血管內皮生長因子（VEGF）、血小板源性生長因子（PDGF）和補體在老年性黃斑變性（AMD）的發病過程中發揮著重要作用。以VEGF165為靶分子獲取的適配體哌加他尼鈉已獲美國食品與藥品管理局批準用于滲出型AMD的治療；而以PDGF-B、補體C5為靶分子獲取的適配體E10030、ARC1905也已進入臨床試驗階段，并均獲得較好療效。目前，針對AMD發病機制中多個作用靶點的聯合治療已成為AMD治療的發展方向；多靶點拮抗的適配體目前已進入研發階段，將可能成為AMD治療的首選藥物。
引用本文： 盧建民, 孫曉晶, 馬翔. 適配體及其在老年性黃斑變性治療中的應用現狀. 中華眼底病雜志, 2017, 33(4): 427-430. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.04.028 復制
隨著抗血管內皮生長因子（VEGF）抗體或受體融合蛋白類藥物的出現，滲出型老年性黃斑變性（AMD）的治療已取得較大進展；但這類藥物隨治療時間延長，療效逐漸降低[1]。尋求治療AMD的新藥物具有重要的臨床意義。核酸不僅能承載和傳遞生物遺傳信息，還可以藉其自身空間結構與其他分子相互作用[2]。近年來，以此為技術原理的適配體技術取得了突飛猛進的發展，并已應用于疾病的檢測及治療。目前，與眼科疾病相關的適配體共計6種，而已應用于臨床的僅哌加他尼鈉、E10030和ARC1905 3種，且全部用于AMD的治療[3]。現就適配體及其在AMD治療中的應用現狀作一綜述。
1 適配體及其生物學特性
適配體是能與靶分子特異性結合的單鏈核酸，長約20～80個堿基對，相對分子質量約為5～30×103。Tuerk和Gold[4]以及Ellington和Szostak[5]應用指數富集配體進化技術（SELEX）從人工合成的單鏈核酸文庫中篩選出能與細菌噬菌體T4 DNA聚合酶以及有機染料特異結合的RNA，并首次提出適配體的概念。處于溶液內的適配體，尤其在靶分子同時存在的情況下，自身堿基配對發生適應性折疊，形成各種熱力學穩定的二級和三級空間結構，如發夾、莖環、假結、凸起、G-四聚體等。適配體與靶分子空間構型互補特異性結合，并輔以“假堿基對”堆積力、氫鍵、疏水、靜電、范德華力等作用，形成穩定復合物[2]。
SELEX是最早建立的適配體篩選技術，其基本過程是首先設計和人工合成單鏈核酸文庫，并保證核酸的兩端為結合引物的固定序列，中間為隨機序列；然后在緩沖液內將核酸文庫與靶分子孵育，并將與靶分子結合和未結合的核酸分離；再將與靶分子結合的核酸洗脫下來，并對其進行擴增；經結合、分離、洗脫和擴增8～20個循環后即可得到能特異性識別靶分子的核酸文庫，在完成克隆、測序和鑒定后即獲得適配體。經過多年研發，目前SELEX已初步實現了篩選流程自動化、篩選形式多樣化和篩選結果快速化[6]。
適配體和靶分子識別結合與抗體抗原反應類似，并具備眾多獨特優勢：（1）作用范圍廣，靶分子不再局限于蛋白質核酸分子，而擴展至有機染料、金屬離子、細胞、藥物、病毒、細菌、寄生蟲等幾乎所有物質種類；（2）特異性強、親和力高，可識別靶分子結構中類似一個基團的細微變化，且其解離指數可達到納摩爾甚至皮摩爾水平；（3）分子量小、穩定性好，可輕易穿過細胞膜進入細胞內，并能在常溫下保存運輸；（4）制備簡便，僅需化學合成體外篩選，周期短、費用低、重復性好，無批間差異、無免疫原性，可反復應用，且易于功能化修飾與標記[7]。
基于適配體與靶分子特異性結合的原理，目前適配體已廣泛應用于分析化學、基因調控、蛋白組學、新藥研發等方面。而在臨床方面，主要應用于疾病的檢測及治療。疾病檢測方面，與疾病標記物特異性結合并顯示，如檢測腦鈉肽、C反應蛋白評估心血管疾病，檢測多種腫瘤細胞特異性標記物輔助診斷，檢測病毒、細菌、寄生蟲等輔助病原學診斷，聯合納米材料靶向活體示蹤顯影腫瘤等。疾病治療方面，與疾病關鍵分子活性部位結合并抑制其功能，如與凝血酶結合治療血栓性疾病，與腫瘤形成相關分子結合抑制腫瘤生長，與病毒外膜蛋白、逆轉錄酶結合抗病毒，與炎性介質結合抑制炎癥等[8]。
