引用本文： 謝兵, 蔡善君, 鄭志涌. 家族性玻璃體淀粉樣變性甲狀腺激素結合蛋白Gly83Arg突變一家系. 中華眼底病雜志, 2016, 32(3): 312-314. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.03.021 復制
家族性玻璃體淀粉樣變性(FTA)屬常染色體顯性遺傳性疾病，因淀粉樣物質在玻璃體沉積致病[1]。研究最多并與眼部淀粉樣變性特別是與玻璃體淀粉樣變性密切相關的基因為甲狀腺激素結合蛋白(TTR)；目前已知和淀粉樣變性相關的TTR基因突變有100多種[2]。但其突變位點多樣化，存在著地域差異性。我們發現了一漢族家系FTA患者，并對其TTR基因外顯子進行測序。現將結果報道如下。
1 對象和方法
2015年6~7月在遵義醫學院附屬醫院進行FTA家系調查的一漢族家系納入本研究。該家系現有成員16人。其中，男性6人，女性10人；年齡15～72歲，平均年齡34歲。納入和排除標準：(1)均來自同一家系；(2)均排除葡萄膜炎、玻璃體積血、Terson綜合征以及眼外傷導致玻璃體混濁：(3)經全身檢查排除大腦、腎臟、心臟、消化系統、皮膚及多神經病變的全身淀粉樣變性；(4)經眼部檢查排除結膜淀粉樣變性、眼壓升高、眼前節淀粉樣物質沉積等。家系成員16人中，除先證者表現為雙眼玻璃體淀粉樣變性復發外，其余成員雙眼玻璃體透明、眼底正常。
先證者女，48歲。右眼視物不清7年，左眼視力漸進性下降6個月。10年前曾在我院診斷為雙眼玻璃體混濁并行雙眼玻璃體切割手術。但由于當時對該病缺乏認識，手術中未留取玻璃體標本行實驗室檢測。其母親在40歲時雙眼視力逐漸喪失，未檢查及治療，63歲死亡，具體死因不詳。全身檢查無異常。右眼視力0.12，左眼視力0.5。雙眼眼瞼及結膜無異常，角膜透明，前房深度正常，虹膜紋理清晰，瞳孔等大正圓，對光反射靈敏，晶狀體后囊下混濁。眼底及玻璃體檢查，右眼見圍繞視盤及血管弓的環形玻璃體灰白色絨狀混濁，周邊玻璃體絨狀混濁，血管旁見足盤狀混濁(圖 1)。左眼血管旁多發足盤狀混濁(圖 2)。右眼、左眼眼壓分別為21、50 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。超聲生物顯微鏡檢查，右眼、左眼中央前房深度分別為2.99、3.02 mm。雙眼房角均開放。診斷為左眼青光眼、雙眼白內障、雙眼玻璃體淀粉樣變性復發。對其左眼行白內障超聲乳化摘除、人工晶狀體植入、小梁切除及虹膜周邊切除手術。手術后左眼視力0.6，眼壓12 mmHg。手術后對其家系進行調查，繪制遺傳病家系圖(圖 3)。
圖1
先證者右眼彩色眼底像。1A.圍繞視盤的環形玻璃體灰白色絨狀混濁；1B.血管旁見足盤狀混濁??圖 2??先證者左眼彩色眼底像。血管旁多發足盤狀混濁??圖 3??家系圖。□：正常男性；○：正常女性；●：女性患者；：先證者
本研究遵循赫爾辛基宣言并取得所有受檢者的知情同意。對家系成員Ⅰ2、Ⅱ2~Ⅱ6、Ⅲ3、Ⅲ6、Ⅲ7、Ⅲ9以及與其共同生活、無遺傳性疾病的配偶行TTR基因外顯子檢測。采集受檢者外周靜脈全血2 ml，采用全血基因組DNA提取試劑盒(生工生物工程上海股份有限公司)提取DNA并編號。采用聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀(美國ABI公司)擴增TTR基因全部4個外顯子。參照文獻[3]的方法設計引物序列。外顯子1：上游引物5′-TTGGTTGTTTTGTTTTGGTGA-3′，下游引物5′-GCC CTAGTAATGCTGGTT-3′，擴增片段長度為436堿基對(bp)；外顯子2：上游引物5′-TGTAATTCTTGTTTCGCT CCA-3′，下游引物5′-CTCTGCCTACGTTTTTCAATCTA-3′，擴增片段長度為356 bp；外顯子3：上游引物5′-TGACTTAGTTGAGGGGAAATGTT-3′，下游引物5′-CACCTTCCTTAGGA CATTTCTG-3′，擴增片段長度為379 bp；外顯子4：上游引物5′-AATTAATTAAGTTGGCACTGGAC-3′，下游引物5′-CCT GGGCAACAGAGTGAGA-3′，擴增片段長度為703 bp。