糖尿病視網膜病變(DR)易感基因定位研究方法包括基于疾病生物化學代謝機制的候選基因研究和基于連鎖不平衡病例對照研究以及全基因組關聯研究。需要全面正確認識評估這些研究方法在DR易感基因研究中的應用現狀以及所面臨的挑戰，充分發揮我國具有疾病資源豐富的獨特優勢，多學科、多地區合作，整合蛋白質組學、代謝組學和新一代測序新技術，全面分析基因-基因和基因-環境因素，推動DR易感基因研究水平的提高。
引用本文： 睢瑞芳. 認識糖尿病視網膜病變易感基因研究現狀與挑戰，提高糖尿病視網膜病變易感基因研究水平. 中華眼底病雜志, 2016, 32(2): 122-125. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.02.003 復制
糖尿病(DM)是由多基因交互作用并在不良環境暴露下所產生的結果，具有一定程度的家族傾向，但又不表現為典型的孟德爾遺傳方式[1, 2]。由于涉及的致病因子多,遺傳異質性強,遺傳和環境因素交互作用，所以其基因研究較困難。隨著分子遺傳學研究的深入和人類基因組計劃的完成，包括DM在內的復雜疾病的遺傳基礎和易感基因研究得以快速發展。DM易感基因研究已確定有數十個1型DM基因位點[3]，近百個2型DM的易感基因位點。我國DM遺傳學研究在較長期的遺傳樣本積累后開始出現了令人可喜的局面，已完成數個中國人2型DM的全基因組掃描，發現了獨特的易感基因[4-7]。相比之下，作為DM嚴重并發癥之一的糖尿病視網膜病變 (DR)，其基因研究尚處于起步階段，有較多問題值得思考和探索。目前常用的DR易感基因定位研究方法包括基于疾病生物化學代謝機制的候選基因研究和基于連鎖不平衡病例對照研究以及全基因組關聯研究。但這些研究方法各有特色和利弊，需要全面正確認識評估這些研究方法在DR易感基因研究中的應用現狀以及所面臨的挑戰，進而推動DR易感基因研究水平的提高。
1 候選基因研究
基因編碼產物參與了DR發生或發展調節，該基因就可作為DR候選基因。目前推斷與DR發病有相關性的候選基因主要包括醛糖還原酶(AR)基因、血管內皮生長因子(VEGF)基因和糖基化終末產物(AGE)受體(RAGE)基因等。
研究最廣泛的，尤其是中國眼科學者最熟悉的是VEGF基因。VEGF基因同時也是DR候選基因研究中被發現相關單核苷酸多態性(SNP)最多的一個基因。正常生理狀態下，VEGF低表達有助于血管的完整性；視網膜缺血缺氧等病理狀態下，視網膜內皮細胞、周細胞及視網膜色素上皮細胞VEGF表達過度，血管通透性增加，促進血管內皮細胞增生與遷移，引發視網膜新生血管形成。VEGF基因的遺傳學研究多側重對其進行多個SNP、標簽SNP及SNP單倍體研究。其中研究較多的為位于啟動子區域的多態性rs833061(-460T/C)和rs2010963(634G/C)。雖然相關SNP結論不一[8-10],但多提示VEGF基因是DR患病的主要易感基因。VEGF基因與增生型DR(PDR)的發生發展和黃斑水腫密切相關，抗VEGF藥物已廣泛應用于DR治療。
AR是一種屬于還原型輔酶Ⅱ依賴型醛酮還原酶家族的單體酶，是葡萄糖代謝多元醇途徑的關鍵酶，可將葡萄糖還原成山梨醇，將半乳糖還原成半乳糖醇。AR基因是目前最受重視的與DR相關的候選基因之一。位于5′端的(CA)(n)重復序列和-106C/T是其中研究最多的2個多態性。多項研究及meta分析認為，攜帶(CA)(n)的等位基因Z-2可能是1型及2型DM患者DR的危險因子，而等位基因Z+2則可能是1型DM患者中DR的保護因子[11-13]
