪失了光感受器功能，但是雙極細胞和視網膜神經節細胞（RGC）的功能以及與視覺中樞的神經連接卻得以保存。基于此，近年來研究者們陸續發現ChR2等光敏蛋白在RP治療中的應用前景。現就視網膜神經元的功能、RP以及光遺傳學在RP治療中的應用情況作一簡要綜述。
1 視網膜神經元的構成和功能
哺乳動物的視網膜作為中樞神經系統的一部分，由5類不少于60種不同神經元和一類神經膠質細胞組成。光感受器接收光刺激，激活視紫紅質后啟動G蛋白偶聯受體，進一步激活下游酶鏈反應，將輸入光信號轉換為輸出電信號并傳導至RGC，由RGC將來自雙極細胞和無長突細胞的信號整合編譯成大約20種不同的信號傳遞至視皮層[1]。其中，雙極細胞分為視錐雙極細胞和視桿雙極細胞，視錐雙極細胞分為ON和OFF兩種類型。水平細胞和無長突細胞主要起抑制性調節作用[2]。
視覺信號的傳遞主要依靠神經遞質，視網膜對視覺信號的處理起源于光感受器，其突觸末端釋放興奮性神經遞質谷氨酸。在視錐細胞信號傳導通路中，視錐細胞與兩種水平細胞和8種視錐雙極細胞形成突觸連接，這些視錐細胞的突觸后細胞表達不同類型的谷氨酸受體[2-4]。水平細胞和OFF視錐雙極細胞表達親離子型谷氨酸受體（AMPA＜á-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionicacid＞和kainate），與谷氨酸結合后陽離子通道開放；ON視錐雙極細胞表達親代謝型谷氨酸受體（mGluR6），與谷氨酸結合后陽離子通道TRPM1關閉[5]。由于光刺激時視錐細胞超極化造成谷氨酸釋放減少，水平細胞和OFF視錐雙極細胞的陽離子通道開放減少，導致細胞超極化即細胞功能抑制；而ON視錐雙極細胞的陽離子通道開放增加導致去極化，即細胞興奮[6-7]。最后的結果是，OFF-RGC接受來自OFF視錐雙極細胞的信號減少，即光刺激下OFF-RGC功能被抑制；而ON-RGC接受來自ON視錐雙極細胞的信號增加，即光刺激下ON-RGC細胞興奮。從功能學角度看，暗刺激引起OFF-RGC興奮，而光刺激引起ON-RGC興奮。
類似于視錐細胞，視桿細胞也釋放神經遞質谷氨酸，在光刺激下出現超極化，谷氨酸釋放減少。視桿細胞的突觸后細胞為水平細胞和視桿雙極細胞，水平細胞表達親離子型谷氨酸受體，而視桿雙極細胞表達mGluR6并在光刺激情況下去極化[8-9]。然而視桿雙極細胞并非直接將信號傳導至RGC，而是通過谷氨酸能神經突觸傳導至AⅡ無長突細胞[10-11]。AⅡ無長突細胞通過縫隙連接與ON視錐雙極細胞的軸突發生連接，并與OFF視錐雙極細胞形成抑制性（甘氨酸能）突觸連接，通過這些視錐雙極細胞將信號傳導至相應RGC[2]。
2 RP
視網膜變性疾病的一個共同特征是光感受器的進行性死亡，其中RP是一種最常見的視網膜遺傳病，通常雙眼發病，其基因突變導致的損傷主要累及視桿細胞，從而造成夜盲。隨著疾病進展，變性的細胞由視網膜周邊部向視網膜后極部發展，從而殘留管狀視野，疾病終末期由于視錐細胞同時受累造成患者中心視力和周邊視力均喪失[12]。目前已經發現超過50種基因的100個位點與RP相關，其中約20%為常染色體隱性遺傳，10%～20%為常染色體顯性遺傳，還有10%為X連鎖隱性遺傳，其余為無家族史的散發病例[13]。