上皮-間質轉化(EMT)是指上皮細胞在特定生理或病理情況下向間質細胞表型轉變的過程;是增生性玻璃體視網膜病變(PVR)的重要病理變化。轉化生長因子β等細胞因子通過調控下游信號通路誘導視網膜色素上皮(RPE)細胞發生EMT;微小RNA也參與調控RPE細胞發生EMT。深入了解EMT調控因素和相關信號通路,從而抑制RPE細胞發生EMT,將為PVR防治提供新的途徑。
引用本文： 盧欣旻, 孫曉東. 增生性玻璃體視網膜病變中上皮-間質轉化機制研究現狀. 中華眼底病雜志, 2015, 31(4): 412-414. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.04.029 復制
增生性玻璃體視網膜病變(PVR)患眼中，離開原位的視網膜色素上皮(RPE)細胞增生并發生形態和功能變化，轉化為巨噬細胞樣或成纖維細胞樣細胞，分泌細胞外基質，與神經膠質細胞、成纖維細胞等細胞成分在玻璃體腔內和(或)視網膜周圍形成收縮膜，牽引視網膜[1]。這種由分化的上皮細胞轉化為去分化細胞的過程稱為上皮-間質轉化(EMT)，是PVR的主要病理過程[2]。PVR多發生在視網膜脫離后，眼內微環境劇烈變化使得原本作為損傷修復過程的EMT失去調控，形成纖維化。深入了解EMT調控因素和相關信號通路，防治抑制RPE細胞發生EMT，將為PVR防治提供新途徑。現就PVR的MET機制研究現狀綜述如下。
1 EMT基本概念
EMT是指具有極性的上皮細胞轉化成具有活動能力，能夠在細胞基質間自由移動的間質細胞過程[3]。EMT可分為3種類型，1型為胚胎形成和器官發育中的EMT；2型為創傷修復、組織再生和器官纖維化中的EMT；3型為腫瘤中的EMT。PVR中的EMT為2型EMT，是炎癥損傷或外傷后的過度修復程序。PVR病程包括炎癥期、增生期和瘢痕期，炎癥在其中起著重要作用，也是RPE細胞發生EMT的始動因素之一[1]。PVR中的RPE細胞失去極性并獲得間質細胞特性的過程也被稱為RPE細胞去分化。發生EMT的上皮細胞中E-鈣黏蛋白、密封蛋白等上皮標志物表達降低，N-黏蛋白表達上升，細胞骨架由角蛋白為主轉變為波形蛋白，細胞失去其典型的細胞間連接結構，轉變為梭形的纖維細胞樣形態。上皮細胞轉化為間質細胞形態后遷移、侵襲、抗凋亡能力增強，并且分泌細胞外基質增多。
2 細胞因子介導的EMT
2.1 轉化生長因子(TGF)-β2
TGF-β是一種具有多種生物活性的細胞因子，TGF-β和其下游信號轉導被認為是眼內纖維增生性疾病最重要的推動因素，在RPE細胞發生EMT的過程中起重要作用[4]。TGF-β的3種亞型在眼內均有表達，表達最多的亞型是TGF-β2[5]。在PVR患眼玻璃體中可檢測到TGF-β2含量上升[2]。TGF-β2介導的RPE細胞EMT可通過多種下游通路，包括Smad蛋白家族、視紫紅質(Rho)A/Rho激酶(ROCK)等[6-8]。
Smad蛋白家族根據功能可分為3類。第1類是膜受體激活Smad(R-Smads)，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8，可與TGF-β受體直接作用并被磷酸化后與Smad4結合為二聚體轉位入核。第2類為通用Smad，只有Smad4。第3類有Smad6、Smad7，為TGF-β/Smad信號轉導通路的抑制因子，可與R-Smads競爭性地結合受體[6]。體外實驗證明，培養的RPE細胞中加入TGF-β2可活化Smad3，表達成肌纖維細胞標志性的α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Snail1和Ⅰ型膠原[9, 10]。