糖尿病視網膜病變（DR）發病機制復雜，目前尚未完全闡明。蛋白質組學通過定量分析技術對DR患者和糖尿病大鼠的視網膜、玻璃體液、房水、淚液和血液中表達的蛋白和藥物干預后差異表達蛋白進行分析，為探索DR發病機制、藥物作用機制、診斷和治療提供新思路。
引用本文： 肖靜, 張曉敏, 李筱榮. 糖尿病視網膜病變的蛋白質組學研究進展. 中華眼底病雜志, 2018, 34(4): 407-411. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.04.024 復制
糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病常見的并發癥之一。其發病與炎癥、氧化應激、細胞因子異常表達和基因甲基化等因素相關。但仍不能明確具體發病機制，且目前治療DR的方法如激光光凝、抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物治療和玻璃體切割手術等，對DR患者視力恢復效果并不理想[1]。因此，需要新的技術和方法去探索DR發病機制和抗VEGF等藥物作用機制，改善治療方案。近年來，利用蛋白質組學技術發現DR患者和糖尿病大鼠視網膜、玻璃體、房水、血液甚至淚液中差異表達的蛋白質，尋找DR相關的生物學標記物；并且還可分析抗VEGF藥物作用前后玻璃體蛋白表達變化情況，探索抗VEGF藥物治療在DR中發揮作用。此外，還可探索其他藥物對DR的作用效果，挖掘潛在的藥物靶點。但是，目前DR蛋白質組學研究仍處于探索階段，已發現的差異表達蛋白成為診斷早期DR還尚需時間[2]。研究中，針對增生型DR（PDR）的研究較非PDR（NPDR）和糖尿病黃斑水腫（DME）多，而糖尿病糖尿病皮質激素治療DR的機制也需進一步探索。本文就近年蛋白質組學技術及其在DR中的應用作一綜述。
1 蛋白質組學
1.1 基本概念
1994年Wilkins等[3]首次提出蛋白質組學概念，是指一個細胞或組織中全部基因表達的全部蛋白質。蛋白質是參與生命活動的重要分子，雖然基因決定蛋白質種類，但基因的表達水平不能代表蛋白質的表達水平、蛋白質的修飾和相互作用關系，生命活動不是僅由單一蛋白參與，而是許多蛋白的共同作用[4]。蛋白質組學不僅定量分析蛋白質表達水平，還研究蛋白質的三維結構、定位和蛋白質之間的相互作用關系[5]。因此，利用蛋白質組學技術定量分析視網膜、玻璃體、血液中表達的蛋白，發現在DR中異常表達的蛋白，對DR發病機制研究與治療非常重要。
1.2 蛋白質組學技術
蛋白質組學的發展依賴于蛋白質組學技術的進步，蛋白質組學技術主要包括分離技術和質譜技術。目前常見的分離技術有雙向凝膠電泳（2DE）、差異凝膠電泳（2DIGE）和液相色譜；常見的質譜技術有基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和液相色譜電噴霧電離質譜。上述這些技術經過20多年的發展，目前已較為成熟[6]。此外，還有同位素和化學標記質譜技術，如同位素標記相對和絕對定量技術（iTRAQ）[7]，蛋白質芯片技術、酵母雙雜交系統和生物信息學分析技術。目前蛋白質組學技術在DR方面的研究，是先通過蛋白質組學技術找出有意義的差異表達蛋白質，再擴大樣本量通過酶聯免疫吸附試驗、蛋白免疫印跡法分析等進行驗證，從而完成相關的藥物機制研究[8]。
2 蛋白質組學在DR中的應用
2.1 人視網膜蛋白質組學
