引用本文： 韓林峰, 柯根杰, 王林, 顧永昊, 顧起宏, 董凱, 劉家佳. 全視網膜激光光凝對增生型糖尿病視網膜病變視網膜前膜中環氧化酶-2、血管內皮生長因子表達的影響. 中華眼底病雜志, 2016, 32(2): 140-143. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.02.007 復制
糖尿病視網膜病變(DR)的病理基礎是視網膜新生血管的形成。血管內皮生長因子(VEGF)是目前最強的血管生成因子，同時有報道環氧化酶-2(COX-2)在DR中有較高的表達，被認為參與了DR新生血管的生成，與VEGF有著密切聯系[1, 2]。全視網膜激光光凝(PRP)是治療DR的有效手段，可有效減少新生血管生長因子的產生，抑制視網膜新生血管的生成[3, 4]。為此，我們檢測了一組接受PRP治療并行玻璃體切割手術的增生型DR(PDR)患者視網膜前膜組織中COX-2、VEGF的表達,初步探討PRP治療后視網膜新生血管，視網膜組織中COX-2、VEGF的變化。現將結果報道如下。
1 對象和方法
2012年12月至2013年12月在安徽醫科大學附屬省立醫院眼科檢查確診并接受玻璃體切割手術的連續PDR患者35例35只眼納入研究。所有患者均為PDRⅤ~Ⅵ期[5]。其中，男性21例，女性14例。年齡40~70歲，平均年齡(53.85±10.20)歲。糖尿病病程6~21年，平均病程(12.91±3.26)年。PDRⅤ期21只眼，Ⅵ期14只眼。使用胰島素治療者19例。患者均行視力、裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡、B型超聲、光相干斷層掃描(OCT)檢查。
納入標準：(1) 2型糖尿病；(2) 反復出現或大量玻璃體積血未經或經藥物治療后積血吸收效果不佳者，B型超聲檢查提示視網膜前機化膜形成和(或)合并有牽拉性視網膜脫離；(3) 無明顯玻璃體積血者，間接檢眼鏡、眼B型超聲、OCT檢查提示眼底增生膜形成和(或)合并牽拉性視網膜脫離。排除標準：手術前空腹血糖＞8 mmol/L者；既往接受過鞏膜扣帶和(或)玻璃體視網膜手術者；玻璃體腔注射抗新生血管藥物治療者；視網膜激光光凝未達3個象限者；合并有嚴重高血壓者；其他視網膜血管性疾病、老年性黃斑變性者。
將手術前未接受過任何激光光凝者分為非光凝組，接受過PRP治療[6]者分為光凝組，分別為19例19只眼和16例16只眼。非光凝組19例患者中，男性12例，女性7例；平均年齡(51.16±9.41)歲。右眼8只眼，左眼11只眼；PDRⅤ期12只眼，Ⅵ期7只眼。平均糖尿病病程(13.05±3.32)年；平均空腹血糖(6.16±0.97) mmol/L；使用胰島素治療者9例。光凝組16例患者。其中，男性9例，女性7例；平均年齡(53.38±11.64)歲。右眼6只眼，左眼10只眼；PDRⅤ期9只眼，Ⅵ期7只眼。平均糖尿病病程(12.75±3.28)年；平均空腹血糖(6.05±0.73) mmol/L；使用胰島素治療者10例。兩組患者年齡(t=0.623)、性別(χ2=0.173)、眼別(χ2=0.077)、PDR分期眼數(χ2=0.173)、平均糖尿病病程(t=0.270)、平均空腹血糖(t=0.366)、使用胰島素治療者例數(χ2=0.801)比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。
所有患者知情并簽署手術同意書后行常規睫狀體平坦部三通道閉合式玻璃體切割手術。收集手術中剝離的視網膜前膜，4%多聚甲醛固定，常規梯度酒精脫水，石蠟包埋，厚度4 μm連續切片，常規蘇木精-伊紅(HE)染色。光學顯微鏡下觀察增生膜病理組織形態學變化。