PCR反應總體系為50μl。反應條件：95℃預變性3 min，94℃變性30 s，55～60℃退火35 s, 72℃延伸40～50 s，72℃修復延伸5～8 min；共35個循環。取4μl擴增產物在Tris-硼酸緩沖液配制的1%瓊脂糖凝膠中進行電泳觀察，采用全自動凝膠成像圖像分析儀(美國Syngene公司)證實為所需長度的產物片段。將PCR反應液50μl在1%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳電壓90 V(低壓電泳儀DYY-8C型，北京六一儀器廠)，將PCR產物純化回收(生工生物工程上海股份有限公司SK1141)。將純化回收后產物進行編號及測序，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序(3730型測序儀，美國ABI公司)。采用SeqMan軟件和Chromas測序圖分析軟件對測序結果進行分析。并將其與正常人類TTR基因完全序列的4個外顯子進行完全比對[4]。
2 結果
測序分析結果顯示，在先證者和家系成員Ⅲ7的第3個外顯子107位G峰下方出現一個套峰，套峰為C堿基峰(圖 4)。表現為第83位氨基酸發生部分點突變，由GGC部分突變為CGC，甘氨酸部分被精氨酸取代(Gly103Arg)。突變形式表現為雜合子突變。其余受檢者未發現該位點基因突變(圖 5)。
圖4
先證者及家系成員Ⅲ7 TTR基因第3外顯子測序峰圖。107位堿基處出現雜合突變(黑箭)，第83位氨基酸發生部分點突變，由GGC部分突變為CGC，甘氨酸部分被精氨酸取代(Gly103Arg) ??圖 5??其余受檢者TTR基因第3外顯子測序峰圖。107位堿基處未出現雜合突變(黑箭)
3 討論
FTA屬常染色體顯性遺傳性疾病。本研究納入家系目前僅有1人患病，但我們通過TTR基因外顯子的檢測證實了該漢族家系的基因突變位點及突變形式。
目前已發現與淀粉樣變性有關的TTR基因突變有100多種[2]。DNA直接測序分析發現99%的突變集中在第2、3、4外顯子，最常見的突變位置是Val30Met，即纈氨酸被蛋氨酸取代，呈全球性分布；其他較為常見的突變位點有Val28Met、Leu58His、Leu58Arg、Lys78Phe、Ile84Ser、Tyr114His、Trp41Leu、Tyr69His、Asp18Glu、Val30Gly、Gly67Glu等。近年來國內報道了一些新發現及少見的突變位點有Arg54Gly[4]、Gly83Arg[5]、Ala36Pro[6]、Lys35Thr和Leu55Arg[7]、Tyr114Cys[8]、Val30Ala[9]。謝兵等[10]報道了8例患者的漢族家系TTR基因Gly83Arg雜合子突變。Zhang等[11]報道了3個漢族家系的G83R雜合子突變。Liu等[12]亦報道了同一家系12例Gly83Arg雜合子突變。我們在排除該家系成員葡萄膜炎、玻璃體積血、Terson綜合征以及眼外傷導致的玻璃體混濁后，采用DNA直接測序方法對10名家系成員進行了TTR基因檢測。為排除單核甘酸多態性和環境導致基因突變，同時還選取了與該家系成員共同生活、無遺傳性疾病的配偶進行對比研究，證實在先證者和家系成員Ⅲ7的第3外顯子83位點發生雜合子突變，由GGC突變為CGC，測序峰圖上表現為套峰。而在其他家系成員中，該位點沒有套峰出現。這一TTR基因突變位點及突變形式在國外其他種族尚無報道，在國內已有謝兵等[10]、Zhang等[11]、Liu等[12]相繼報道，均發生于我國的漢族家系中。我們推測該突變位點及突變形式或許是我國漢族家系玻璃體淀粉樣變性的特有突變形式。
本研究證實了該家系玻璃體淀粉樣變性是由TTR基因Gly83Arg雜合子突變所致，但該家系目前只有1人發病，我們推測第3代個體可能尚未到發病年齡，對該家系尚需加強隨訪及追蹤觀察。另外值得注意的是，由于10年前我們對該病缺乏認識，手術中未能提取玻璃體標本進行實驗室檢測，缺乏確診的剛果紅染色圖像資料。而先證者此次就診未接受玻璃體切割手術。提醒我們應在以后的臨床工作中注重對實驗檢材的提取。