2 適配體在AMD治療中的應用
鑒于VEGF165、血小板源性生長因子（PDGF）-B以及補體C5促進AMD發生發展，以這些因子為靶分子獲取的適配體也必然能成為AMD的治療用藥。目前，哌加他尼鈉（商品名Macugen）已獲得美國食品和藥品管理局（FDA）批準用于治療滲出型AMD，而E10030（商品名Fovista）和ARC1905（商品名Zimura）也已進入臨床試驗階段。
2.1 哌加他尼鈉
VEGF165是VEGF-A功能最強的亞型，與VEGF受體2結合后，發揮強效促血管新生作用。Wang等[9]將負載VEGF165的腺病毒注射至大鼠視網膜下腔，發現視網膜色素上皮（RPE）細胞高表達VEGF，脈絡膜新生血管（CNV）穿過Bruch膜進入視網膜下腔，引發光感受器細胞死亡。熒光素眼底血管造影顯示視網膜血管滲漏，視網膜電圖顯示a、b波振幅降低，這與AMD病程以及體征完全吻合。說明VEGF165在AMD發病機制中具有重要作用。
Jellinek等[10]應用SELEX獲得VEGF165適配體，并經3年不斷改進使其在穩定性以及生物利用度上顯著提高，最終形成含有28個堿基對的RNA適配體，并命名為哌加他尼鈉、NX1838或EYE001。臨床前期試驗表明，哌加他尼鈉可特異性結合VEGF165，并有效阻止血管內皮細胞VEGF受體磷酸化，鈣離子內流以及細胞增生[11]。此外，不同物種動物玻璃體腔注射哌加他尼鈉后未出現心血管、神經以及生殖發育系統異常，眼底新生血管得到有效抑制[12-14]。
在Ⅰ期臨床試驗中，15例滲出型AMD患者接受玻璃體腔注射哌加他尼鈉治療，3個月后未發現藥物相關性毒副作用，且12例患者視力提高[13]。Ⅱ期臨床試驗結果表明，單獨玻璃體腔注射哌加他尼鈉或聯合光動力療法治療滲出型AMD的療效明顯優于單獨光動力療法[15]。在隨后的多中心隨機雙盲Ⅲ期臨床試驗中，1186例滲出型AMD患者接受玻璃體腔注射哌加他尼鈉治療，每6周注射1次，共計9次，患者視力提高程度明顯優于假注射組，療效可持續1年，且與注射劑量無關[16, 17]。鑒于哌加他尼鈉治療滲出型AMD的卓越療效以及良好安全性，2004年11月FDA批準哌加他尼鈉治療滲出型AMD，成為第一個獲批準的適配體藥物以及眼科抗VEGF藥物。
2006年以后，迅猛發展的VEGF抗體或受體融合蛋白類藥物逐步取代哌加他尼鈉，成為治療滲出型AMD首選抗VEGF藥物，包括拮抗VEGF-A的貝伐單抗和雷珠單抗，以及VEGF受體1/2不同結構域和人免疫球蛋白Fc融合蛋白的阿柏西普和康柏西普。研究表明，應用哌加他尼鈉治療1年后，6%的患者視力提高15個及以上字母[16]。而應用貝伐單抗、雷珠單抗、阿柏西普和康柏西普治療1年后，30%以上的患者視力提高15個及以上字母[18-21]。但哌加他尼鈉的重復注射次數明顯多于貝伐單抗和雷珠單抗，這造成了哌加他尼鈉經濟成本效益較低[22-24]。此外，對于病灶直徑小于4500 μm的AMD，哌加他尼鈉和雷珠單抗在視力改善程度方面無統計學差異[25]。分析原因可能與VEGF抗體或受體融合蛋白類藥物拮抗多種VEGF，而哌加他尼鈉僅拮抗VEGF165及其藥物半衰期更短相關。
然而，有研究表明VEGF-A或其受體敲除后，動物無法成活，VEGF-A還發揮著維持視網膜神經元存活以及脈絡膜毛細血管正常形態的作用[26-28]。雖然VEGF-A高表達可介導CNV形成，但在生理條件下同樣發揮著極其重要的作用。如長時間完全拮抗VEGF-A可能存在隱患。因此，有學者認為哌加他尼鈉將可能成為治療滲出型AMD的維持用藥[29-31]。
2.2 E10030
研究表明，被VEGF活化后的血管內皮細胞可分泌大量PDGF-B，趨化周細胞、平滑肌細胞甚至血管內皮細胞，并促其增生，引起新生血管出芽及發育[32]。當選擇性阻斷PDGF-B時，可有效抑制激光誘導的CNV形成，且與VEGF抗體聯合應用時，具有協同抗血管生成作用[33]。因此，PDGF-B可作為AMD治療新靶點。