目前RP尚無法治愈，但是一些治療方法已經進入試驗階段。第一類方法為基因替代治療，針對Leber先天性黑矇進行的基因研究進展[14] 為RP基因治療提供了一個很好的借鑒；第二類方法致力于減緩光感受器變性從而減緩病情的發展；第三類方法旨在通過建立新的光感受器細胞重塑視網膜功能。在這三類方法中，基因治療是最理想的方法。但RP是一種多基因致病的疾病，目前已經檢測到超過50種基因的3000種突變可以致病[15]。同時，疾病后期視錐細胞同樣受累，而基因治療尚無法解決如此龐大的基因問題以及視錐細胞受累的問題。一種更具有可實施性的治療手段是利用光遺傳學，即通過在變性的視網膜上表達光敏蛋白重建視網膜的感光功能。這種光敏蛋白必須能夠獨立且直接地將光信號轉化為電信號，而不依賴于其他信號通路。ChR2就是這樣一種光敏蛋白。
3 光遺傳學和ChR2
廣義上來講，光遺傳學是指一種將表達光敏蛋白的基因編碼至靶神經元，通過光刺激控制這些靶細胞激活的方法[16]。光敏蛋白在靶細胞的主要表達方式包括以病毒為載體進行轉染和轉基因小鼠。該技術涉及的光敏蛋白主要包括兩類：微生物視蛋白和動物視蛋白。有脊椎動物和無脊椎動物的光反應過程具有明顯區別，雖然都使用視紫紅質這種由視黃醛與7次跨膜的螺旋形視蛋白共價結合的蛋白，但對于有脊椎動物，光刺激激活視紫紅質后啟動G蛋白偶聯受體激活下游酶鏈反應，導致環磷酸鳥苷（cGMP）水解和cGMP門控陽離子通道關閉，最終細胞超級化[17]。無脊椎動物雖然也使用G蛋白偶聯受體，但在光刺激下直接導致瞬時受體電勢通道的激活和細胞快速的去極化[18]。ChR是一種微生物視蛋白，同樣屬于光敏離子通道蛋白，最初從綠藻中分離而來，介導其趨光性[19-20]。ChR2是其中一種ChR的亞型，同樣具有7次跨膜的螺旋形蛋白結構，主要吸收藍光（最大吸收波長～470 nm），受到藍光刺激時引起陽離子通道開放，出現峰值電流，迅速引起細胞去極化，隨后進入靜息狀態，緊接著給予第二次光刺激時出現的電流峰值明顯減小，但是在黑暗條件中等待數秒之后，峰值將恢復正常[21-24]。這種在適宜波長光刺激下引起細胞快速去極化的性質，使其成為研究神經元功能的重要工具。2005年開始，研究者們陸續將ChR2表達到神經元上，通過藍光刺激引起細胞去極化，精確控制神經元的活化，從而研究其基本功能以及病理情況下的功能改變[25-29]。
4 ChR2與RP
此前研究者還只是將ChR2應用在神經元功能方面的研究，隨后一些視網膜的研究者開始關注到這種光敏蛋白在重塑視網膜感光方面的潛力。2006年，Bi等[30]首先通過將ChR2表達在rd1小鼠的視網膜上成功重建了部分視功能。rd1小鼠是一種常用的RP動物模型，研究者將以腺相關病毒-2為載體的ChR2注入rd1小鼠的玻璃體腔，ChR2非特異性的表達在RGC，這些細胞在RP患者的光感受器死亡后還能存活多年[31]。該研究發現，這種方法可以使失去光感的視網膜重新感光，并能將這些光信號傳導至視皮層。然而視網膜并非單純傳導光信號，過去的觀點認為復雜的視覺信號由視覺中樞處理，而近年來的研究提示之前我們一直低估了視網膜對視覺信號的處理能力，一些復雜的視覺信號的整合編譯在視網膜就完成了，例如物體運動、顏色、對比等視覺信號[32-33]。