視網膜上的蛋白質直接反映發生糖尿病或者DR發病前后的病理狀態。利用液相色譜串聯質譜技術，Velez等[9]在健康人群中檢測氧化應激因子在視網膜不同部位的表達水平，如VEGF在黃斑中心凹幾乎不表達，在周邊部視網膜和黃斑周邊表達。黃斑中心凹含有較少的超氧化物歧化酶1等抗氧化酶，抗氧化水平較周邊部視網膜低，因此較容易受到氧化損傷刺激，并且該部位有可能依賴視網膜色素上皮（RPE）行抗氧化作用[10]。此外，在黃斑部主要進行戊糖磷酸途徑，該途徑是還原型輔酶Ⅱ（NADPH）的主要來源，當發生糖尿病時，NADPH消耗以至于無法抵御氧化應激導致的視網膜損傷。根據這些抗氧化應激蛋白的分布特點，提示臨床可以給予DR患者抗氧化酶化學類似物。M40403是一種錳超氧化物歧化酶模擬化合物，可有效預防全身照射后小鼠的氧化損傷[11]，并可改善糖尿病小鼠模型中的血液循環[12]。因此，蛋白質組學技術可以尋找潛在治療DR的靶點藥物。另外，有研究者通過蛋白質組學技術分析DR患者的新生血管增生膜和黃斑前膜患者的增生膜，通過比較兩種不同膜差異表達的蛋白質，探索增生膜產生的原因。Takada等[13]對這兩種膜進行分析比較，發現其中骨膜蛋白在PDR患者增生膜中高表達，骨膜蛋白在細胞接觸、轉移和黏附中發揮作用，其作用可能參與了DR新生血管膜的形成。 Sundstrom等[14]為探索糖尿病引起的視網膜神經變性和腦神經退行性疾病的關系，應用液相色譜串聯質譜方法，測量正常人和糖尿病患者視網膜蛋白的表達情況，發現Thimet寡肽酶（THOP1）在糖尿病患者及發生了視神經變性的患者中表達降低。THOP1在阿爾茨海默病中具有神經保護作用，說明這種保護神經作用在糖尿病早期已經失去。此外，在發生神經變性的糖尿病患者視網膜中，參與多巴胺降解和帕金森信號傳導的蛋白增加。這些發現表明，糖尿病視網膜中神經變性與腦退行性病變具有相同的途徑，有助于了解糖尿病患者發生神經退行性病變的機制，尋找可能作為早期DR的生物學標記物，DR患者能被早期診斷。
2.2 糖尿病動物模型蛋白質組學
有研究者分析了糖尿病大鼠與正常大鼠之間蛋白質的差異表達和藥物作用之后蛋白表達變化情況，發現晶狀體蛋白、熱休克蛋白、炎癥因子等與DR的發生密切相關，為DR的機制研究奠定基礎。Fort等[15]應用2DE和iTRAQ分析大鼠晶狀體蛋白的亞基變化，α、β和γ晶狀體蛋白異構體在糖尿病大鼠過表達，不同亞基晶狀體蛋白升高的時間不同，說明不同亞基晶狀體蛋白有不同的功能和細胞定位。全身或眼周給予胰島素可以下調晶狀體蛋白的表達，VanGuilder等[16]應用胰島素使得β晶狀體蛋白正常化。β和γ晶狀體蛋白上調可能與視網膜血管重塑有關，上調的α晶狀體蛋白可能參與視網膜炎癥[17, 18]，晶狀體蛋白的升高與糖尿病視網膜出現血管通透性增加同時出現。晶狀體蛋白的上調可能參與了DR的發生，并有可能成為DR的生物學標記物。Quin等[19]分離正常和糖尿病大鼠視網膜，發現24個糖尿病大鼠特異表達蛋白，包括熱休克蛋白70和血小板活化因子。猜測熱休克蛋白表達升高與RPE過氧化應激有關，證明熱休克蛋白70升高驅動早期DR的發生。而血小板活化因子可以減輕糖尿病引起的血管損傷。同時還發現與Wnt信號通路相關的β連環蛋白、光傳感因子、醛還原酶在糖尿病大鼠中升高，驗證了Wnt信號通路激活與DR的發生有關。Takahashi等[20]檢測了一組4周齡糖尿病肥胖模型鼠和野生型鼠的血漿蛋白質組學，發現4、12周齡糖尿病肥胖模型鼠血漿中血管緊張素3、絲氨酸肽酶抑制劑水平較野生型鼠高，同時證明了血管緊張素3增加視網膜血管內皮細胞的通透性，因此，認為血管緊張素3與糖尿病和DR的形成有關。這些發現不僅對DR的發病有更深的認識，更有助于突破原有的思維局限[21]。
2.3 DR血液蛋白質組學
