引用本文： 徐登峰, 易虹, 譙雁彬, 鄧衛巍. 重慶地區漢族人群增生型糖尿病視網膜病變患者補體C5基因單核苷酸多態性的遺傳易感性研究. 中華眼底病雜志, 2016, 32(2): 126-129. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.02.004 復制
研究表明，免疫因素參與了增生型糖尿病視網膜病變(PDR)的發生發展過程[1, 2]。補體系統在固有免疫和適應性免疫中均發揮關鍵作用[3]。C5是補體系統中關鍵片段，其水平變化可能影響疾病的發生發展[4, 5]。PDR患者玻璃體中C5a濃度顯著增加，提示C5a可能在PDR發病機制中發揮重要作用[6]。此外，PDR與遺傳變異密切相關[7, 8]。但C5基因多態性與PDR遺傳易感相關性研究報道尚少。為此，我們對一組2型糖尿病(T2DM)PDR患者C5基因的多態性位點進行了檢測，以觀察T2DM患者C5基因多態性與PDR之間的相關性。現將結果報道如下。
1 對象和方法
本研究經重慶市人民醫院倫理委員會批準；所有受試者均簽署知情同意書。受試者均為重慶地區漢族人群；人口流動帶來的非重慶籍貫、非漢族人群受試者予以排除。血樣采集來自重慶市人民醫院和重慶三峽中心醫院；實驗室檢測均在重慶市人民醫院完成。2009年至2015年在重慶市人民醫院糖尿病中心就診并進行眼并發癥篩查的T2DM患者400例(病例組)納入研究，其中PDR患者8例。患者中，男性174例，占43.5%；女性226例，占56.5%。年齡15～78歲，平均年齡(62.2±0.4)歲。患者均散瞳行間接檢眼鏡檢查眼底。視網膜病變程度判斷采用早期糖尿病視網膜病變治療研究組診斷標準[9]，視盤或視網膜其他位置出現新血管、纖維血管膜、玻璃體積血或牽拉性視網膜脫離定義為PDR。選取年齡、性別匹配的正常人群600名作為正常對照組。其中，男性253名，占42.2%；女性347名，占57.8%。平均年齡(57.5±0.5)歲。排除糖尿病、高血壓、腎病及其他免疫性疾病等可能影響結果的全身因素。
在文獻報道的C5基因與免疫相關的單核苷酸多態性(SNP)位點rs2269067、rs17611、rs7026551、rs10985126、rs7037673、rs1468673、rs7040033、rs2269066、rs25681、rs7027797中[10-15]，通過連鎖不平衡分析篩選出代表性SNP位點s2269067、rs7040033、rs7027797；在選擇出的3個SNP位點附近根據TagSNP選擇1個SNP位點rs1017119，最終4個SNP位點進行本次研究。
抽取患者清晨空腹靜脈血8 ml，加入乙二胺四乙酸抗凝。酶鏈免疫吸附測定法(ELISA)檢測血漿中補體C5蛋白表達。磷酸鹽緩沖液稀釋C5俘獲抗體后加入ELISA板，避光并室溫孵育過夜后緩沖液清洗3次；封閉液避光并室溫孵育1 h；8個濃度梯度倍比稀釋標準品混勻，室溫下避光孵育2 h；加入檢測抗體混勻，室溫避光孵育2 h；再加入100 μl辣根過氧化物酶液，避光并室溫孵育20 min；由A、B液按 1:1配制反應底物，混勻后加入100 μl反應底物，室溫下避光孵育約20 min，至呈現藍色為孵育標準，每孔加50 μl 5％H2SO4終止反應，顏色變為黃色后ELISA板放入酶標儀檢測吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值。
采用美國Qiagen公司QIAamp DNA Mini and Blood Mini試劑盒提取人外周血DNA。取400 μl人外周血加入細胞裂解液和蛋白酶K混合液，充分裂解血細胞，經異丙醇及無水乙醇沉淀、離心、緩沖液洗脫后，加入100 μl Tris緩沖鹽溶液，測量并標化DNA濃度為10 ng/μl，置于-20℃冰箱凍存備用。聚合酶鏈反應(PCR)，95℃預變性5 min；變性95℃ 30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，38個循環后72℃終末延伸5 min。 將PCR擴增產物加入酶切體系，采用限制性片段長度多態性PCR(PCR-RFLP)方法，37℃水浴12 h進行基因分型。為保證結果的準確性，對每個SNP不同基因型隨機抽取20%的標本進行直接測序，所得結果顯示一致。