所以雖然在RGC上表達ChR2可以使視網膜感光，但是卻遺失了視網膜對許多視覺信號的編譯能力。于是，有研究者將ON雙極細胞作為靶細胞，通過光遺傳學的方法不僅使視網膜重獲光感，而且重塑了部分視覺相關的行為[34-35]。當然，如果能恢復視網膜第一級神經元的光感，無疑將最大程度上重塑視覺功能，而且視錐細胞在失去感光功能后還能存活很長時間。基于此，已經有研究者通過光遺傳學的方法使RP動物模型在光感受器的層面即重獲光感，而且記錄到了視網膜的一些重要的生理功能，如方向選擇、明暗對比等[36-37]。但是考慮到在疾病的晚期，殘存的光感受器數量極少[38] ；所以，重塑光感受器感光功能的臨床意義還需要更深入的研究。
由于ChR2的發現時間早，對ChR2的認識和研究比較深入，所以目前大部分應用光遺傳學重塑視網膜視覺功能的研究都圍繞ChR2展開；但是除此之外，還有很多光敏蛋白也被應用于視覺重塑的研究。對黃光敏感的噬鹽菌視紫紅質同樣是一種微生物視蛋白，被激活時引起氯離子通道開放，導致細胞功能抑制。研究者將該蛋白和ChR2分別表達至視網膜的OFF細胞和ON細胞，以更大程度上模擬自然條件下的光反應過程[39]。雖然相對于微生物視蛋白而言，動物視蛋白的結構和信號傳導通路更復雜，但是研究者們仍不斷嘗試將其應用于視功能的重塑，例如黑視蛋白在視網膜神經元上的表達，可使rd1小鼠重塑部分視覺相關行為[40-41]。此外，研究者們還嘗試將這些視蛋白表達于不同的視網膜神經元，甚至是分別表達在神經元的胞體和樹突，以最大程度地重塑視網膜的視覺功能[42]。
5 問題和展望
雖然目前關于光遺傳學在視功能重塑中的研究取得了令人矚目的成果，也為RP這一類視網膜變性疾病提供了一種極具價值和前景的治療方案，但是在運用過程中，我們需要密切監測可能出現的問題。首先，病毒作為基因載體注入玻璃體腔可能引起免疫反應和視網膜毒性[43]。此前一些關于視網膜疾病基因治療的臨床前研究和前期臨床研究并未觀察到視網膜轉染導致的并發癥[44]。兩項在嚙齒類動物視網膜上表達ChR2的長期研究也未觀察到嚴重的并發癥[45-46]。當然，在其他靈長類動物和人類視網膜上的試驗數據也是必不可少的。此外，通過光遺傳學重塑的視網膜感光系統依然無法完全模擬生理情況的視網膜功能。一方面，由于ChR2等光敏蛋白具有固定的感光域，只能被一定波長的光線激活；另一方面，雖然既往研究記錄到利用光遺傳學的方法可以使視網膜獲得光感，并使實驗動物一些視覺相關的行為重建，但是試驗需要較高的光強度，而這在實際生活中很難達到。隨著研究的不斷深入，具有更高光敏度和更廣感光域的ChR亞型被發現，為以后的研究提供了更多的可能[47-48]。
目前關于光遺傳學的研究均還圍繞著動物實驗進行，如果要評估其在疾病治療中的應用前景，在靈長類動物和人視網膜上的研究必不可少，而體外培養的視網膜為我們進一步的研究提供了可能[49]。總之，光遺傳學的出現具有劃時代的意義，大量研究也提示了其在RP治療中的前景，但是在應用到臨床之前仍需要對安全性和有效性進行大量長期的研究和觀察。