隨著蛋白質譜技術發展，在血漿中，不斷地有新的蛋白被發現，由于血漿來源無創性的優點，許多研究者通過分析血液中差異表達蛋白，試圖尋找DR相關的生物學標記物。劉銀萍[22]用2DIGE聯合質譜的方法分析DR患者血清，發現β2-糖蛋白I在發生DR早期較未發生DR的糖尿病患者升高，而在NPDR與PDR之間表達未見明顯差異，因此，他們推測β2-糖蛋白I可能成為診斷早期DR的血清分子標記物。Lu等[23]應用2DIGE和MALDI-TOF-MS對未發生DR的糖尿病患者和DR患者的血漿進行分析，發現12種可能作為診斷DR的生物學標記的蛋白質，分別是亮氨酸富集的α糖蛋白、VitD結合的轉運蛋白、凝膠融素、細胞角蛋白-8等結構蛋白和蛋白質精氨酸N-甲基轉移酶-5 。Gopalakrishnan等[24]也分析了發生和未發生DR的糖尿病患者血漿的蛋白質，發現DR患者的視黃醇結合蛋白-1和神經珠等蛋白上調，γ血紅蛋白-2、CD160下調。而Jin等[25]不僅分析未發生DR的糖尿病患者和輕到中度NPDR患者血漿中的96種蛋白質，還分析已有的DR蛋白質組學文章和數據庫，從中選取與DR相關的39候選蛋白，發現載脂蛋白4、補體7、凝集素和α胰蛋白酶抑制劑的重復性比較好，這4種蛋白質可以聯合作為診斷早期DR的探針，其特異性和敏感性較測量單一蛋白質高。
2.4 DR淚液蛋白質組學
淚液的蛋白質具有高度動態性，相比血漿中的蛋白質種類少，蛋白質濃度大約為（12.03±0.45）mg/ml[26]。淚液在眼表分布，因此較玻璃體和房水收集更方便。Herber等[27]最早采用2DIGE分析淚液蛋白質，發現DR患者淚液與健康人淚液蛋白質存在差異。Zhou等[28]檢測發現淚液中含有超過1 500種蛋白質。Kim等[29]用2DIGE和電噴霧-四級桿-飛行時間串聯質譜技術檢測發現，未發生DR的糖尿病患者和NPDR患者淚液中β-2微球蛋白上調，而載脂蛋白-1和熱休克蛋白27下調。Csosz等[30]也從DR患者的眼淚中載脂蛋白1的變化，因此，載脂蛋白可能成為診斷早期DR的標記物。Costagliola等[31]報道DR患者的腫瘤壞死因子α水平較正常人顯著升高，并且與DR的嚴重程度密切相關。Torok等[32]將蛋白質組學數據與眼底照相結合，為臨床DR篩選創建更便宜且更易于使用的方法。雖然本項研究表明該系統尚未完全優化，但研究者認為其在DR篩查具有潛力。
2.5 DR房水與玻璃體蛋白質組學
房水和玻璃體是重要的眼內液，發生DR時，血管的通透性增加，血液中的信號分子進入眼內液，其成分和生物學功能發生變化[33]。因此，用蛋白質組學方法可檢測到DR發生時微量表達蛋白的變化；可在DR患者檢測到炎癥因子、細胞結構蛋白、載脂蛋白等表達變化，如PDR患者玻璃體液中載脂蛋白H較黃斑裂孔患者增加[34]。伴有DME的NPDR患者玻璃體液中的載脂蛋白A1和A4表達較未發生DME的NPDR患者增加[35]。載脂蛋白在調節血脂發揮重要的作用，也被認為與DR的發生相關。此外，許多炎癥因子在DR發生中有重要的作用。Vujosevic等[36]采用蛋白質芯片測試一組糖尿病未發生DR、輕度DR患者和正常人房水中膠質細胞相關的炎癥因子，發現糖尿病患者未發生DR的IL-1β和IL-3、干擾素γ、單核細胞趨化蛋白較正常人增加；輕度DR患者集落刺激因子、趨化因子、腫瘤壞死因子-RⅡ較正常人和糖尿病未發生DR患者顯著增加。這些炎癥因子在發生糖尿病和DR時表達升高，說明DR的發生與視網膜神經膠質細胞的激活相關。Chiang等[37]發現DR患者房水中載脂蛋白-1、血清鐵轉運蛋白和生長因子受體蛋白-10等11種蛋白質較糖尿病未發生DR患者升高；這些蛋白質具有運輸營養，重組細胞微結構，血管生成，抗氧化和神經保護作用。Loukovaara等[38]比較了NPDR、PDR患者玻璃體蛋白質，發現PDR中較NPDR升高的蛋白質來自補體、絲氨酸蛋白酶抑制劑家族、載脂蛋白和蛋白酶抑制劑等。作者認為，補體、凝血級聯因子和血漿激肽釋放酶激肽系統在DR的發病中起重要作用。另外，也有學者同時收集患者玻璃體和血標本，觀察玻璃體中蛋白差異是否也存在于血漿中。Kim等[39, 40]分析NPDR、PDR和黃斑裂孔患者玻璃體、血漿中蛋白質表達情況，發現31個差異表達蛋白，NPDR、PDR患者的玻璃體和血漿中甲狀腺結合蛋白較黃斑裂孔患者升高。