在小鼠PVR模型中敲除TGF-β下游關鍵性的Smad3調控基因可以抑制視網膜脫離后的RPE細胞發生EMT。野生型小鼠脫離的視網膜下形成色素成纖維細胞樣多層細胞，RPE細胞增生為復層并表達成肌纖維細胞標志性蛋白α-SMA，分泌細胞外基質蛋白和Ⅵ型膠原，而Smad3基因敲除小鼠則缺乏這些表現[4]。用過氧化酶活化增生受體γ類似物曲格列酮或吡格列酮預處理RPE細胞可阻止TGF-β2誘導的EMT，該作用通過抑制TGF-β2誘導的Smad2、Smad3磷酸化及其在細胞核內的聚集而實現[11]。
Rho在細胞骨架重組調控方面起著重要作用，ROCK是Rho下游的重要效應分子，可以調節肌球蛋白輕鏈(MLC)磷酸化。阻斷TGF-β2可以很大程度但不完全抑制PVR患眼玻璃體促進α-SMA和MLC磷酸化的作用。鹽酸法舒地爾作為一種選擇性ROCK抑制劑，可以近乎完全阻斷MLC磷酸化以及膠原收縮。在體內實驗中，鹽酸法舒地爾可阻斷兔眼PVR進程，且對視網膜結構和功能無明顯損傷[12]。在體內外實驗中，ROCK抑制劑Y27632可以抑制α-SMA和TGF-β2誘導的Ⅰ型膠原表達[7]。RhoA抑制劑辛伐他汀可以抑制TGF-β2誘導的Ⅰ型膠原表達，在TGF-β2存在的情況下抑制Rho蛋白向細胞膜轉位，并在兔眼PVR模型中呈劑量依賴性抑制疾病進展[13]。
Jagged-1/Notch通路和細胞外信號調節激酶(ERK)1/2通路也參與TGF-β2介導的EMT。在RPE細胞中TGF-β2可以通過Smad信號通路，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(Akt)或絲裂原活化蛋白激酶通路上調Jagged-1表達。過表達Jagged-1可以模擬TGF-β2誘導的EMT。使用特異性拮抗劑γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch通路或敲除Jagged-1可以調控Snail、Slug和E-盒結合同源異形盒表達，阻斷TGF-β2誘導的EMT[14]。
ERK1/2通路和Jagged-1/Notch通路、TGF-β2/Smad通路相互影響。在TGF-β2誘導的EMT中ERK1/2通路被激活，這一激活并不依賴于Smad。SB431542阻斷TGF-β2/Smad2/ Smad3通路并不影響ERK1/2磷酸化。與此同時，阻斷ERK1/2 通路可以抑制TGF-β2/Smad通路和Jagged/Notch通路信號轉導，使用γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch通路也會抑制受TGF-β2激活的ERK1/2通路[15]。
2.2 TGF-β1
Rho在TGF-β1介導的EMT中也起一定作用，并且Smad和Rho兩個通路互相影響。TGF-β1可以通過Rho三磷酸鳥苷(GTP)酶依賴途徑誘導RPE細胞發生細胞骨架肌動蛋白重構[8]。Rho GTP酶的活化需要鳥甘酸轉換因子(GEF)。Smad3通過調控一種Rho獨有的GEF，即NET1的基因表達來調節RhoA活性和細胞骨架重構[16]。培養PVR患眼中具有遷移性的RPE細胞，可以發現其GEF-H1表達上調，TGF-β1通過Smad4依賴的途徑上調GEF-H1表達，并激活Rho。阻斷GEF-H1可抑制α-SMA表達上調和細胞遷移[17]。
在不同細胞中TGF-β有促凋亡或抑制凋亡兩種作用，TGF-β1處理的RPE細胞發生EMT或是凋亡取決于細胞所處細胞周期，G2/M期細胞在TGF-β1誘導下發生凋亡。TGF-β1可以通過PI3K通路上調生存素，促進細胞周期進展，繼而抑制凋亡促進EMT[2]。