AGE是葡萄糖對大分子具有非酶糖化而形成共價產物，長期高血糖會激發機體蛋白質發生非酶糖基化反應使AGE增加。RAGE是AGE的特定受體，在內皮細胞、淋巴細胞及β胰島素細胞等表達。AGE-RAGE之間的相互作用可以上調細胞因子誘導、粘附細胞表達、平滑肌及纖維細胞增生等多個與DR相關的信號通路。位于RAGE基因啟動子區域的-374T/A、-429T/C及位于V結構域的Gly82Ser是目前的研究熱點。印度人2型DM患者研究顯示，RAGE基因的-374T/A A等位基因是DR的保護因子，-429T/C及Gly82Ser與DR新生血管形成相關。而來自中國、亞洲其他國家及歐洲的研究及多人種meta分析認為，這3種RAGE基因多態性與DR無關[14-18]。
盡管DR候選基因研究取得了一定進展，加深了人們對DR病因的認識。但是總體來說，這些研究常因病例-對照選擇不同、收集樣本例數有限等因素，導致DR相關易感基因的研究結論不一，大量相關研究未能得到重復驗證。雖然候選基因方法具有針對性強和較為簡單的優點，但帶有一定盲目性；近年來在探索DR遺傳機制中已不再扮演重要角色。
2 全基因組關聯研究(GWAS)
GWAS基于常見SNP 在大樣本人群中進行關聯分析。關聯分析,是確定與疾病表型變化相關的遺傳變異的常用方法,在本質上屬于病例-對照研究,是比較無血緣關系的患病與非患病個體某一基因的等位基因出現頻率的差異,從而確定與疾病關聯的基因。GWAS成功用于復雜遺傳病的理論基礎是“常見變異常見病”假說。即復雜疾病的遺傳病因主要由眾多頻率較高(一般次要等位基因頻率MAF＞5%)致病風險較低的常見變異所構成。目前針對DR的GWAS研究為數不多[19-24]，其中包括美國墨西哥裔2型DM患者、中國臺灣2型DM人群、高加索人群1型DM患者及澳大利亞白人和2型DM等。有意義的SNP所在的基因包括CAMK4、FMN1、PLXDC2、ARHGAP22、GRB2等幾十個。這些基因的功能包括胰島素基因表達、炎癥反應、氧化應激、細胞粘附、細胞凋亡、增加毛細血管通透性及新生血管生成等。這幾個研究中，僅GRB2基因在一個以上的人群中得到重復，并且通過DR小鼠模型檢驗GRB2基因表達的異常。雖然GWAS為DR研究開辟了新的途徑，使研究者發現了許多未知基因和染色體區域，為疾病的發病機制提供了更多線索。然而GWAS并非萬能，它依賴于數以千計的較大樣本，檢測費用昂貴；存在樣本人群混雜、數據分析方法不同等因素，會導致假陰性、假陽性結果出現；檢測的SNP很少位于功能區，通過GWAS確定的位點在復雜疾病中的貢獻率都較低。這一系列問題導致了GWAS應用的局限性。目前總體來看，DR的GWAS研究相互之間結果不可重復。研究結果的局限性首先可能與樣本量不足有關，其次有些研究病例組和對照組的定義和設計也存在一定缺陷。
隨著高密度芯片技術的發展，越來越多的拷貝數變異(CNV) 被發現，這就為多種常見復雜疾病的全基因組CNV分析提供了契機。最近通過CNV的GWAS分析手段發現了幾個和亞洲2型DM相關的基因[25-27]。提示綜合SNP及CNV的GWAS將更有利于DR易感位點的發現和確定。
3 新的研究策略