應用CD34、COX-2、VEGF單克隆抗體及鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(SP)法免疫組織化學測定視網膜前膜組織中COX-2、VEGF蛋白表達。石蠟切片常規脫蠟、水化，按試劑盒說明進行CD34、COX-2、VEGF 免疫組織化學染色。3% H2O2 去離子水孵育5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗。分別滴加CD34、COX-2、VEGF一抗，37℃孵育2 h，PBS 沖洗2 min，3次；分別加入即用型鼠抗人CD34 單克隆抗體、鼠抗人COX-2單克隆抗體、鼠抗人VEGF單克隆抗體，37℃孵育20 min，PBS沖洗2 min,3 次，二氨基聯苯胺顯色，蒸餾水沖洗、復染、脫水、透明封片，PBS代替一抗作陰性對照。細胞膜和(或)胞質呈棕褐色為陽性。
微血管密度(MVD)測定計數方法同文獻[7]，任何被CD34抗體染成棕褐色的單個內皮細胞或內皮細胞簇均為1個微血管計數；只要組織結構不相連，其分支結構也作為1個微血管進行計算；血管肌層較厚及管腔＞8個紅細胞直徑的血管予以排除。首先在100倍光學顯微鏡下尋找微血管最多的區域，再在200倍光學顯微鏡下計數3個視野的微血管數，取平均值作為MVD。 盲法下進行測定，每張切片均分別由2名病理科醫師判讀，兩者計數差值＞10%時重新計數。
按參照文獻[8]的方法運用電荷耦合器件圖像采集系統在光學顯微鏡下對COX-2、VEGF免疫組織化學染色的組織切片進行圖像采集，每個標本隨機選取3個區域及以上；應用Image-proplus 6.0圖像軟件對所采集的圖像進行分析處理，按照免疫組織化學陽性染色特征選取圖片中特定區域，計算陽性區域的積分吸光度[A，舊稱光密度(OD)](IA)值，所有COX-2、VEGF免疫組織化學染色切片IA值測定均在同一參數條件下完成。以COX-2、VEGF的IA值的平均值代表各種蛋白的分布密度。
采用SPSS 13.0 統計軟件進行統計學分析處理。計數資料以均數±標準差(
2 結果
光學顯微鏡觀察發現，非光凝組患眼視網膜前膜大而肥厚；纖維組織結構內可見數量較多、管徑較大的新生血管，血管結構多數不完整，部分區域可見較多新鮮出血。光凝組患眼視網膜前膜相對較薄；可見散在、管徑較小的新生血管，血管結構相對完整，出血相對較少(圖 1)。
圖1
視網膜前膜光學顯微鏡像。1A.非光凝組，纖維組織結構內可見數量較多、管徑較大的新生血管；1B.光凝組，可見炎癥細胞明顯增多 HE 標尺：50 μm
高倍光學顯微鏡下計數，非光凝組患眼MVD為5.41～9.72個，平均MVD為(7.42±1.39)個；光凝 組患眼MVD為2.74～6.67個，平均MVD為(4.56± 1.22)個。非光凝組患眼MVD數量明顯高于光凝組，差異有統計學意義(t=6.41,P＜0.001)。
免疫組織化學染色觀察發現，非光凝組患眼視網膜前膜中新生血管內皮細胞CD34、COX-2、VEGF均可見陽性表達；新生血管分布不均勻，呈點、線、簇狀結構排列，并有不規則的管腔樣結構存在；血管壁薄，未見明顯平滑肌形成。光凝組患眼視網膜前膜中新生血管內皮細胞CD34、COX-2、VEGF表達較非光凝組減少，部分切片未見陽性表達(圖 2)。
圖2
視網膜前膜免疫組織化學染色像。2A～2C.非光凝組，可見內皮細胞CD34(2A)、COX-2(2B)、VEGF(2C)棕黃色陽性表達；2D～2F.光凝組，可見少數內皮細胞CD34棕黃色陽性表達(2D)，COX-2(2E)、VEGF(2F)棕黃色陽性表達較少 SP 標尺：50 μm
非光凝組患眼視網膜前膜中CD34(t=6.147)、COX-2(t=5.944)、VEGF(t=7.445)IA值均明顯高于光凝組，差異均有統計學意義(P＜0.001)(圖 3)。
圖3
兩組視網膜前膜組織中CD34、COX-2、VEGF IA值比較