2.3 其他細胞因子
除TGF-β是EMT主要因子外，還有其他多種細胞因子參與PVR的病理過程[18]。結締組織生長因子(CTGF)被認為是TGF-β的下游介質，加入CTGF的RPE細胞可以通過激活Rho/ROCK通路上調纖連蛋白、層粘連蛋白、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、Ⅰ型膠原等細胞外基質成分表達，發生EMT。ROCK抑制劑Y27632可抑制纖連蛋白、 MMP-2、Ⅰ型膠原的轉錄，但對層粘連蛋白無效[19]。提示CTGF是一類促纖維化介質。
腫瘤壞死因子α(TNF-α)是一種炎性因子，在PVR增生膜中含量增加[20]。在PVR病程中TNF-α可保護RPE細胞，阻止其凋亡[21]。TNF-α可以通過介導細胞外基質微環境的變化促進EMT。透明質酸是細胞外基質的主要成分，而CD44是透明質酸的跨膜粘附受體，在透明質酸重組降解起到重要作用，促進細胞遷移和腫瘤侵襲、化生[22]。TNF-α可以通過激活蛋白激酶C促進透明質酸-CD44-視網膜前膜復合物形成，激活TGF-β信號轉導，從而促進RPE細胞發生EMT[2]。TNF-α處理ARPE-19細胞可下調CD44受體結合蛋白Merlin的表達，并使得Merlin蛋白與CD44分離。Merlin蛋白可以通過調節透明質酸的內吞作用和活化激酶1-p38MAPK信號通路抑制TNF-α誘導的 EMT[23]。
3 微小RNA(miRNA)調控EMT
miRNA是一類進化中高度保守的非編碼小分子單鏈RNA分子，可調節轉錄后基因表達[24]。miRNA通過5′端的2~8位核苷酸與信使RNA(mRNA)3′端非編碼區堿基高度特異性互補配對結合，降解目標mRNA或抑制其翻譯從而下調靶基因表達。1個miRNA可調節多達300個基因的表達[25]。PVR病程中RPE細胞發生EMT，牽涉到很多細胞形態、功能的改變，同時基因表達也有變化。研究證實miRNA作為基因的調控因素也參與RPE細胞發生EMT。
TGF-β2誘導RPE細胞發生EMT 后，可以發現304個 miRNA表達變化。其中，185個miRNA表達下調，119個miRNA表達上調。選取35個具有代表性的miRNA檢測也得到相同結果[2]。TGF-β1誘導EMT后，可以發現miRNA-3138、 miRNA-22和miRNA-455-3p表達上調，miRNA-550a、miRNA-135b和miRNA-29b表達下調。其中，miRNA-29b下調超過80%。增強miRNA-29b的表達可以通過Akt2途徑抑制EMT[26]。miRNA在TGF-β誘導的RPE細胞EMT中起到調控作用。
檢測人胚胎RPE細胞(hfRPE)、視網膜神經層和脈絡膜組織的miRNA表達，可以發現miRNA-184、miRNA-187、miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-204、miRNA-211、miRNA-221、miRNA-222等8種miRNA在RPE細胞中的表達較后兩者更高。與體內其他組織相比，miRNA-204 和miRNA-211在RPE細胞中表達最高，并在維持上皮屏障功能和細胞生理上有著重要作用。miRNA-204可直接作用于編碼TGF-β受體2(TGFBR2)基因和Snail2，在生理狀態下維持RPE細胞的聚合性。阻斷miRNA-204可增強TGFBR2，通過降低緊密連接蛋白10、16、19的表達使得RPE細胞間的緊密連接解離[27]。miRNA-204、miRNA-211 這兩種RPE細胞中表達最多的miRNA在去分化的原代hfRPE細胞中表達明顯較分化RPE細胞下調[27]。拮抗 miRNA-204、miRNA-211可導致RPE細胞去分化。RPE細胞正常分化的一個主要調節因子小眼畸形有關轉錄因子(MITF)在去分化的hfRPE細胞中表達下調，而MITF的敲除會降低miRNA-204、miRNA-211的表達，并引起hfRPE細胞去分化[28]。