1995年，Green等[34]以PDGF-AB為靶分子應用SELEX獲得適配體，并發現該適配體僅與PDGF-B特異性結合，并阻礙其與受體結合。后經不斷改進，最終形成含有29個堿基對的DNA適配體，命名為NX1975、ARC127或E10030。在Ⅰ期臨床試驗中，23例滲出型AMD患者接受玻璃體腔注射雷珠單抗聯合E10030治療，3個月后未發現任何不良反應，且59%的患者視力提高15個及以上字母，視網膜中心厚度下降38.9%；并首次發現患者CNV消退，且面積達85.5%[35]。Ⅱ期臨床試驗結果顯示，449例滲出型AMD患者接受玻璃體腔注射雷珠單抗聯合E10030或單獨雷珠單抗治療，6個月后發現應用E10030的患者較未應用E10030者視力多提高4.1個字母[36]。目前Ⅲ期臨床試驗正在進行中，滲出型AMD患者將接受為期12個月的玻璃體腔注射貝伐單抗、雷珠單抗或阿普西柏聯合E10030治療。
2.3 ARC1905
研究發現，AMD患者視網膜脈絡膜以及血漿內補體C3、C5a和攻膜復合物較同齡正常人明顯增多，且與病情呈正相關[37, 38]。進一步研究表明，補體C5a可通過炎癥趨化作用導致多種炎癥細胞浸潤，并刺激巨噬細胞以及RPE細胞釋放VEGF，進而共同促進CNV發生發展[39-41]。此外，補體C5a還可通過脂褐素介導的光氧化反應，導致RPE細胞變性凋亡[42]。如在激光誘導CNV過程中抑制C5a作用，可導致VEGF濃度明顯下降，CNV減少[40, 43]。
1998年，Biesecker等[44]應用SELEX獲取人類補體C5的適配體，并發現該適配體可以阻礙C5裂解，進而抑制補體下游級聯效應。后經不斷改進，最終形成含有39個堿基對的RNA適配體，命名為ARC1905。在Ⅰ期臨床試驗中，43例滲出型AMD患者接受玻璃體腔注射雷珠單抗聯合ARC1905治療，6個月后未發現任何不良反應，且視力提高程度以及黃斑中心凹厚度降低程度與ARC1905劑量呈正相關[45]。ARC1905治療萎縮型AMD的Ⅰ期臨床試驗已于2013年12月結束，但至今未見相關結果報道；而相關Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗已于2016年2月啟動。
隨著抗血管內皮生長因子（VEGF）抗體或受體融合蛋白類藥物的出現，滲出型老年性黃斑變性（AMD）的治療已取得較大進展；但這類藥物隨治療時間延長，療效逐漸降低[1]。尋求治療AMD的新藥物具有重要的臨床意義。核酸不僅能承載和傳遞生物遺傳信息，還可以藉其自身空間結構與其他分子相互作用[2]。近年來，以此為技術原理的適配體技術取得了突飛猛進的發展，并已應用于疾病的檢測及治療。目前，與眼科疾病相關的適配體共計6種，而已應用于臨床的僅哌加他尼鈉、E10030和ARC1905 3種，且全部用于AMD的治療[3]。現就適配體及其在AMD治療中的應用現狀作一綜述。
1 適配體及其生物學特性
適配體是能與靶分子特異性結合的單鏈核酸，長約20～80個堿基對，相對分子質量約為5～30×103。Tuerk和Gold[4]以及Ellington和Szostak[5]應用指數富集配體進化技術（SELEX）從人工合成的單鏈核酸文庫中篩選出能與細菌噬菌體T4 DNA聚合酶以及有機染料特異結合的RNA，并首次提出適配體的概念。處于溶液內的適配體，尤其在靶分子同時存在的情況下，自身堿基配對發生適應性折疊，形成各種熱力學穩定的二級和三級空間結構，如發夾、莖環、假結、凸起、G-四聚體等。適配體與靶分子空間構型互補特異性結合，并輔以“假堿基對”堆積力、氫鍵、疏水、靜電、范德華力等作用，形成穩定復合物[2]。