代謝組學(metabolomics)是借助高通量、高靈敏度與高精確度的質譜技術和磁共振技術，對某一生物或細胞在一特定生理時期內所有低分子量代謝產物同時進行定性和定量分析的一門新學科，與基因、蛋白質表達和環境因素密切相關。我國目前與DM相關的代謝組學研究處于正在發展階段[28]。最近的一項研究檢測了89例中國DR患者的代謝組，發現脂肪酸(硬脂酸、亞麻油酸、花生四烯酸)、氨基酸(天冬氨酸)及葡萄糖的改變在無DR、非PDR(NPDR)及PDR患者中差異較大[29]。值得重視的另一種組學技術是蛋白質組學 ( proteomics) 技術。這是以質譜技術為核心、針對細胞或組織內的蛋白質群體進行高通量和高靈敏度分析技術。有研究采用無標記質量光譜計算法檢測了非DM患者、NPDR及PDR患者玻璃體蛋白質組，發現PDR組患者較其他組患者一系列與激肽釋放酶-細胞分裂素、凝固酶及補體系統等重要通路相關的蛋白有改變[30]。蛋白質組學及代謝組學在DR研究中有助于發現特定的生物標記，為研究DR發生發展機制以及研發測定DR分子標志物打下了良好的基礎，同時為發現DR易感基因提供新的思路。
新一代測序技術的進步,促進了全基因組測序和全基因組外顯子測序的快速發展。外顯子組測序是利用序列捕獲技術將全基因組外顯子區域DNA捕捉并富集后進行重測序的基因組分析方法。由于具有對常見和罕見變異高靈敏度,能發現外顯子區絕大部分疾病相關變異以及僅需要對約1%的基因組進行測序等優點,促使全基因組外顯子測序成為鑒定孟德爾疾病致病基因最有效的策略,也被運用于復雜疾病易感基因的研究中。在眼科領域，采用二代測序聯合外顯子捕獲技術，已發現有數個易感基因與老年性黃斑變性相關[31]。相信該方法也將在尋找DR易感基因的研究中起到重要作用。
對DR易感基因的研究任重道遠，充滿挑戰。需要多學科、多地區合作，建立研究協作組，統一病情分期和納入標準，解決樣本量不足以及納入DR受試者標準差異的問題；探索新的數據分析模型，從單一因素分析逐漸轉為多因素結合分析以及多因素之間交互作用分析，包括基因-基因以及基因-環境間的深入研究。對于環境因素，除了常見的物理、化學因素外，要重視與人類共同生存的一些微生物如病毒以及腸道菌群。將基因組學、蛋白質組學及代謝組學信息綜合分析，同時考慮常見基因變異及稀有罕見變異在DR發病中的共同作用。期待不久的將來發現多個DR的易感基因和生物標記，促進闡明DR的復雜發病機制，為早起篩查DR提供依據。我國具有疾病資源豐富的獨特優勢，希望我國研究者能夠充分利用這一優勢，積極應對挑戰，為DR易感基因研究作出自己應有的貢獻。
糖尿病(DM)是由多基因交互作用并在不良環境暴露下所產生的結果，具有一定程度的家族傾向，但又不表現為典型的孟德爾遺傳方式[1, 2]。由于涉及的致病因子多,遺傳異質性強,遺傳和環境因素交互作用，所以其基因研究較困難。隨著分子遺傳學研究的深入和人類基因組計劃的完成，包括DM在內的復雜疾病的遺傳基礎和易感基因研究得以快速發展。DM易感基因研究已確定有數十個1型DM基因位點[3]，近百個2型DM的易感基因位點。我國DM遺傳學研究在較長期的遺傳樣本積累后開始出現了令人可喜的局面，已完成數個中國人2型DM的全基因組掃描，發現了獨特的易感基因[4-7]。相比之下，作為DM嚴重并發癥之一的糖尿病視網膜病變 (DR)，其基因研究尚處于起步階段，有較多問題值得思考和探索。目前常用的DR易感基因定位研究方法包括基于疾病生物化學代謝機制的候選基因研究和基于連鎖不平衡病例對照研究以及全基因組關聯研究。但這些研究方法各有特色和利弊，需要全面正確認識評估這些研究方法在DR易感基因研究中的應用現狀以及所面臨的挑戰，進而推動DR易感基因研究水平的提高。
1 候選基因研究
基因編碼產物參與了DR發生或發展調節，該基因就可作為DR候選基因。目前推斷與DR發病有相關性的候選基因主要包括醛糖還原酶(AR)基因、血管內皮生長因子(VEGF)基因和糖基化終末產物(AGE)受體(RAGE)基因等。