SNP位點基因序列均從美國國立生物技術信息中心獲得。根據基因序列應用primer 5.0軟件設計PCR引物，由北京博邁德生物公司合成(表 1)。
表1
C5基因引物序列及限制性內切酶
采用SPSS 17.0軟件行統計學分析處理。病例組和正常對照組C5 SNP位點各基因型和等位基因的頻率比較行χ2檢驗。4個SNP位點共計11個基因型，各位點基因型Pc值校正系數為11； 血漿蛋白符合正態分布且方差齊性，采用單因素方差分析；多重間比較采用Bonferroni矯正。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
PCR-RFLP檢測結果顯示，病例組PDR患者C5基因rs2269067位點GG基因型頻率較正常對照組受試者明顯增高，差異有統計學意義[Pc=3.4×10-5，比值比(OR)=1.87，95%可信區間(CI)為1.43～2.44；P=3.1×10-6]；G、CC、CG基因型、等位基因頻率比較，差異無統計學意義(P=1.4×10-4、1.000、1.0×10-6。病例組PDR患者與正常對照組受試者C5基因rs7040033、rs1017119、rs7027797位點G、CC、CG、GG基因型、等位基因頻率比較，差異無統計學意義(P＞0.05)(表 2)。
表2
兩組受試者C5基因多態性的基因型和等位基因頻率比較(次，%)
ELISA檢測結果顯示，病例組PDR患者血漿中補體C5蛋白濃度表達較正常對照組受試者明顯升高，差異有統計學意義(P=0.000 4)(圖 1)。
圖1
兩組受試者血漿中補體C5蛋白濃度表達 圖 2 病例組rs226967位點GG、CG、CC基因型患者血漿中補體C5蛋白表達
C5基因rs2269067位點GG基因型PDR患者血漿中補體C5蛋白濃度表達較CG、CC基因型PDR患者增高，差異有統計學意義(P=0.003、0.001)(圖 2)。
3 討論
本研究結果顯示，PDR患者血漿中補體C5蛋白表達明顯升高；rs2269067位點GG基因型頻率較正常對照組明顯增高。提示C5 rs2269067位點GG基因型是T2DM患者PDR發病的危險因素。血漿中補體C5蛋白在rs2269067位點GG基因型中表達顯著升高。提示C5 rs2269067位點GG基因型不但是T2DM患者PDR的致病危險因素，而且可能通過起功能作用的C5蛋白表達升高而導致PDR的發生發展。
既往研究結果顯示，炎性細胞因子白細胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等在PDR患者玻璃體中高表達，表明免疫介導的炎性反應在PDR發病機制中起著重要作用[16]。Takeuchi等[17]發現PDR、增生性玻璃體視網膜病變患者玻璃體中IL-17A,IL-4和TNF-α等炎性因子濃度顯著升高。因此，我們將進一步研究C5基因與炎性因子的相關性，進一步闡述PDR的發病機制。
補體C5基因多態性與糖尿病的相關性目前報道尚少。本研究發現補體C5基因遺傳變異與T2DM患者PDR存在相關性，但C5 rs2269067位點如何影響PDR的具體機制目前尚不清楚。本研究結果初步揭示C5蛋白在rs2269067位點GG基因型表達增強。結合既往文獻報道，提示C5 rs2269067位點GG基因型可能是通過升高C5蛋白表達，引起下游炎癥因子改變，從而促進PDR的發生與發展。調控C5能否用于T2型DM PDR的治療還需要進一步研究，但值得注意的是，在實驗誘導葡萄膜炎小鼠模型及老年性黃斑變性的小鼠模型中，抗C5治療可以顯著減輕疾病的嚴重程度[18]。上述研究結果為T2DM PDR基因遺傳學研究提供了依據和方向。
本研究存在一定局限性。研究對象局限于重慶地區漢族人群，C5基因與中國漢族人群及其他種族人群是否存在類似相關性需擴大樣本量，以及多中心、多地域性研究結果證實。另外，本研究PDR患者均為T2DM，C5基因是否與1型糖尿病PDR患者的遺傳相關性，視網膜中央靜脈阻塞、孔源性視網膜脫離、眼球穿通傷等其他增生性視網膜病變是否相關均不清楚，將來需進一步研究。