增生性玻璃體視網膜病變(PVR)患眼中，離開原位的視網膜色素上皮(RPE)細胞增生并發生形態和功能變化，轉化為巨噬細胞樣或成纖維細胞樣細胞，分泌細胞外基質，與神經膠質細胞、成纖維細胞等細胞成分在玻璃體腔內和(或)視網膜周圍形成收縮膜，牽引視網膜[1]。這種由分化的上皮細胞轉化為去分化細胞的過程稱為上皮-間質轉化(EMT)，是PVR的主要病理過程[2]。PVR多發生在視網膜脫離后，眼內微環境劇烈變化使得原本作為損傷修復過程的EMT失去調控，形成纖維化。深入了解EMT調控因素和相關信號通路，防治抑制RPE細胞發生EMT，將為PVR防治提供新途徑。現就PVR的MET機制研究現狀綜述如下。
1 EMT基本概念
EMT是指具有極性的上皮細胞轉化成具有活動能力，能夠在細胞基質間自由移動的間質細胞過程[3]。EMT可分為3種類型，1型為胚胎形成和器官發育中的EMT；2型為創傷修復、組織再生和器官纖維化中的EMT；3型為腫瘤中的EMT。PVR中的EMT為2型EMT，是炎癥損傷或外傷后的過度修復程序。PVR病程包括炎癥期、增生期和瘢痕期，炎癥在其中起著重要作用，也是RPE細胞發生EMT的始動因素之一[1]。PVR中的RPE細胞失去極性并獲得間質細胞特性的過程也被稱為RPE細胞去分化。發生EMT的上皮細胞中E-鈣黏蛋白、密封蛋白等上皮標志物表達降低，N-黏蛋白表達上升，細胞骨架由角蛋白為主轉變為波形蛋白，細胞失去其典型的細胞間連接結構，轉變為梭形的纖維細胞樣形態。上皮細胞轉化為間質細胞形態后遷移、侵襲、抗凋亡能力增強，并且分泌細胞外基質增多。
2 細胞因子介導的EMT
2.1 轉化生長因子(TGF)-β2
TGF-β是一種具有多種生物活性的細胞因子，TGF-β和其下游信號轉導被認為是眼內纖維增生性疾病最重要的推動因素，在RPE細胞發生EMT的過程中起重要作用[4]。TGF-β的3種亞型在眼內均有表達，表達最多的亞型是TGF-β2[5]。在PVR患眼玻璃體中可檢測到TGF-β2含量上升[2]。TGF-β2介導的RPE細胞EMT可通過多種下游通路，包括Smad蛋白家族、視紫紅質(Rho)A/Rho激酶(ROCK)等[6-8]。
Smad蛋白家族根據功能可分為3類。第1類是膜受體激活Smad(R-Smads)，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8，可與TGF-β受體直接作用并被磷酸化后與Smad4結合為二聚體轉位入核。第2類為通用Smad，只有Smad4。第3類有Smad6、Smad7，為TGF-β/Smad信號轉導通路的抑制因子，可與R-Smads競爭性地結合受體[6]。體外實驗證明，培養的RPE細胞中加入TGF-β2可活化Smad3，表達成肌纖維細胞標志性的α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Snail1和Ⅰ型膠原[9, 10]。在小鼠PVR模型中敲除TGF-β下游關鍵性的Smad3調控基因可以抑制視網膜脫離后的RPE細胞發生EMT。野生型小鼠脫離的視網膜下形成色素成纖維細胞樣多層細胞，RPE細胞增生為復層并表達成肌纖維細胞標志性蛋白α-SMA，分泌細胞外基質蛋白和Ⅵ型膠原，而Smad3基因敲除小鼠則缺乏這些表現[4]。用過氧化酶活化增生受體γ類似物曲格列酮或吡格列酮預處理RPE細胞可阻止TGF-β2誘導的EMT，該作用通過抑制TGF-β2誘導的Smad2、Smad3磷酸化及其在細胞核內的聚集而實現[11]。