SELEX是最早建立的適配體篩選技術，其基本過程是首先設計和人工合成單鏈核酸文庫，并保證核酸的兩端為結合引物的固定序列，中間為隨機序列；然后在緩沖液內將核酸文庫與靶分子孵育，并將與靶分子結合和未結合的核酸分離；再將與靶分子結合的核酸洗脫下來，并對其進行擴增；經結合、分離、洗脫和擴增8～20個循環后即可得到能特異性識別靶分子的核酸文庫，在完成克隆、測序和鑒定后即獲得適配體。經過多年研發，目前SELEX已初步實現了篩選流程自動化、篩選形式多樣化和篩選結果快速化[6]。
適配體和靶分子識別結合與抗體抗原反應類似，并具備眾多獨特優勢：（1）作用范圍廣，靶分子不再局限于蛋白質核酸分子，而擴展至有機染料、金屬離子、細胞、藥物、病毒、細菌、寄生蟲等幾乎所有物質種類；（2）特異性強、親和力高，可識別靶分子結構中類似一個基團的細微變化，且其解離指數可達到納摩爾甚至皮摩爾水平；（3）分子量小、穩定性好，可輕易穿過細胞膜進入細胞內，并能在常溫下保存運輸；（4）制備簡便，僅需化學合成體外篩選，周期短、費用低、重復性好，無批間差異、無免疫原性，可反復應用，且易于功能化修飾與標記[7]。
基于適配體與靶分子特異性結合的原理，目前適配體已廣泛應用于分析化學、基因調控、蛋白組學、新藥研發等方面。而在臨床方面，主要應用于疾病的檢測及治療。疾病檢測方面，與疾病標記物特異性結合并顯示，如檢測腦鈉肽、C反應蛋白評估心血管疾病，檢測多種腫瘤細胞特異性標記物輔助診斷，檢測病毒、細菌、寄生蟲等輔助病原學診斷，聯合納米材料靶向活體示蹤顯影腫瘤等。疾病治療方面，與疾病關鍵分子活性部位結合并抑制其功能，如與凝血酶結合治療血栓性疾病，與腫瘤形成相關分子結合抑制腫瘤生長，與病毒外膜蛋白、逆轉錄酶結合抗病毒，與炎性介質結合抑制炎癥等[8]。
2 適配體在AMD治療中的應用
鑒于VEGF165、血小板源性生長因子（PDGF）-B以及補體C5促進AMD發生發展，以這些因子為靶分子獲取的適配體也必然能成為AMD的治療用藥。目前，哌加他尼鈉（商品名Macugen）已獲得美國食品和藥品管理局（FDA）批準用于治療滲出型AMD，而E10030（商品名Fovista）和ARC1905（商品名Zimura）也已進入臨床試驗階段。
2.1 哌加他尼鈉
VEGF165是VEGF-A功能最強的亞型，與VEGF受體2結合后，發揮強效促血管新生作用。Wang等[9]將負載VEGF165的腺病毒注射至大鼠視網膜下腔，發現視網膜色素上皮（RPE）細胞高表達VEGF，脈絡膜新生血管（CNV）穿過Bruch膜進入視網膜下腔，引發光感受器細胞死亡。熒光素眼底血管造影顯示視網膜血管滲漏，視網膜電圖顯示a、b波振幅降低，這與AMD病程以及體征完全吻合。說明VEGF165在AMD發病機制中具有重要作用。
Jellinek等[10]應用SELEX獲得VEGF165適配體，并經3年不斷改進使其在穩定性以及生物利用度上顯著提高，最終形成含有28個堿基對的RNA適配體，并命名為哌加他尼鈉、NX1838或EYE001。臨床前期試驗表明，哌加他尼鈉可特異性結合VEGF165，并有效阻止血管內皮細胞VEGF受體磷酸化，鈣離子內流以及細胞增生[11]。此外，不同物種動物玻璃體腔注射哌加他尼鈉后未出現心血管、神經以及生殖發育系統異常，眼底新生血管得到有效抑制[12-14]。
在Ⅰ期臨床試驗中，15例滲出型AMD患者接受玻璃體腔注射哌加他尼鈉治療，3個月后未發現藥物相關性毒副作用，且12例患者視力提高[13]。Ⅱ期臨床試驗結果表明，單獨玻璃體腔注射哌加他尼鈉或聯合光動力療法治療滲出型AMD的療效明顯優于單獨光動力療法[15]。在隨后的多中心隨機雙盲Ⅲ期臨床試驗中，1186例滲出型AMD患者接受玻璃體腔注射哌加他尼鈉治療，每6周注射1次，共計9次，患者視力提高程度明顯優于假注射組，療效可持續1年，且與注射劑量無關[16, 17]。鑒于哌加他尼鈉治療滲出型AMD的卓越療效以及良好安全性，2004年11月FDA批準哌加他尼鈉治療滲出型AMD，成為第一個獲批準的適配體藥物以及眼科抗VEGF藥物。