3 藥物治療與DR蛋白質組學
隨著近年抗VEGF藥物治療的普及，部分DR患者病情得到緩解，但仍有部分DR患者療效并不理想，抗VEGF作用機制也尚不明確。因此，越來越多的學者希望通過蛋白質組學技術探索抗VEGF治療DR的機制和尋找新的治療靶點。Zou等[41]觀察了雷珠單抗玻璃體腔注射前后玻璃體蛋白表達變化，發現抗VEGF藥物治療除降低VEGF表達水平外，還能降低載脂蛋白C1和血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑, 這些蛋白質在脂蛋白代謝以及促進炎癥、血管生成、細胞生長和細胞骨架完整性方面發揮關鍵作用。其中，參與血小板脫顆粒行為的12個蛋白在治療后降低程度明顯，提示抗VEGF藥物治療通過抑制血小板的脫顆粒調節血液凝固狀態，抗血栓治療可能對PDR有保護作用。Jo等[42]分別對VEGF誘導組、VEGF誘導+抗VEGF組、正常對照組大鼠的蛋白表達譜進行了鑒定，發現β2整合蛋白、肌動蛋白細胞骨架、活化氧自由基和纖維組織在抗VEGF之后發生改變，通過蛋白質相互作用網絡發現，β2整合蛋白可以改變肌動蛋白細胞骨架和細胞之間的連接。β2整合蛋白在注射VEGF時上調，而抗VEGF時出現下調。抗β2整合蛋白減輕VEGF誘導組大鼠滲漏情況并且抑制纖連蛋白-β2整合素蛋白通路，說明β2整合蛋白可能是抗VEGF的作用靶點。Loukovaara等[38]比較NPDR、PDR患者玻璃體腔注射貝伐單抗后玻璃體蛋白改變情況，發現PDR患者的細胞黏附蛋白、胰島素通路相關蛋白、三磷酸腺苷酶激活蛋白和載脂蛋白較未治療者下調，提示非甾體類消炎藥、糖皮質激素、他汀等降低載脂蛋白藥物對PDR可能具有保護作用；而補體、凝結物、激肽-激肽釋放酶串聯蛋白未見改變，說明激肽釋放酶激肽途徑可能是獨立于VEGF發揮作用。這些研究不僅對抗VEGF有了更深入的認識，還將視線轉移到了激肽釋放酶激肽途徑。如Gao等[43]發現PDR患者玻璃體中碳酸酐酶-1較NPDR患者和正常人高。將碳酸酐酶-1注射到糖尿病小鼠玻璃體后，發現激肽釋放酶活性增加，從而觸發了因子Ⅻ介導的DME。在糖尿病小鼠中使用補體1抑制劑，前激肽釋放酶的中和抗體和緩激肽受體拮抗劑，減輕DME，說明碳酸酐酶-1與PDR的發病相關。此外，Gao等[44]應用血管緊張素受體阻滯劑坎地沙坦治療糖尿病大鼠后，可將玻璃體異常表達蛋白正常化。研究已證實坎地沙坦可降低1型糖尿病患者DR的發生率[45]，而在2型糖尿病和輕度至中度視網膜病變患者中，坎地沙坦治療可減少DR進展34%[46]。
4 展望
近年隨著蛋白質組學技術的進步，可鑒定的蛋白質種類特別是低豐度蛋白種類不斷增加，更多DR相關的差異表達蛋白質和生物學標記物被發現，如載脂蛋白、晶體蛋白，已成為診斷DR的生物標記物。而在治療方面，PDR的蛋白質組研究已經鑒定出潛在治療靶標，如碳酸酐酶-I；更有研究已經證實，血管緊張素受體Ⅱ拮抗劑可逆轉糖尿病所致的蛋白質組變化，而這與臨床試驗結果相符。目前，關于DR的蛋白質組學的研究，針對PDR者較深入，而針對NPDR和DME的研究較少。此外，地塞米松玻璃體內植入物治療DR后相關蛋白質組學改變也有待研究；而抗VEGF藥物治療也需要進一步探索其治療的作用機制。由于蛋白質組學技術的局限性，目前尚不能用某種單一的技術手段鑒定出樣品中所有的蛋白質。相信隨著醫學與實驗技術的更新，會有更多與DR相關的蛋白被發現，同時通過大樣本量驗證差異蛋白，使其成為臨床診斷、治療和預后相關的標記物和靶點。
糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病常見的并發癥之一。其發病與炎癥、氧化應激、細胞因子異常表達和基因甲基化等因素相關。但仍不能明確具體發病機制，且目前治療DR的方法如激光光凝、抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物治療和玻璃體切割手術等，對DR患者視力恢復效果并不理想[1]。因此，需要新的技術和方法去探索DR發病機制和抗VEGF等藥物作用機制，改善治療方案。近年來，利用蛋白質組學技術發現DR患者和糖尿病大鼠視網膜、玻璃體、房水、血液甚至淚液中差異表達的蛋白質，尋找DR相關的生物學標記物；并且還可分析抗VEGF藥物作用前后玻璃體蛋白表達變化情況，探索抗VEGF藥物治療在DR中發揮作用。此外，還可探索其他藥物對DR的作用效果，挖掘潛在的藥物靶點。但是，目前DR蛋白質組學研究仍處于探索階段，已發現的差異表達蛋白成為診斷早期DR還尚需時間[2]。研究中，針對增生型DR（PDR）的研究較非PDR（NPDR）和糖尿病黃斑水腫（DME）多，而糖尿病糖尿病皮質激素治療DR的機制也需進一步探索。本文就近年蛋白質組學技術及其在DR中的應用作一綜述。
1 蛋白質組學
1.1 基本概念
1994年Wilkins等[3]首次提出蛋白質組學概念，是指一個細胞或組織中全部基因表達的全部蛋白質。蛋白質是參與生命活動的重要分子，雖然基因決定蛋白質種類，但基因的表達水平不能代表蛋白質的表達水平、蛋白質的修飾和相互作用關系，生命活動不是僅由單一蛋白參與，而是許多蛋白的共同作用[4]。蛋白質組學不僅定量分析蛋白質表達水平，還研究蛋白質的三維結構、定位和蛋白質之間的相互作用關系[5]。因此，利用蛋白質組學技術定量分析視網膜、玻璃體、血液中表達的蛋白，發現在DR中異常表達的蛋白，對DR發病機制研究與治療非常重要。
1.2 蛋白質組學技術
蛋白質組學的發展依賴于蛋白質組學技術的進步，蛋白質組學技術主要包括分離技術和質譜技術。目前常見的分離技術有雙向凝膠電泳（2DE）、差異凝膠電泳（2DIGE）和液相色譜；常見的質譜技術有基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和液相色譜電噴霧電離質譜。上述這些技術經過20多年的發展，目前已較為成熟[6]。此外，還有同位素和化學標記質譜技術，如同位素標記相對和絕對定量技術（iTRAQ）[7]，蛋白質芯片技術、酵母雙雜交系統和生物信息學分析技術。目前蛋白質組學技術在DR方面的研究，是先通過蛋白質組學技術找出有意義的差異表達蛋白質，再擴大樣本量通過酶聯免疫吸附試驗、蛋白免疫印跡法分析等進行驗證，從而完成相關的藥物機制研究[8]。
2 蛋白質組學在DR中的應用
2.1 人視網膜蛋白質組學