3 討論
視網膜微循環障礙是導致血視網膜屏障破壞、新生血管生成的主要因素[9]。CD34抗原是一種與新生小血管相關的特異性白細胞分化抗原，相較其他新生血管標記物在表達上更具有高度穩定性和特異性素[10, 11]。本研究利用CD34 在血管內皮細胞的陽性表達作為視網膜前膜新生血管表達的標志，并同時計算MVD。
既往研究證實，COX-2與 VEGF的過表達在炎癥、腫瘤等異常病理狀態下的新生血管生成中起著重要作用，并且COX-2的表達與VEGF呈正相關素[12-14]。在缺氧視網膜動物模型的視網膜中COX-2、VEGF的表達明顯升高[15]。臨床上抗VEGF藥物能有效控制DR新生血管生成，并能明顯減少已經形成的新生血管素[16-18]，進一步證實VEGF在DR新生血管生成中起到重要的作用。
本研究嚴格按DR分級[5]標準納入研究對象。兩組患者年齡、性別、病程、眼別、空腹血糖、是否使用胰島素等差異無統計學意義，患者基線資料可比。結果顯示：(1)PDR視網膜前膜中存在較多新生血管，COX-2、VEGF呈陽性表達；(2)光凝組患眼視網膜前膜中MVD數量明顯低于非光凝組，PRP治療能有效減少視網膜前膜中新生血管數量；(3)非光凝組患眼視網膜前膜中CD34、COX-2、VEGF IA值均明顯高于光凝組，PRP治療后視網膜新生血管數量及視網膜前膜組織中COX-2、VEGF含量明顯減少。因此，我們推測PRP治療能有效抑制PDR視網膜前膜中新生血管的生成和COX-2、VEGF的表達，是其抑制視網膜新生血管形成的可能機制。
本研究存在的不足是因樣本量較小且其中部分患者不能準確提供行PRP治療時間及開始使用胰島素時眼底情況，未能對PRP到接受手術治療時間及胰島素使用時間進行統計，其兩者時間長短對視網膜前膜組織病理形態以及COX-2、VEGF的表達可能存在影響；患者手術前空腹血糖只能體現患者手術前較短時間的血糖水平，不能完全反映患者的長期血糖水平。所以需要更大樣本的前瞻性研究及完善的研究設計，進一步分析證實COX-2、VEGF與PDR形成之間相互作用關系及PRP抑制視網膜新生血管形成的確切機制。
糖尿病視網膜病變(DR)的病理基礎是視網膜新生血管的形成。血管內皮生長因子(VEGF)是目前最強的血管生成因子，同時有報道環氧化酶-2(COX-2)在DR中有較高的表達，被認為參與了DR新生血管的生成，與VEGF有著密切聯系[1, 2]。全視網膜激光光凝(PRP)是治療DR的有效手段，可有效減少新生血管生長因子的產生，抑制視網膜新生血管的生成[3, 4]。為此，我們檢測了一組接受PRP治療并行玻璃體切割手術的增生型DR(PDR)患者視網膜前膜組織中COX-2、VEGF的表達,初步探討PRP治療后視網膜新生血管，視網膜組織中COX-2、VEGF的變化。現將結果報道如下。
1 對象和方法
2012年12月至2013年12月在安徽醫科大學附屬省立醫院眼科檢查確診并接受玻璃體切割手術的連續PDR患者35例35只眼納入研究。所有患者均為PDRⅤ~Ⅵ期[5]。其中，男性21例，女性14例。年齡40~70歲，平均年齡(53.85±10.20)歲。糖尿病病程6~21年，平均病程(12.91±3.26)年。PDRⅤ期21只眼，Ⅵ期14只眼。使用胰島素治療者19例。患者均行視力、裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡、B型超聲、光相干斷層掃描(OCT)檢查。
納入標準：(1) 2型糖尿病；(2) 反復出現或大量玻璃體積血未經或經藥物治療后積血吸收效果不佳者，B型超聲檢查提示視網膜前機化膜形成和(或)合并有牽拉性視網膜脫離；(3) 無明顯玻璃體積血者，間接檢眼鏡、眼B型超聲、OCT檢查提示眼底增生膜形成和(或)合并牽拉性視網膜脫離。排除標準：手術前空腹血糖＞8 mmol/L者；既往接受過鞏膜扣帶和(或)玻璃體視網膜手術者；玻璃體腔注射抗新生血管藥物治療者；視網膜激光光凝未達3個象限者；合并有嚴重高血壓者；其他視網膜血管性疾病、老年性黃斑變性者。