研究表明，免疫因素參與了增生型糖尿病視網膜病變(PDR)的發生發展過程[1, 2]。補體系統在固有免疫和適應性免疫中均發揮關鍵作用[3]。C5是補體系統中關鍵片段，其水平變化可能影響疾病的發生發展[4, 5]。PDR患者玻璃體中C5a濃度顯著增加，提示C5a可能在PDR發病機制中發揮重要作用[6]。此外，PDR與遺傳變異密切相關[7, 8]。但C5基因多態性與PDR遺傳易感相關性研究報道尚少。為此，我們對一組2型糖尿病(T2DM)PDR患者C5基因的多態性位點進行了檢測，以觀察T2DM患者C5基因多態性與PDR之間的相關性。現將結果報道如下。
1 對象和方法
本研究經重慶市人民醫院倫理委員會批準；所有受試者均簽署知情同意書。受試者均為重慶地區漢族人群；人口流動帶來的非重慶籍貫、非漢族人群受試者予以排除。血樣采集來自重慶市人民醫院和重慶三峽中心醫院；實驗室檢測均在重慶市人民醫院完成。2009年至2015年在重慶市人民醫院糖尿病中心就診并進行眼并發癥篩查的T2DM患者400例(病例組)納入研究，其中PDR患者8例。患者中，男性174例，占43.5%；女性226例，占56.5%。年齡15～78歲，平均年齡(62.2±0.4)歲。患者均散瞳行間接檢眼鏡檢查眼底。視網膜病變程度判斷采用早期糖尿病視網膜病變治療研究組診斷標準[9]，視盤或視網膜其他位置出現新血管、纖維血管膜、玻璃體積血或牽拉性視網膜脫離定義為PDR。選取年齡、性別匹配的正常人群600名作為正常對照組。其中，男性253名，占42.2%；女性347名，占57.8%。平均年齡(57.5±0.5)歲。排除糖尿病、高血壓、腎病及其他免疫性疾病等可能影響結果的全身因素。
在文獻報道的C5基因與免疫相關的單核苷酸多態性(SNP)位點rs2269067、rs17611、rs7026551、rs10985126、rs7037673、rs1468673、rs7040033、rs2269066、rs25681、rs7027797中[10-15]，通過連鎖不平衡分析篩選出代表性SNP位點s2269067、rs7040033、rs7027797；在選擇出的3個SNP位點附近根據TagSNP選擇1個SNP位點rs1017119，最終4個SNP位點進行本次研究。
抽取患者清晨空腹靜脈血8 ml，加入乙二胺四乙酸抗凝。酶鏈免疫吸附測定法(ELISA)檢測血漿中補體C5蛋白表達。磷酸鹽緩沖液稀釋C5俘獲抗體后加入ELISA板，避光并室溫孵育過夜后緩沖液清洗3次；封閉液避光并室溫孵育1 h；8個濃度梯度倍比稀釋標準品混勻，室溫下避光孵育2 h；加入檢測抗體混勻，室溫避光孵育2 h；再加入100 μl辣根過氧化物酶液，避光并室溫孵育20 min；由A、B液按 1:1配制反應底物，混勻后加入100 μl反應底物，室溫下避光孵育約20 min，至呈現藍色為孵育標準，每孔加50 μl 5％H2SO4終止反應，顏色變為黃色后ELISA板放入酶標儀檢測吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值。
采用美國Qiagen公司QIAamp DNA Mini and Blood Mini試劑盒提取人外周血DNA。取400 μl人外周血加入細胞裂解液和蛋白酶K混合液，充分裂解血細胞，經異丙醇及無水乙醇沉淀、離心、緩沖液洗脫后，加入100 μl Tris緩沖鹽溶液，測量并標化DNA濃度為10 ng/μl，置于-20℃冰箱凍存備用。聚合酶鏈反應(PCR)，95℃預變性5 min；變性95℃ 30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，38個循環后72℃終末延伸5 min。 將PCR擴增產物加入酶切體系，采用限制性片段長度多態性PCR(PCR-RFLP)方法，37℃水浴12 h進行基因分型。為保證結果的準確性，對每個SNP不同基因型隨機抽取20%的標本進行直接測序，所得結果顯示一致。