視網膜上的蛋白質直接反映發生糖尿病或者DR發病前后的病理狀態。利用液相色譜串聯質譜技術，Velez等[9]在健康人群中檢測氧化應激因子在視網膜不同部位的表達水平，如VEGF在黃斑中心凹幾乎不表達，在周邊部視網膜和黃斑周邊表達。黃斑中心凹含有較少的超氧化物歧化酶1等抗氧化酶，抗氧化水平較周邊部視網膜低，因此較容易受到氧化損傷刺激，并且該部位有可能依賴視網膜色素上皮（RPE）行抗氧化作用[10]。此外，在黃斑部主要進行戊糖磷酸途徑，該途徑是還原型輔酶Ⅱ（NADPH）的主要來源，當發生糖尿病時，NADPH消耗以至于無法抵御氧化應激導致的視網膜損傷。根據這些抗氧化應激蛋白的分布特點，提示臨床可以給予DR患者抗氧化酶化學類似物。M40403是一種錳超氧化物歧化酶模擬化合物，可有效預防全身照射后小鼠的氧化損傷[11]，并可改善糖尿病小鼠模型中的血液循環[12]。因此，蛋白質組學技術可以尋找潛在治療DR的靶點藥物。另外，有研究者通過蛋白質組學技術分析DR患者的新生血管增生膜和黃斑前膜患者的增生膜，通過比較兩種不同膜差異表達的蛋白質，探索增生膜產生的原因。Takada等[13]對這兩種膜進行分析比較，發現其中骨膜蛋白在PDR患者增生膜中高表達，骨膜蛋白在細胞接觸、轉移和黏附中發揮作用，其作用可能參與了DR新生血管膜的形成。 Sundstrom等[14]為探索糖尿病引起的視網膜神經變性和腦神經退行性疾病的關系，應用液相色譜串聯質譜方法，測量正常人和糖尿病患者視網膜蛋白的表達情況，發現Thimet寡肽酶（THOP1）在糖尿病患者及發生了視神經變性的患者中表達降低。THOP1在阿爾茨海默病中具有神經保護作用，說明這種保護神經作用在糖尿病早期已經失去。此外，在發生神經變性的糖尿病患者視網膜中，參與多巴胺降解和帕金森信號傳導的蛋白增加。這些發現表明，糖尿病視網膜中神經變性與腦退行性病變具有相同的途徑，有助于了解糖尿病患者發生神經退行性病變的機制，尋找可能作為早期DR的生物學標記物，DR患者能被早期診斷。
2.2 糖尿病動物模型蛋白質組學
有研究者分析了糖尿病大鼠與正常大鼠之間蛋白質的差異表達和藥物作用之后蛋白表達變化情況，發現晶狀體蛋白、熱休克蛋白、炎癥因子等與DR的發生密切相關，為DR的機制研究奠定基礎。Fort等[15]應用2DE和iTRAQ分析大鼠晶狀體蛋白的亞基變化，α、β和γ晶狀體蛋白異構體在糖尿病大鼠過表達，不同亞基晶狀體蛋白升高的時間不同，說明不同亞基晶狀體蛋白有不同的功能和細胞定位。全身或眼周給予胰島素可以下調晶狀體蛋白的表達，VanGuilder等[16]應用胰島素使得β晶狀體蛋白正常化。β和γ晶狀體蛋白上調可能與視網膜血管重塑有關，上調的α晶狀體蛋白可能參與視網膜炎癥[17, 18]，晶狀體蛋白的升高與糖尿病視網膜出現血管通透性增加同時出現。晶狀體蛋白的上調可能參與了DR的發生，并有可能成為DR的生物學標記物。Quin等[19]分離正常和糖尿病大鼠視網膜，發現24個糖尿病大鼠特異表達蛋白，包括熱休克蛋白70和血小板活化因子。猜測熱休克蛋白表達升高與RPE過氧化應激有關，證明熱休克蛋白70升高驅動早期DR的發生。而血小板活化因子可以減輕糖尿病引起的血管損傷。同時還發現與Wnt信號通路相關的β連環蛋白、光傳感因子、醛還原酶在糖尿病大鼠中升高，驗證了Wnt信號通路激活與DR的發生有關。Takahashi等[20]檢測了一組4周齡糖尿病肥胖模型鼠和野生型鼠的血漿蛋白質組學，發現4、12周齡糖尿病肥胖模型鼠血漿中血管緊張素3、絲氨酸肽酶抑制劑水平較野生型鼠高，同時證明了血管緊張素3增加視網膜血管內皮細胞的通透性，因此，認為血管緊張素3與糖尿病和DR的形成有關。這些發現不僅對DR的發病有更深的認識，更有助于突破原有的思維局限[21]。
2.3 DR血液蛋白質組學