視網膜色素變性（RP）是一類嚴重影響視力的視網膜變性疾病，可引起光感受器不可逆性進行性死亡。目前針對RP尚無有效治療手段。光遺傳學是一項結合光學和遺傳學相關知識，利用基因編碼光敏蛋白并通過光控制細胞興奮性的技術，目前主要用于神經元研究。視紫紅質離子通道蛋白-2（ChR2）是其中極為重要的一種光敏蛋白。視網膜作為中樞神經系統的一部分，具有三級神經元結構，在RP的病理過程中雖然喪失了光感受器功能，但是雙極細胞和視網膜神經節細胞（RGC）的功能以及與視覺中樞的神經連接卻得以保存。基于此，近年來研究者們陸續發現ChR2等光敏蛋白在RP治療中的應用前景。現就視網膜神經元的功能、RP以及光遺傳學在RP治療中的應用情況作一簡要綜述。
1 視網膜神經元的構成和功能
哺乳動物的視網膜作為中樞神經系統的一部分，由5類不少于60種不同神經元和一類神經膠質細胞組成。光感受器接收光刺激，激活視紫紅質后啟動G蛋白偶聯受體，進一步激活下游酶鏈反應，將輸入光信號轉換為輸出電信號并傳導至RGC，由RGC將來自雙極細胞和無長突細胞的信號整合編譯成大約20種不同的信號傳遞至視皮層[1]。其中，雙極細胞分為視錐雙極細胞和視桿雙極細胞，視錐雙極細胞分為ON和OFF兩種類型。水平細胞和無長突細胞主要起抑制性調節作用[2]。
視覺信號的傳遞主要依靠神經遞質，視網膜對視覺信號的處理起源于光感受器，其突觸末端釋放興奮性神經遞質谷氨酸。在視錐細胞信號傳導通路中，視錐細胞與兩種水平細胞和8種視錐雙極細胞形成突觸連接，這些視錐細胞的突觸后細胞表達不同類型的谷氨酸受體[2-4]。水平細胞和OFF視錐雙極細胞表達親離子型谷氨酸受體（AMPA＜á-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionicacid＞和kainate），與谷氨酸結合后陽離子通道開放；ON視錐雙極細胞表達親代謝型谷氨酸受體（mGluR6），與谷氨酸結合后陽離子通道TRPM1關閉[5]。由于光刺激時視錐細胞超極化造成谷氨酸釋放減少，水平細胞和OFF視錐雙極細胞的陽離子通道開放減少，導致細胞超極化即細胞功能抑制；而ON視錐雙極細胞的陽離子通道開放增加導致去極化，即細胞興奮[6-7]。最后的結果是，OFF-RGC接受來自OFF視錐雙極細胞的信號減少，即光刺激下OFF-RGC功能被抑制；而ON-RGC接受來自ON視錐雙極細胞的信號增加，即光刺激下ON-RGC細胞興奮。從功能學角度看，暗刺激引起OFF-RGC興奮，而光刺激引起ON-RGC興奮。
類似于視錐細胞，視桿細胞也釋放神經遞質谷氨酸，在光刺激下出現超極化，谷氨酸釋放減少。視桿細胞的突觸后細胞為水平細胞和視桿雙極細胞，水平細胞表達親離子型谷氨酸受體，而視桿雙極細胞表達mGluR6并在光刺激情況下去極化[8-9]。然而視桿雙極細胞并非直接將信號傳導至RGC，而是通過谷氨酸能神經突觸傳導至AⅡ無長突細胞[10-11]。AⅡ無長突細胞通過縫隙連接與ON視錐雙極細胞的軸突發生連接，并與OFF視錐雙極細胞形成抑制性（甘氨酸能）突觸連接，通過這些視錐雙極細胞將信號傳導至相應RGC[2]。
2 RP