Rho在細胞骨架重組調控方面起著重要作用，ROCK是Rho下游的重要效應分子，可以調節肌球蛋白輕鏈(MLC)磷酸化。阻斷TGF-β2可以很大程度但不完全抑制PVR患眼玻璃體促進α-SMA和MLC磷酸化的作用。鹽酸法舒地爾作為一種選擇性ROCK抑制劑，可以近乎完全阻斷MLC磷酸化以及膠原收縮。在體內實驗中，鹽酸法舒地爾可阻斷兔眼PVR進程，且對視網膜結構和功能無明顯損傷[12]。在體內外實驗中，ROCK抑制劑Y27632可以抑制α-SMA和TGF-β2誘導的Ⅰ型膠原表達[7]。RhoA抑制劑辛伐他汀可以抑制TGF-β2誘導的Ⅰ型膠原表達，在TGF-β2存在的情況下抑制Rho蛋白向細胞膜轉位，并在兔眼PVR模型中呈劑量依賴性抑制疾病進展[13]。
Jagged-1/Notch通路和細胞外信號調節激酶(ERK)1/2通路也參與TGF-β2介導的EMT。在RPE細胞中TGF-β2可以通過Smad信號通路，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(Akt)或絲裂原活化蛋白激酶通路上調Jagged-1表達。過表達Jagged-1可以模擬TGF-β2誘導的EMT。使用特異性拮抗劑γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch通路或敲除Jagged-1可以調控Snail、Slug和E-盒結合同源異形盒表達，阻斷TGF-β2誘導的EMT[14]。
ERK1/2通路和Jagged-1/Notch通路、TGF-β2/Smad通路相互影響。在TGF-β2誘導的EMT中ERK1/2通路被激活，這一激活并不依賴于Smad。SB431542阻斷TGF-β2/Smad2/ Smad3通路并不影響ERK1/2磷酸化。與此同時，阻斷ERK1/2 通路可以抑制TGF-β2/Smad通路和Jagged/Notch通路信號轉導，使用γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch通路也會抑制受TGF-β2激活的ERK1/2通路[15]。
2.2 TGF-β1
Rho在TGF-β1介導的EMT中也起一定作用，并且Smad和Rho兩個通路互相影響。TGF-β1可以通過Rho三磷酸鳥苷(GTP)酶依賴途徑誘導RPE細胞發生細胞骨架肌動蛋白重構[8]。Rho GTP酶的活化需要鳥甘酸轉換因子(GEF)。Smad3通過調控一種Rho獨有的GEF，即NET1的基因表達來調節RhoA活性和細胞骨架重構[16]。培養PVR患眼中具有遷移性的RPE細胞，可以發現其GEF-H1表達上調，TGF-β1通過Smad4依賴的途徑上調GEF-H1表達，并激活Rho。阻斷GEF-H1可抑制α-SMA表達上調和細胞遷移[17]。
在不同細胞中TGF-β有促凋亡或抑制凋亡兩種作用，TGF-β1處理的RPE細胞發生EMT或是凋亡取決于細胞所處細胞周期，G2/M期細胞在TGF-β1誘導下發生凋亡。TGF-β1可以通過PI3K通路上調生存素，促進細胞周期進展，繼而抑制凋亡促進EMT[2]。
2.3 其他細胞因子
除TGF-β是EMT主要因子外，還有其他多種細胞因子參與PVR的病理過程[18]。結締組織生長因子(CTGF)被認為是TGF-β的下游介質，加入CTGF的RPE細胞可以通過激活Rho/ROCK通路上調纖連蛋白、層粘連蛋白、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、Ⅰ型膠原等細胞外基質成分表達，發生EMT。ROCK抑制劑Y27632可抑制纖連蛋白、 MMP-2、Ⅰ型膠原的轉錄，但對層粘連蛋白無效[19]。提示CTGF是一類促纖維化介質。