家族性玻璃體淀粉樣變性(FTA)屬常染色體顯性遺傳性疾病，因淀粉樣物質在玻璃體沉積致病[1]。研究最多并與眼部淀粉樣變性特別是與玻璃體淀粉樣變性密切相關的基因為甲狀腺激素結合蛋白(TTR)；目前已知和淀粉樣變性相關的TTR基因突變有100多種[2]。但其突變位點多樣化，存在著地域差異性。我們發現了一漢族家系FTA患者，并對其TTR基因外顯子進行測序。現將結果報道如下。
1 對象和方法
2015年6~7月在遵義醫學院附屬醫院進行FTA家系調查的一漢族家系納入本研究。該家系現有成員16人。其中，男性6人，女性10人；年齡15～72歲，平均年齡34歲。納入和排除標準：(1)均來自同一家系；(2)均排除葡萄膜炎、玻璃體積血、Terson綜合征以及眼外傷導致玻璃體混濁：(3)經全身檢查排除大腦、腎臟、心臟、消化系統、皮膚及多神經病變的全身淀粉樣變性；(4)經眼部檢查排除結膜淀粉樣變性、眼壓升高、眼前節淀粉樣物質沉積等。家系成員16人中，除先證者表現為雙眼玻璃體淀粉樣變性復發外，其余成員雙眼玻璃體透明、眼底正常。
先證者女，48歲。右眼視物不清7年，左眼視力漸進性下降6個月。10年前曾在我院診斷為雙眼玻璃體混濁并行雙眼玻璃體切割手術。但由于當時對該病缺乏認識，手術中未留取玻璃體標本行實驗室檢測。其母親在40歲時雙眼視力逐漸喪失，未檢查及治療，63歲死亡，具體死因不詳。全身檢查無異常。右眼視力0.12，左眼視力0.5。雙眼眼瞼及結膜無異常，角膜透明，前房深度正常，虹膜紋理清晰，瞳孔等大正圓，對光反射靈敏，晶狀體后囊下混濁。眼底及玻璃體檢查，右眼見圍繞視盤及血管弓的環形玻璃體灰白色絨狀混濁，周邊玻璃體絨狀混濁，血管旁見足盤狀混濁(圖 1)。左眼血管旁多發足盤狀混濁(圖 2)。右眼、左眼眼壓分別為21、50 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。超聲生物顯微鏡檢查，右眼、左眼中央前房深度分別為2.99、3.02 mm。雙眼房角均開放。診斷為左眼青光眼、雙眼白內障、雙眼玻璃體淀粉樣變性復發。對其左眼行白內障超聲乳化摘除、人工晶狀體植入、小梁切除及虹膜周邊切除手術。手術后左眼視力0.6，眼壓12 mmHg。手術后對其家系進行調查，繪制遺傳病家系圖(圖 3)。
圖1
先證者右眼彩色眼底像。1A.圍繞視盤的環形玻璃體灰白色絨狀混濁；1B.血管旁見足盤狀混濁??圖 2??先證者左眼彩色眼底像。血管旁多發足盤狀混濁??圖 3??家系圖。□：正常男性；○：正常女性；●：女性患者；：先證者
本研究遵循赫爾辛基宣言并取得所有受檢者的知情同意。對家系成員Ⅰ2、Ⅱ2~Ⅱ6、Ⅲ3、Ⅲ6、Ⅲ7、Ⅲ9以及與其共同生活、無遺傳性疾病的配偶行TTR基因外顯子檢測。采集受檢者外周靜脈全血2 ml，采用全血基因組DNA提取試劑盒(生工生物工程上海股份有限公司)提取DNA并編號。采用聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀(美國ABI公司)擴增TTR基因全部4個外顯子。參照文獻[3]的方法設計引物序列。外顯子1：上游引物5′-TTGGTTGTTTTGTTTTGGTGA-3′，下游引物5′-GCC CTAGTAATGCTGGTT-3′，擴增片段長度為436堿基對(bp)；外顯子2：上游引物5′-TGTAATTCTTGTTTCGCT CCA-3′，下游引物5′-CTCTGCCTACGTTTTTCAATCTA-3′，擴增片段長度為356 bp；外顯子3：上游引物5′-TGACTTAGTTGAGGGGAAATGTT-3′，下游引物5′-CACCTTCCTTAGGA CATTTCTG-3′，擴增片段長度為379 bp；外顯子4：上游引物5′-AATTAATTAAGTTGGCACTGGAC-3′，下游引物5′-CCT GGGCAACAGAGTGAGA-3′，擴增片段長度為703 bp。PCR反應總體系為50μl。