研究最廣泛的，尤其是中國眼科學者最熟悉的是VEGF基因。VEGF基因同時也是DR候選基因研究中被發現相關單核苷酸多態性(SNP)最多的一個基因。正常生理狀態下，VEGF低表達有助于血管的完整性；視網膜缺血缺氧等病理狀態下，視網膜內皮細胞、周細胞及視網膜色素上皮細胞VEGF表達過度，血管通透性增加，促進血管內皮細胞增生與遷移，引發視網膜新生血管形成。VEGF基因的遺傳學研究多側重對其進行多個SNP、標簽SNP及SNP單倍體研究。其中研究較多的為位于啟動子區域的多態性rs833061(-460T/C)和rs2010963(634G/C)。雖然相關SNP結論不一[8-10],但多提示VEGF基因是DR患病的主要易感基因。VEGF基因與增生型DR(PDR)的發生發展和黃斑水腫密切相關，抗VEGF藥物已廣泛應用于DR治療。
AR是一種屬于還原型輔酶Ⅱ依賴型醛酮還原酶家族的單體酶，是葡萄糖代謝多元醇途徑的關鍵酶，可將葡萄糖還原成山梨醇，將半乳糖還原成半乳糖醇。AR基因是目前最受重視的與DR相關的候選基因之一。位于5′端的(CA)(n)重復序列和-106C/T是其中研究最多的2個多態性。多項研究及meta分析認為，攜帶(CA)(n)的等位基因Z-2可能是1型及2型DM患者DR的危險因子，而等位基因Z+2則可能是1型DM患者中DR的保護因子[11-13]
AGE是葡萄糖對大分子具有非酶糖化而形成共價產物，長期高血糖會激發機體蛋白質發生非酶糖基化反應使AGE增加。RAGE是AGE的特定受體，在內皮細胞、淋巴細胞及β胰島素細胞等表達。AGE-RAGE之間的相互作用可以上調細胞因子誘導、粘附細胞表達、平滑肌及纖維細胞增生等多個與DR相關的信號通路。位于RAGE基因啟動子區域的-374T/A、-429T/C及位于V結構域的Gly82Ser是目前的研究熱點。印度人2型DM患者研究顯示，RAGE基因的-374T/A A等位基因是DR的保護因子，-429T/C及Gly82Ser與DR新生血管形成相關。而來自中國、亞洲其他國家及歐洲的研究及多人種meta分析認為，這3種RAGE基因多態性與DR無關[14-18]。
盡管DR候選基因研究取得了一定進展，加深了人們對DR病因的認識。但是總體來說，這些研究常因病例-對照選擇不同、收集樣本例數有限等因素，導致DR相關易感基因的研究結論不一，大量相關研究未能得到重復驗證。雖然候選基因方法具有針對性強和較為簡單的優點，但帶有一定盲目性；近年來在探索DR遺傳機制中已不再扮演重要角色。
2 全基因組關聯研究(GWAS)
GWAS基于常見SNP 在大樣本人群中進行關聯分析。關聯分析,是確定與疾病表型變化相關的遺傳變異的常用方法,在本質上屬于病例-對照研究,是比較無血緣關系的患病與非患病個體某一基因的等位基因出現頻率的差異,從而確定與疾病關聯的基因。GWAS成功用于復雜遺傳病的理論基礎是“常見變異常見病”假說。即復雜疾病的遺傳病因主要由眾多頻率較高(一般次要等位基因頻率MAF＞5%)致病風險較低的常見變異所構成。目前針對DR的GWAS研究為數不多[19-24]，其中包括美國墨西哥裔2型DM患者、中國臺灣2型DM人群、高加索人群1型DM患者及澳大利亞白人和2型DM等。有意義的SNP所在的基因包括CAMK4、FMN1、PLXDC2、ARHGAP22、GRB2等幾十個。這些基因的功能包括胰島素基因表達、炎癥反應、氧化應激、細胞粘附、細胞凋亡、增加毛細血管通透性及新生血管生成等。這幾個研究中，僅GRB2基因在一個以上的人群中得到重復，并且通過DR小鼠模型檢驗GRB2基因表達的異常。