視網膜變性疾病的一個共同特征是光感受器的進行性死亡，其中RP是一種最常見的視網膜遺傳病，通常雙眼發病，其基因突變導致的損傷主要累及視桿細胞，從而造成夜盲。隨著疾病進展，變性的細胞由視網膜周邊部向視網膜后極部發展，從而殘留管狀視野，疾病終末期由于視錐細胞同時受累造成患者中心視力和周邊視力均喪失[12]。目前已經發現超過50種基因的100個位點與RP相關，其中約20%為常染色體隱性遺傳，10%～20%為常染色體顯性遺傳，還有10%為X連鎖隱性遺傳，其余為無家族史的散發病例[13]。目前RP尚無法治愈，但是一些治療方法已經進入試驗階段。第一類方法為基因替代治療，針對Leber先天性黑矇進行的基因研究進展[14] 為RP基因治療提供了一個很好的借鑒；第二類方法致力于減緩光感受器變性從而減緩病情的發展；第三類方法旨在通過建立新的光感受器細胞重塑視網膜功能。在這三類方法中，基因治療是最理想的方法。但RP是一種多基因致病的疾病，目前已經檢測到超過50種基因的3000種突變可以致病[15]。同時，疾病后期視錐細胞同樣受累，而基因治療尚無法解決如此龐大的基因問題以及視錐細胞受累的問題。一種更具有可實施性的治療手段是利用光遺傳學，即通過在變性的視網膜上表達光敏蛋白重建視網膜的感光功能。這種光敏蛋白必須能夠獨立且直接地將光信號轉化為電信號，而不依賴于其他信號通路。ChR2就是這樣一種光敏蛋白。
3 光遺傳學和ChR2
廣義上來講，光遺傳學是指一種將表達光敏蛋白的基因編碼至靶神經元，通過光刺激控制這些靶細胞激活的方法[16]。光敏蛋白在靶細胞的主要表達方式包括以病毒為載體進行轉染和轉基因小鼠。該技術涉及的光敏蛋白主要包括兩類：微生物視蛋白和動物視蛋白。有脊椎動物和無脊椎動物的光反應過程具有明顯區別，雖然都使用視紫紅質這種由視黃醛與7次跨膜的螺旋形視蛋白共價結合的蛋白，但對于有脊椎動物，光刺激激活視紫紅質后啟動G蛋白偶聯受體激活下游酶鏈反應，導致環磷酸鳥苷（cGMP）水解和cGMP門控陽離子通道關閉，最終細胞超級化[17]。無脊椎動物雖然也使用G蛋白偶聯受體，但在光刺激下直接導致瞬時受體電勢通道的激活和細胞快速的去極化[18]。ChR是一種微生物視蛋白，同樣屬于光敏離子通道蛋白，最初從綠藻中分離而來，介導其趨光性[19-20]。ChR2是其中一種ChR的亞型，同樣具有7次跨膜的螺旋形蛋白結構，主要吸收藍光（最大吸收波長～470 nm），受到藍光刺激時引起陽離子通道開放，出現峰值電流，迅速引起細胞去極化，隨后進入靜息狀態，緊接著給予第二次光刺激時出現的電流峰值明顯減小，但是在黑暗條件中等待數秒之后，峰值將恢復正常[21-24]。這種在適宜波長光刺激下引起細胞快速去極化的性質，使其成為研究神經元功能的重要工具。2005年開始，研究者們陸續將ChR2表達到神經元上，通過藍光刺激引起細胞去極化，精確控制神經元的活化，從而研究其基本功能以及病理情況下的功能改變[25-29]。
4 ChR2與RP
此前研究者還只是將ChR2應用在神經元功能方面的研究，隨后一些視網膜的研究者開始關注到這種光敏蛋白在重塑視網膜感光方面的潛力。2006年，Bi等[30]首先通過將ChR2表達在rd1小鼠的視網膜上成功重建了部分視功能。rd1小鼠是一種常用的RP動物模型，研究者將以腺相關病毒-2為載體的ChR2注入rd1小鼠的玻璃體腔，ChR2非特異性的表達在RGC，這些細胞在RP患者的光感受器死亡后還能存活多年[31]。該研究發現，這種方法可以使失去光感的視網膜重新感光，并能將這些光信號傳導至視皮層。