反應條件：95℃預變性3 min，94℃變性30 s，55～60℃退火35 s, 72℃延伸40～50 s，72℃修復延伸5～8 min；共35個循環。取4μl擴增產物在Tris-硼酸緩沖液配制的1%瓊脂糖凝膠中進行電泳觀察，采用全自動凝膠成像圖像分析儀(美國Syngene公司)證實為所需長度的產物片段。將PCR反應液50μl在1%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳電壓90 V(低壓電泳儀DYY-8C型，北京六一儀器廠)，將PCR產物純化回收(生工生物工程上海股份有限公司SK1141)。將純化回收后產物進行編號及測序，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序(3730型測序儀，美國ABI公司)。采用SeqMan軟件和Chromas測序圖分析軟件對測序結果進行分析。并將其與正常人類TTR基因完全序列的4個外顯子進行完全比對[4]。
2 結果
測序分析結果顯示，在先證者和家系成員Ⅲ7的第3個外顯子107位G峰下方出現一個套峰，套峰為C堿基峰(圖 4)。表現為第83位氨基酸發生部分點突變，由GGC部分突變為CGC，甘氨酸部分被精氨酸取代(Gly103Arg)。突變形式表現為雜合子突變。其余受檢者未發現該位點基因突變(圖 5)。
圖4
先證者及家系成員Ⅲ7 TTR基因第3外顯子測序峰圖。107位堿基處出現雜合突變(黑箭)，第83位氨基酸發生部分點突變，由GGC部分突變為CGC，甘氨酸部分被精氨酸取代(Gly103Arg) ??圖 5??其余受檢者TTR基因第3外顯子測序峰圖。107位堿基處未出現雜合突變(黑箭)
3 討論
FTA屬常染色體顯性遺傳性疾病。本研究納入家系目前僅有1人患病，但我們通過TTR基因外顯子的檢測證實了該漢族家系的基因突變位點及突變形式。
目前已發現與淀粉樣變性有關的TTR基因突變有100多種[2]。DNA直接測序分析發現99%的突變集中在第2、3、4外顯子，最常見的突變位置是Val30Met，即纈氨酸被蛋氨酸取代，呈全球性分布；其他較為常見的突變位點有Val28Met、Leu58His、Leu58Arg、Lys78Phe、Ile84Ser、Tyr114His、Trp41Leu、Tyr69His、Asp18Glu、Val30Gly、Gly67Glu等。近年來國內報道了一些新發現及少見的突變位點有Arg54Gly[4]、Gly83Arg[5]、Ala36Pro[6]、Lys35Thr和Leu55Arg[7]、Tyr114Cys[8]、Val30Ala[9]。謝兵等[10]報道了8例患者的漢族家系TTR基因Gly83Arg雜合子突變。Zhang等[11]報道了3個漢族家系的G83R雜合子突變。Liu等[12]亦報道了同一家系12例Gly83Arg雜合子突變。我們在排除該家系成員葡萄膜炎、玻璃體積血、Terson綜合征以及眼外傷導致的玻璃體混濁后，采用DNA直接測序方法對10名家系成員進行了TTR基因檢測。為排除單核甘酸多態性和環境導致基因突變，同時還選取了與該家系成員共同生活、無遺傳性疾病的配偶進行對比研究，證實在先證者和家系成員Ⅲ7的第3外顯子83位點發生雜合子突變，由GGC突變為CGC，測序峰圖上表現為套峰。而在其他家系成員中，該位點沒有套峰出現。這一TTR基因突變位點及突變形式在國外其他種族尚無報道，在國內已有謝兵等[10]、Zhang等[11]、Liu等[12]相繼報道，均發生于我國的漢族家系中。我們推測該突變位點及突變形式或許是我國漢族家系玻璃體淀粉樣變性的特有突變形式。
本研究證實了該家系玻璃體淀粉樣變性是由TTR基因Gly83Arg雜合子突變所致，但該家系目前只有1人發病，我們推測第3代個體可能尚未到發病年齡，對該家系尚需加強隨訪及追蹤觀察。另外值得注意的是，由于10年前我們對該病缺乏認識，手術中未能提取玻璃體標本進行實驗室檢測，缺乏確診的剛果紅染色圖像資料。而先證者此次就診未接受玻璃體切割手術。提醒我們應在以后的臨床工作中注重對實驗檢材的提取。