2006年以后，迅猛發展的VEGF抗體或受體融合蛋白類藥物逐步取代哌加他尼鈉，成為治療滲出型AMD首選抗VEGF藥物，包括拮抗VEGF-A的貝伐單抗和雷珠單抗，以及VEGF受體1/2不同結構域和人免疫球蛋白Fc融合蛋白的阿柏西普和康柏西普。研究表明，應用哌加他尼鈉治療1年后，6%的患者視力提高15個及以上字母[16]。而應用貝伐單抗、雷珠單抗、阿柏西普和康柏西普治療1年后，30%以上的患者視力提高15個及以上字母[18-21]。但哌加他尼鈉的重復注射次數明顯多于貝伐單抗和雷珠單抗，這造成了哌加他尼鈉經濟成本效益較低[22-24]。此外，對于病灶直徑小于4500 μm的AMD，哌加他尼鈉和雷珠單抗在視力改善程度方面無統計學差異[25]。分析原因可能與VEGF抗體或受體融合蛋白類藥物拮抗多種VEGF，而哌加他尼鈉僅拮抗VEGF165及其藥物半衰期更短相關。
然而，有研究表明VEGF-A或其受體敲除后，動物無法成活，VEGF-A還發揮著維持視網膜神經元存活以及脈絡膜毛細血管正常形態的作用[26-28]。雖然VEGF-A高表達可介導CNV形成，但在生理條件下同樣發揮著極其重要的作用。如長時間完全拮抗VEGF-A可能存在隱患。因此，有學者認為哌加他尼鈉將可能成為治療滲出型AMD的維持用藥[29-31]。
2.2 E10030
研究表明，被VEGF活化后的血管內皮細胞可分泌大量PDGF-B，趨化周細胞、平滑肌細胞甚至血管內皮細胞，并促其增生，引起新生血管出芽及發育[32]。當選擇性阻斷PDGF-B時，可有效抑制激光誘導的CNV形成，且與VEGF抗體聯合應用時，具有協同抗血管生成作用[33]。因此，PDGF-B可作為AMD治療新靶點。
1995年，Green等[34]以PDGF-AB為靶分子應用SELEX獲得適配體，并發現該適配體僅與PDGF-B特異性結合，并阻礙其與受體結合。后經不斷改進，最終形成含有29個堿基對的DNA適配體，命名為NX1975、ARC127或E10030。在Ⅰ期臨床試驗中，23例滲出型AMD患者接受玻璃體腔注射雷珠單抗聯合E10030治療，3個月后未發現任何不良反應，且59%的患者視力提高15個及以上字母，視網膜中心厚度下降38.9%；并首次發現患者CNV消退，且面積達85.5%[35]。Ⅱ期臨床試驗結果顯示，449例滲出型AMD患者接受玻璃體腔注射雷珠單抗聯合E10030或單獨雷珠單抗治療，6個月后發現應用E10030的患者較未應用E10030者視力多提高4.1個字母[36]。目前Ⅲ期臨床試驗正在進行中，滲出型AMD患者將接受為期12個月的玻璃體腔注射貝伐單抗、雷珠單抗或阿普西柏聯合E10030治療。
2.3 ARC1905
研究發現，AMD患者視網膜脈絡膜以及血漿內補體C3、C5a和攻膜復合物較同齡正常人明顯增多，且與病情呈正相關[37, 38]。進一步研究表明，補體C5a可通過炎癥趨化作用導致多種炎癥細胞浸潤，并刺激巨噬細胞以及RPE細胞釋放VEGF，進而共同促進CNV發生發展[39-41]。此外，補體C5a還可通過脂褐素介導的光氧化反應，導致RPE細胞變性凋亡[42]。如在激光誘導CNV過程中抑制C5a作用，可導致VEGF濃度明顯下降，CNV減少[40, 43]。
1998年，Biesecker等[44]應用SELEX獲取人類補體C5的適配體，并發現該適配體可以阻礙C5裂解，進而抑制補體下游級聯效應。后經不斷改進，最終形成含有39個堿基對的RNA適配體，命名為ARC1905。在Ⅰ期臨床試驗中，43例滲出型AMD患者接受玻璃體腔注射雷珠單抗聯合ARC1905治療，6個月后未發現任何不良反應，且視力提高程度以及黃斑中心凹厚度降低程度與ARC1905劑量呈正相關[45]。ARC1905治療萎縮型AMD的Ⅰ期臨床試驗已于2013年12月結束，但至今未見相關結果報道；而相關Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗已于2016年2月啟動。