隨著蛋白質譜技術發展，在血漿中，不斷地有新的蛋白被發現，由于血漿來源無創性的優點，許多研究者通過分析血液中差異表達蛋白，試圖尋找DR相關的生物學標記物。劉銀萍[22]用2DIGE聯合質譜的方法分析DR患者血清，發現β2-糖蛋白I在發生DR早期較未發生DR的糖尿病患者升高，而在NPDR與PDR之間表達未見明顯差異，因此，他們推測β2-糖蛋白I可能成為診斷早期DR的血清分子標記物。Lu等[23]應用2DIGE和MALDI-TOF-MS對未發生DR的糖尿病患者和DR患者的血漿進行分析，發現12種可能作為診斷DR的生物學標記的蛋白質，分別是亮氨酸富集的α糖蛋白、VitD結合的轉運蛋白、凝膠融素、細胞角蛋白-8等結構蛋白和蛋白質精氨酸N-甲基轉移酶-5 。Gopalakrishnan等[24]也分析了發生和未發生DR的糖尿病患者血漿的蛋白質，發現DR患者的視黃醇結合蛋白-1和神經珠等蛋白上調，γ血紅蛋白-2、CD160下調。而Jin等[25]不僅分析未發生DR的糖尿病患者和輕到中度NPDR患者血漿中的96種蛋白質，還分析已有的DR蛋白質組學文章和數據庫，從中選取與DR相關的39候選蛋白，發現載脂蛋白4、補體7、凝集素和α胰蛋白酶抑制劑的重復性比較好，這4種蛋白質可以聯合作為診斷早期DR的探針，其特異性和敏感性較測量單一蛋白質高。
2.4 DR淚液蛋白質組學
淚液的蛋白質具有高度動態性，相比血漿中的蛋白質種類少，蛋白質濃度大約為（12.03±0.45）mg/ml[26]。淚液在眼表分布，因此較玻璃體和房水收集更方便。Herber等[27]最早采用2DIGE分析淚液蛋白質，發現DR患者淚液與健康人淚液蛋白質存在差異。Zhou等[28]檢測發現淚液中含有超過1 500種蛋白質。Kim等[29]用2DIGE和電噴霧-四級桿-飛行時間串聯質譜技術檢測發現，未發生DR的糖尿病患者和NPDR患者淚液中β-2微球蛋白上調，而載脂蛋白-1和熱休克蛋白27下調。Csosz等[30]也從DR患者的眼淚中載脂蛋白1的變化，因此，載脂蛋白可能成為診斷早期DR的標記物。Costagliola等[31]報道DR患者的腫瘤壞死因子α水平較正常人顯著升高，并且與DR的嚴重程度密切相關。Torok等[32]將蛋白質組學數據與眼底照相結合，為臨床DR篩選創建更便宜且更易于使用的方法。雖然本項研究表明該系統尚未完全優化，但研究者認為其在DR篩查具有潛力。
2.5 DR房水與玻璃體蛋白質組學
房水和玻璃體是重要的眼內液，發生DR時，血管的通透性增加，血液中的信號分子進入眼內液，其成分和生物學功能發生變化[33]。因此，用蛋白質組學方法可檢測到DR發生時微量表達蛋白的變化；可在DR患者檢測到炎癥因子、細胞結構蛋白、載脂蛋白等表達變化，如PDR患者玻璃體液中載脂蛋白H較黃斑裂孔患者增加[34]。伴有DME的NPDR患者玻璃體液中的載脂蛋白A1和A4表達較未發生DME的NPDR患者增加[35]。載脂蛋白在調節血脂發揮重要的作用，也被認為與DR的發生相關。此外，許多炎癥因子在DR發生中有重要的作用。Vujosevic等[36]采用蛋白質芯片測試一組糖尿病未發生DR、輕度DR患者和正常人房水中膠質細胞相關的炎癥因子，發現糖尿病患者未發生DR的IL-1β和IL-3、干擾素γ、單核細胞趨化蛋白較正常人增加；輕度DR患者集落刺激因子、趨化因子、腫瘤壞死因子-RⅡ較正常人和糖尿病未發生DR患者顯著增加。這些炎癥因子在發生糖尿病和DR時表達升高，說明DR的發生與視網膜神經膠質細胞的激活相關。Chiang等[37]發現DR患者房水中載脂蛋白-1、血清鐵轉運蛋白和生長因子受體蛋白-10等11種蛋白質較糖尿病未發生DR患者升高；這些蛋白質具有運輸營養，重組細胞微結構，血管生成，抗氧化和神經保護作用。Loukovaara等[38]比較了NPDR、PDR患者玻璃體蛋白質，發現PDR中較NPDR升高的蛋白質來自補體、絲氨酸蛋白酶抑制劑家族、載脂蛋白和蛋白酶抑制劑等。作者認為，補體、凝血級聯因子和血漿激肽釋放酶激肽系統在DR的發病中起重要作用。另外，也有學者同時收集患者玻璃體和血標本，觀察玻璃體中蛋白差異是否也存在于血漿中。Kim等[39, 40]分析NPDR、PDR和黃斑裂孔患者玻璃體、血漿中蛋白質表達情況，發現31個差異表達蛋白，NPDR、PDR患者的玻璃體和血漿中甲狀腺結合蛋白較黃斑裂孔患者升高。