雖然GWAS為DR研究開辟了新的途徑，使研究者發現了許多未知基因和染色體區域，為疾病的發病機制提供了更多線索。然而GWAS并非萬能，它依賴于數以千計的較大樣本，檢測費用昂貴；存在樣本人群混雜、數據分析方法不同等因素，會導致假陰性、假陽性結果出現；檢測的SNP很少位于功能區，通過GWAS確定的位點在復雜疾病中的貢獻率都較低。這一系列問題導致了GWAS應用的局限性。目前總體來看，DR的GWAS研究相互之間結果不可重復。研究結果的局限性首先可能與樣本量不足有關，其次有些研究病例組和對照組的定義和設計也存在一定缺陷。
隨著高密度芯片技術的發展，越來越多的拷貝數變異(CNV) 被發現，這就為多種常見復雜疾病的全基因組CNV分析提供了契機。最近通過CNV的GWAS分析手段發現了幾個和亞洲2型DM相關的基因[25-27]。提示綜合SNP及CNV的GWAS將更有利于DR易感位點的發現和確定。
3 新的研究策略
代謝組學(metabolomics)是借助高通量、高靈敏度與高精確度的質譜技術和磁共振技術，對某一生物或細胞在一特定生理時期內所有低分子量代謝產物同時進行定性和定量分析的一門新學科，與基因、蛋白質表達和環境因素密切相關。我國目前與DM相關的代謝組學研究處于正在發展階段[28]。最近的一項研究檢測了89例中國DR患者的代謝組，發現脂肪酸(硬脂酸、亞麻油酸、花生四烯酸)、氨基酸(天冬氨酸)及葡萄糖的改變在無DR、非PDR(NPDR)及PDR患者中差異較大[29]。值得重視的另一種組學技術是蛋白質組學 ( proteomics) 技術。這是以質譜技術為核心、針對細胞或組織內的蛋白質群體進行高通量和高靈敏度分析技術。有研究采用無標記質量光譜計算法檢測了非DM患者、NPDR及PDR患者玻璃體蛋白質組，發現PDR組患者較其他組患者一系列與激肽釋放酶-細胞分裂素、凝固酶及補體系統等重要通路相關的蛋白有改變[30]。蛋白質組學及代謝組學在DR研究中有助于發現特定的生物標記，為研究DR發生發展機制以及研發測定DR分子標志物打下了良好的基礎，同時為發現DR易感基因提供新的思路。
新一代測序技術的進步,促進了全基因組測序和全基因組外顯子測序的快速發展。外顯子組測序是利用序列捕獲技術將全基因組外顯子區域DNA捕捉并富集后進行重測序的基因組分析方法。由于具有對常見和罕見變異高靈敏度,能發現外顯子區絕大部分疾病相關變異以及僅需要對約1%的基因組進行測序等優點,促使全基因組外顯子測序成為鑒定孟德爾疾病致病基因最有效的策略,也被運用于復雜疾病易感基因的研究中。在眼科領域，采用二代測序聯合外顯子捕獲技術，已發現有數個易感基因與老年性黃斑變性相關[31]。相信該方法也將在尋找DR易感基因的研究中起到重要作用。
對DR易感基因的研究任重道遠，充滿挑戰。需要多學科、多地區合作，建立研究協作組，統一病情分期和納入標準，解決樣本量不足以及納入DR受試者標準差異的問題；探索新的數據分析模型，從單一因素分析逐漸轉為多因素結合分析以及多因素之間交互作用分析，包括基因-基因以及基因-環境間的深入研究。對于環境因素，除了常見的物理、化學因素外，要重視與人類共同生存的一些微生物如病毒以及腸道菌群。將基因組學、蛋白質組學及代謝組學信息綜合分析，同時考慮常見基因變異及稀有罕見變異在DR發病中的共同作用。期待不久的將來發現多個DR的易感基因和生物標記，促進闡明DR的復雜發病機制，為早起篩查DR提供依據。我國具有疾病資源豐富的獨特優勢，希望我國研究者能夠充分利用這一優勢，積極應對挑戰，為DR易感基因研究作出自己應有的貢獻。