將手術前未接受過任何激光光凝者分為非光凝組，接受過PRP治療[6]者分為光凝組，分別為19例19只眼和16例16只眼。非光凝組19例患者中，男性12例，女性7例；平均年齡(51.16±9.41)歲。右眼8只眼，左眼11只眼；PDRⅤ期12只眼，Ⅵ期7只眼。平均糖尿病病程(13.05±3.32)年；平均空腹血糖(6.16±0.97) mmol/L；使用胰島素治療者9例。光凝組16例患者。其中，男性9例，女性7例；平均年齡(53.38±11.64)歲。右眼6只眼，左眼10只眼；PDRⅤ期9只眼，Ⅵ期7只眼。平均糖尿病病程(12.75±3.28)年；平均空腹血糖(6.05±0.73) mmol/L；使用胰島素治療者10例。兩組患者年齡(t=0.623)、性別(χ2=0.173)、眼別(χ2=0.077)、PDR分期眼數(χ2=0.173)、平均糖尿病病程(t=0.270)、平均空腹血糖(t=0.366)、使用胰島素治療者例數(χ2=0.801)比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。
所有患者知情并簽署手術同意書后行常規睫狀體平坦部三通道閉合式玻璃體切割手術。收集手術中剝離的視網膜前膜，4%多聚甲醛固定，常規梯度酒精脫水，石蠟包埋，厚度4 μm連續切片，常規蘇木精-伊紅(HE)染色。光學顯微鏡下觀察增生膜病理組織形態學變化。
應用CD34、COX-2、VEGF單克隆抗體及鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(SP)法免疫組織化學測定視網膜前膜組織中COX-2、VEGF蛋白表達。石蠟切片常規脫蠟、水化，按試劑盒說明進行CD34、COX-2、VEGF 免疫組織化學染色。3% H2O2 去離子水孵育5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗。分別滴加CD34、COX-2、VEGF一抗，37℃孵育2 h，PBS 沖洗2 min，3次；分別加入即用型鼠抗人CD34 單克隆抗體、鼠抗人COX-2單克隆抗體、鼠抗人VEGF單克隆抗體，37℃孵育20 min，PBS沖洗2 min,3 次，二氨基聯苯胺顯色，蒸餾水沖洗、復染、脫水、透明封片，PBS代替一抗作陰性對照。細胞膜和(或)胞質呈棕褐色為陽性。
微血管密度(MVD)測定計數方法同文獻[7]，任何被CD34抗體染成棕褐色的單個內皮細胞或內皮細胞簇均為1個微血管計數；只要組織結構不相連，其分支結構也作為1個微血管進行計算；血管肌層較厚及管腔＞8個紅細胞直徑的血管予以排除。首先在100倍光學顯微鏡下尋找微血管最多的區域，再在200倍光學顯微鏡下計數3個視野的微血管數，取平均值作為MVD。 盲法下進行測定，每張切片均分別由2名病理科醫師判讀，兩者計數差值＞10%時重新計數。
按參照文獻[8]的方法運用電荷耦合器件圖像采集系統在光學顯微鏡下對COX-2、VEGF免疫組織化學染色的組織切片進行圖像采集，每個標本隨機選取3個區域及以上；應用Image-proplus 6.0圖像軟件對所采集的圖像進行分析處理，按照免疫組織化學陽性染色特征選取圖片中特定區域，計算陽性區域的積分吸光度[A，舊稱光密度(OD)](IA)值，所有COX-2、VEGF免疫組織化學染色切片IA值測定均在同一參數條件下完成。以COX-2、VEGF的IA值的平均值代表各種蛋白的分布密度。
采用SPSS 13.0 統計軟件進行統計學分析處理。計數資料以均數±標準差(
2 結果