腫瘤壞死因子α(TNF-α)是一種炎性因子，在PVR增生膜中含量增加[20]。在PVR病程中TNF-α可保護RPE細胞，阻止其凋亡[21]。TNF-α可以通過介導細胞外基質微環境的變化促進EMT。透明質酸是細胞外基質的主要成分，而CD44是透明質酸的跨膜粘附受體，在透明質酸重組降解起到重要作用，促進細胞遷移和腫瘤侵襲、化生[22]。TNF-α可以通過激活蛋白激酶C促進透明質酸-CD44-視網膜前膜復合物形成，激活TGF-β信號轉導，從而促進RPE細胞發生EMT[2]。TNF-α處理ARPE-19細胞可下調CD44受體結合蛋白Merlin的表達，并使得Merlin蛋白與CD44分離。Merlin蛋白可以通過調節透明質酸的內吞作用和活化激酶1-p38MAPK信號通路抑制TNF-α誘導的 EMT[23]。
3 微小RNA(miRNA)調控EMT
miRNA是一類進化中高度保守的非編碼小分子單鏈RNA分子，可調節轉錄后基因表達[24]。miRNA通過5′端的2~8位核苷酸與信使RNA(mRNA)3′端非編碼區堿基高度特異性互補配對結合，降解目標mRNA或抑制其翻譯從而下調靶基因表達。1個miRNA可調節多達300個基因的表達[25]。PVR病程中RPE細胞發生EMT，牽涉到很多細胞形態、功能的改變，同時基因表達也有變化。研究證實miRNA作為基因的調控因素也參與RPE細胞發生EMT。
TGF-β2誘導RPE細胞發生EMT 后，可以發現304個 miRNA表達變化。其中，185個miRNA表達下調，119個miRNA表達上調。選取35個具有代表性的miRNA檢測也得到相同結果[2]。TGF-β1誘導EMT后，可以發現miRNA-3138、 miRNA-22和miRNA-455-3p表達上調，miRNA-550a、miRNA-135b和miRNA-29b表達下調。其中，miRNA-29b下調超過80%。增強miRNA-29b的表達可以通過Akt2途徑抑制EMT[26]。miRNA在TGF-β誘導的RPE細胞EMT中起到調控作用。
檢測人胚胎RPE細胞(hfRPE)、視網膜神經層和脈絡膜組織的miRNA表達，可以發現miRNA-184、miRNA-187、miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-204、miRNA-211、miRNA-221、miRNA-222等8種miRNA在RPE細胞中的表達較后兩者更高。與體內其他組織相比，miRNA-204 和miRNA-211在RPE細胞中表達最高，并在維持上皮屏障功能和細胞生理上有著重要作用。miRNA-204可直接作用于編碼TGF-β受體2(TGFBR2)基因和Snail2，在生理狀態下維持RPE細胞的聚合性。阻斷miRNA-204可增強TGFBR2，通過降低緊密連接蛋白10、16、19的表達使得RPE細胞間的緊密連接解離[27]。miRNA-204、miRNA-211 這兩種RPE細胞中表達最多的miRNA在去分化的原代hfRPE細胞中表達明顯較分化RPE細胞下調[27]。拮抗 miRNA-204、miRNA-211可導致RPE細胞去分化。RPE細胞正常分化的一個主要調節因子小眼畸形有關轉錄因子(MITF)在去分化的hfRPE細胞中表達下調，而MITF的敲除會降低miRNA-204、miRNA-211的表達，并引起hfRPE細胞去分化[28]。