然而視網膜并非單純傳導光信號，過去的觀點認為復雜的視覺信號由視覺中樞處理，而近年來的研究提示之前我們一直低估了視網膜對視覺信號的處理能力，一些復雜的視覺信號的整合編譯在視網膜就完成了，例如物體運動、顏色、對比等視覺信號[32-33]。所以雖然在RGC上表達ChR2可以使視網膜感光，但是卻遺失了視網膜對許多視覺信號的編譯能力。于是，有研究者將ON雙極細胞作為靶細胞，通過光遺傳學的方法不僅使視網膜重獲光感，而且重塑了部分視覺相關的行為[34-35]。當然，如果能恢復視網膜第一級神經元的光感，無疑將最大程度上重塑視覺功能，而且視錐細胞在失去感光功能后還能存活很長時間。基于此，已經有研究者通過光遺傳學的方法使RP動物模型在光感受器的層面即重獲光感，而且記錄到了視網膜的一些重要的生理功能，如方向選擇、明暗對比等[36-37]。但是考慮到在疾病的晚期，殘存的光感受器數量極少[38] ；所以，重塑光感受器感光功能的臨床意義還需要更深入的研究。
由于ChR2的發現時間早，對ChR2的認識和研究比較深入，所以目前大部分應用光遺傳學重塑視網膜視覺功能的研究都圍繞ChR2展開；但是除此之外，還有很多光敏蛋白也被應用于視覺重塑的研究。對黃光敏感的噬鹽菌視紫紅質同樣是一種微生物視蛋白，被激活時引起氯離子通道開放，導致細胞功能抑制。研究者將該蛋白和ChR2分別表達至視網膜的OFF細胞和ON細胞，以更大程度上模擬自然條件下的光反應過程[39]。雖然相對于微生物視蛋白而言，動物視蛋白的結構和信號傳導通路更復雜，但是研究者們仍不斷嘗試將其應用于視功能的重塑，例如黑視蛋白在視網膜神經元上的表達，可使rd1小鼠重塑部分視覺相關行為[40-41]。此外，研究者們還嘗試將這些視蛋白表達于不同的視網膜神經元，甚至是分別表達在神經元的胞體和樹突，以最大程度地重塑視網膜的視覺功能[42]。
5 問題和展望
雖然目前關于光遺傳學在視功能重塑中的研究取得了令人矚目的成果，也為RP這一類視網膜變性疾病提供了一種極具價值和前景的治療方案，但是在運用過程中，我們需要密切監測可能出現的問題。首先，病毒作為基因載體注入玻璃體腔可能引起免疫反應和視網膜毒性[43]。此前一些關于視網膜疾病基因治療的臨床前研究和前期臨床研究并未觀察到視網膜轉染導致的并發癥[44]。兩項在嚙齒類動物視網膜上表達ChR2的長期研究也未觀察到嚴重的并發癥[45-46]。當然，在其他靈長類動物和人類視網膜上的試驗數據也是必不可少的。此外，通過光遺傳學重塑的視網膜感光系統依然無法完全模擬生理情況的視網膜功能。一方面，由于ChR2等光敏蛋白具有固定的感光域，只能被一定波長的光線激活；另一方面，雖然既往研究記錄到利用光遺傳學的方法可以使視網膜獲得光感，并使實驗動物一些視覺相關的行為重建，但是試驗需要較高的光強度，而這在實際生活中很難達到。隨著研究的不斷深入，具有更高光敏度和更廣感光域的ChR亞型被發現，為以后的研究提供了更多的可能[47-48]。
目前關于光遺傳學的研究均還圍繞著動物實驗進行，如果要評估其在疾病治療中的應用前景，在靈長類動物和人視網膜上的研究必不可少，而體外培養的視網膜為我們進一步的研究提供了可能[49]。總之，光遺傳學的出現具有劃時代的意義，大量研究也提示了其在RP治療中的前景，但是在應用到臨床之前仍需要對安全性和有效性進行大量長期的研究和觀察。