光學顯微鏡觀察發現，非光凝組患眼視網膜前膜大而肥厚；纖維組織結構內可見數量較多、管徑較大的新生血管，血管結構多數不完整，部分區域可見較多新鮮出血。光凝組患眼視網膜前膜相對較薄；可見散在、管徑較小的新生血管，血管結構相對完整，出血相對較少(圖 1)。
圖1
視網膜前膜光學顯微鏡像。1A.非光凝組，纖維組織結構內可見數量較多、管徑較大的新生血管；1B.光凝組，可見炎癥細胞明顯增多 HE 標尺：50 μm
高倍光學顯微鏡下計數，非光凝組患眼MVD為5.41～9.72個，平均MVD為(7.42±1.39)個；光凝 組患眼MVD為2.74～6.67個，平均MVD為(4.56± 1.22)個。非光凝組患眼MVD數量明顯高于光凝組，差異有統計學意義(t=6.41,P＜0.001)。
免疫組織化學染色觀察發現，非光凝組患眼視網膜前膜中新生血管內皮細胞CD34、COX-2、VEGF均可見陽性表達；新生血管分布不均勻，呈點、線、簇狀結構排列，并有不規則的管腔樣結構存在；血管壁薄，未見明顯平滑肌形成。光凝組患眼視網膜前膜中新生血管內皮細胞CD34、COX-2、VEGF表達較非光凝組減少，部分切片未見陽性表達(圖 2)。
圖2
視網膜前膜免疫組織化學染色像。2A～2C.非光凝組，可見內皮細胞CD34(2A)、COX-2(2B)、VEGF(2C)棕黃色陽性表達；2D～2F.光凝組，可見少數內皮細胞CD34棕黃色陽性表達(2D)，COX-2(2E)、VEGF(2F)棕黃色陽性表達較少 SP 標尺：50 μm
非光凝組患眼視網膜前膜中CD34(t=6.147)、COX-2(t=5.944)、VEGF(t=7.445)IA值均明顯高于光凝組，差異均有統計學意義(P＜0.001)(圖 3)。
圖3
兩組視網膜前膜組織中CD34、COX-2、VEGF IA值比較
3 討論
視網膜微循環障礙是導致血視網膜屏障破壞、新生血管生成的主要因素[9]。CD34抗原是一種與新生小血管相關的特異性白細胞分化抗原，相較其他新生血管標記物在表達上更具有高度穩定性和特異性素[10, 11]。本研究利用CD34 在血管內皮細胞的陽性表達作為視網膜前膜新生血管表達的標志，并同時計算MVD。
既往研究證實，COX-2與 VEGF的過表達在炎癥、腫瘤等異常病理狀態下的新生血管生成中起著重要作用，并且COX-2的表達與VEGF呈正相關素[12-14]。在缺氧視網膜動物模型的視網膜中COX-2、VEGF的表達明顯升高[15]。臨床上抗VEGF藥物能有效控制DR新生血管生成，并能明顯減少已經形成的新生血管素[16-18]，進一步證實VEGF在DR新生血管生成中起到重要的作用。
本研究嚴格按DR分級[5]標準納入研究對象。兩組患者年齡、性別、病程、眼別、空腹血糖、是否使用胰島素等差異無統計學意義，患者基線資料可比。結果顯示：(1)PDR視網膜前膜中存在較多新生血管，COX-2、VEGF呈陽性表達；(2)光凝組患眼視網膜前膜中MVD數量明顯低于非光凝組，PRP治療能有效減少視網膜前膜中新生血管數量；(3)非光凝組患眼視網膜前膜中CD34、COX-2、VEGF IA值均明顯高于光凝組，PRP治療后視網膜新生血管數量及視網膜前膜組織中COX-2、VEGF含量明顯減少。因此，我們推測PRP治療能有效抑制PDR視網膜前膜中新生血管的生成和COX-2、VEGF的表達，是其抑制視網膜新生血管形成的可能機制。
本研究存在的不足是因樣本量較小且其中部分患者不能準確提供行PRP治療時間及開始使用胰島素時眼底情況，未能對PRP到接受手術治療時間及胰島素使用時間進行統計，其兩者時間長短對視網膜前膜組織病理形態以及COX-2、VEGF的表達可能存在影響；患者手術前空腹血糖只能體現患者手術前較短時間的血糖水平，不能完全反映患者的長期血糖水平。所以需要更大樣本的前瞻性研究及完善的研究設計，進一步分析證實COX-2、VEGF與PDR形成之間相互作用關系及PRP抑制視網膜新生血管形成的確切機制。