3 藥物治療與DR蛋白質組學
隨著近年抗VEGF藥物治療的普及，部分DR患者病情得到緩解，但仍有部分DR患者療效并不理想，抗VEGF作用機制也尚不明確。因此，越來越多的學者希望通過蛋白質組學技術探索抗VEGF治療DR的機制和尋找新的治療靶點。Zou等[41]觀察了雷珠單抗玻璃體腔注射前后玻璃體蛋白表達變化，發現抗VEGF藥物治療除降低VEGF表達水平外，還能降低載脂蛋白C1和血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑, 這些蛋白質在脂蛋白代謝以及促進炎癥、血管生成、細胞生長和細胞骨架完整性方面發揮關鍵作用。其中，參與血小板脫顆粒行為的12個蛋白在治療后降低程度明顯，提示抗VEGF藥物治療通過抑制血小板的脫顆粒調節血液凝固狀態，抗血栓治療可能對PDR有保護作用。Jo等[42]分別對VEGF誘導組、VEGF誘導+抗VEGF組、正常對照組大鼠的蛋白表達譜進行了鑒定，發現β2整合蛋白、肌動蛋白細胞骨架、活化氧自由基和纖維組織在抗VEGF之后發生改變，通過蛋白質相互作用網絡發現，β2整合蛋白可以改變肌動蛋白細胞骨架和細胞之間的連接。β2整合蛋白在注射VEGF時上調，而抗VEGF時出現下調。抗β2整合蛋白減輕VEGF誘導組大鼠滲漏情況并且抑制纖連蛋白-β2整合素蛋白通路，說明β2整合蛋白可能是抗VEGF的作用靶點。Loukovaara等[38]比較NPDR、PDR患者玻璃體腔注射貝伐單抗后玻璃體蛋白改變情況，發現PDR患者的細胞黏附蛋白、胰島素通路相關蛋白、三磷酸腺苷酶激活蛋白和載脂蛋白較未治療者下調，提示非甾體類消炎藥、糖皮質激素、他汀等降低載脂蛋白藥物對PDR可能具有保護作用；而補體、凝結物、激肽-激肽釋放酶串聯蛋白未見改變，說明激肽釋放酶激肽途徑可能是獨立于VEGF發揮作用。這些研究不僅對抗VEGF有了更深入的認識，還將視線轉移到了激肽釋放酶激肽途徑。如Gao等[43]發現PDR患者玻璃體中碳酸酐酶-1較NPDR患者和正常人高。將碳酸酐酶-1注射到糖尿病小鼠玻璃體后，發現激肽釋放酶活性增加，從而觸發了因子Ⅻ介導的DME。在糖尿病小鼠中使用補體1抑制劑，前激肽釋放酶的中和抗體和緩激肽受體拮抗劑，減輕DME，說明碳酸酐酶-1與PDR的發病相關。此外，Gao等[44]應用血管緊張素受體阻滯劑坎地沙坦治療糖尿病大鼠后，可將玻璃體異常表達蛋白正常化。研究已證實坎地沙坦可降低1型糖尿病患者DR的發生率[45]，而在2型糖尿病和輕度至中度視網膜病變患者中，坎地沙坦治療可減少DR進展34%[46]。
4 展望
近年隨著蛋白質組學技術的進步，可鑒定的蛋白質種類特別是低豐度蛋白種類不斷增加，更多DR相關的差異表達蛋白質和生物學標記物被發現，如載脂蛋白、晶體蛋白，已成為診斷DR的生物標記物。而在治療方面，PDR的蛋白質組研究已經鑒定出潛在治療靶標，如碳酸酐酶-I；更有研究已經證實，血管緊張素受體Ⅱ拮抗劑可逆轉糖尿病所致的蛋白質組變化，而這與臨床試驗結果相符。目前，關于DR的蛋白質組學的研究，針對PDR者較深入，而針對NPDR和DME的研究較少。此外，地塞米松玻璃體內植入物治療DR后相關蛋白質組學改變也有待研究；而抗VEGF藥物治療也需要進一步探索其治療的作用機制。由于蛋白質組學技術的局限性，目前尚不能用某種單一的技術手段鑒定出樣品中所有的蛋白質。相信隨著醫學與實驗技術的更新，會有更多與DR相關的蛋白被發現，同時通過大樣本量驗證差異蛋白，使其成為臨床診斷、治療和預后相關的標記物和靶點。