SNP位點基因序列均從美國國立生物技術信息中心獲得。根據基因序列應用primer 5.0軟件設計PCR引物，由北京博邁德生物公司合成(表 1)。
表1
C5基因引物序列及限制性內切酶
采用SPSS 17.0軟件行統計學分析處理。病例組和正常對照組C5 SNP位點各基因型和等位基因的頻率比較行χ2檢驗。4個SNP位點共計11個基因型，各位點基因型Pc值校正系數為11； 血漿蛋白符合正態分布且方差齊性，采用單因素方差分析；多重間比較采用Bonferroni矯正。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
PCR-RFLP檢測結果顯示，病例組PDR患者C5基因rs2269067位點GG基因型頻率較正常對照組受試者明顯增高，差異有統計學意義[Pc=3.4×10-5，比值比(OR)=1.87，95%可信區間(CI)為1.43～2.44；P=3.1×10-6]；G、CC、CG基因型、等位基因頻率比較，差異無統計學意義(P=1.4×10-4、1.000、1.0×10-6。病例組PDR患者與正常對照組受試者C5基因rs7040033、rs1017119、rs7027797位點G、CC、CG、GG基因型、等位基因頻率比較，差異無統計學意義(P＞0.05)(表 2)。
表2
兩組受試者C5基因多態性的基因型和等位基因頻率比較(次，%)
ELISA檢測結果顯示，病例組PDR患者血漿中補體C5蛋白濃度表達較正常對照組受試者明顯升高，差異有統計學意義(P=0.000 4)(圖 1)。
圖1
兩組受試者血漿中補體C5蛋白濃度表達 圖 2 病例組rs226967位點GG、CG、CC基因型患者血漿中補體C5蛋白表達
C5基因rs2269067位點GG基因型PDR患者血漿中補體C5蛋白濃度表達較CG、CC基因型PDR患者增高，差異有統計學意義(P=0.003、0.001)(圖 2)。
3 討論
本研究結果顯示，PDR患者血漿中補體C5蛋白表達明顯升高；rs2269067位點GG基因型頻率較正常對照組明顯增高。提示C5 rs2269067位點GG基因型是T2DM患者PDR發病的危險因素。血漿中補體C5蛋白在rs2269067位點GG基因型中表達顯著升高。提示C5 rs2269067位點GG基因型不但是T2DM患者PDR的致病危險因素，而且可能通過起功能作用的C5蛋白表達升高而導致PDR的發生發展。
既往研究結果顯示，炎性細胞因子白細胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等在PDR患者玻璃體中高表達，表明免疫介導的炎性反應在PDR發病機制中起著重要作用[16]。Takeuchi等[17]發現PDR、增生性玻璃體視網膜病變患者玻璃體中IL-17A,IL-4和TNF-α等炎性因子濃度顯著升高。因此，我們將進一步研究C5基因與炎性因子的相關性，進一步闡述PDR的發病機制。
補體C5基因多態性與糖尿病的相關性目前報道尚少。本研究發現補體C5基因遺傳變異與T2DM患者PDR存在相關性，但C5 rs2269067位點如何影響PDR的具體機制目前尚不清楚。本研究結果初步揭示C5蛋白在rs2269067位點GG基因型表達增強。結合既往文獻報道，提示C5 rs2269067位點GG基因型可能是通過升高C5蛋白表達，引起下游炎癥因子改變，從而促進PDR的發生與發展。調控C5能否用于T2型DM PDR的治療還需要進一步研究，但值得注意的是，在實驗誘導葡萄膜炎小鼠模型及老年性黃斑變性的小鼠模型中，抗C5治療可以顯著減輕疾病的嚴重程度[18]。上述研究結果為T2DM PDR基因遺傳學研究提供了依據和方向。
本研究存在一定局限性。研究對象局限于重慶地區漢族人群，C5基因與中國漢族人群及其他種族人群是否存在類似相關性需擴大樣本量，以及多中心、多地域性研究結果證實。另外，本研究PDR患者均為T2DM，C5基因是否與1型糖尿病PDR患者的遺傳相關性，視網膜中央靜脈阻塞、孔源性視網膜脫離、眼球穿通傷等其他增生性視網膜病變是否相關均不清楚，將來需進一步研究。
