干細胞起源的視網膜色素上皮(RPE)細胞是治療視網膜變性性疾病的種子資源。誘導多能干細胞(iPSC)是與胚胎干細胞有相似性質的干細胞, 可分化為RPE細胞。目前眼科領域對iPSCs的研究僅停留在動物實驗及體外實驗階段。對iPSCs的深入研究可拓展其應用前景, 為視網膜變性性疾病的治療提供新的思路和方法。
引用本文： 李揚, 馬翔, 盧建民. 誘導多能干細胞分化成視網膜色素上皮細胞的研究進展. 中華眼底病雜志, 2015, 31(2): 212-214. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.02.031 復制
干細胞起源的視網膜色素上皮(RPE)細胞是治療老年性黃斑變性和其他變性性視網膜疾病的種子資源[1-6]。誘導多能干細胞(iPSCs)是具有與胚胎干細胞相似性質的干細胞，由體細胞誘導產生，可分化為RPE細胞。因其避免了胚胎干細胞面臨的移植后免疫排斥問題，已成為再生醫學研究的熱點。現就iPSCs向視網膜細胞尤其RPE細胞分化研究和發展現狀作一綜述。
1 iPSCs概述
2006年，Takahashi和Yamanaka[7]報道，對鼠成纖維細胞引入4個基因(OCT3/4、SOX2、KLF4、C-MYC)可產生與胚胎干細胞有相似性質的干細胞，并將其命名為iPSCs。隨后，在鼠和人上以基因為基礎的這種重組報道陸續出現[8-11]。已有研究證實，僅3種轉錄因子(OCT3/4、SOX2、KLF4)的強制表達即能將體細胞重組成iPSCs[7, 12-14]，揭示了iPSCs的分化能力并不依賴于重組因子間的特殊聯合作用。
重編程的各個環節都在不斷的研究和優化中，從最初的Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc等4個經典轉錄因子，到后來發現在一定情況下其中的某些轉錄因子可以被調整或替代，如用Sox1、Sox3、Sox15、Sox17和Sox18可以替代Sox2，Klf2或Klf 5可以模擬Klf4的功能等[15]。雌激素相關受體、beta(Esrrb)等有助于Oct3/4和Sox2的直接重組[16]。此外，用一種化學藥物kenpaullone治療，協同Oct3/4和Sox2的轉導也能夠從成纖維細胞產生出胚胎樣克隆[17]。所有Myc家族基因(c-Myc、N-Myc、L-Myc)均可提高iPSCs的產生效率[14]，但Myc不是直接重組過程中必需的轉錄因子。盡管如此，如果沒有Myc的參與，iPSCs的產生將會大大減少[14, 18]。Myc在iPSCs產生的作用可被權威的Wnt通路的激活所替代[19]。有研究報道，用組蛋白去乙酰化酶抑制劑如曲古抑菌素A及丙戊酸、DNA甲基化轉移酶抑制劑、氮雜胞嘧啶脫氧核苷酸(5-Aza-2′-deoxycytidine)，可以提高iPSCs系的建立[20, 21]。用小分子BIX-01294治療，通過抑制組氨酸甲基化轉移酶G9a，也可提高iPSCs系的建立。這些數據表明，表觀遺傳學的修飾與核重組也密切相關[22]。
轉錄載體的選擇也在不斷得到優化。最初iPSCs用逆轉錄病毒或者慢病毒產生，這些載體都能確保在細胞重編程轉化過程所需的足夠時間內高效表達轉錄因子。但是，這些病毒載體可能會引起插入突變的發生，并因此增加翻譯錯譯的風險，改變細胞分化潛能，甚至可能導致副作用的發生[23]。起源于逆轉錄病毒的鼠iPSCs表面上很正常，只是c-Myc轉基因的表達被抑制[14, 24]。但過單獨對鼠的研究，人iPSCs的長期的安全性還不能被保證。此外，逆轉錄病毒可能會引起iPSCs免疫源性的產生[25]。因此，需要避免涉及載體整合入宿主基因組的誘導方法。目前許多產生無整合的iPSCs的方法已經被報道。包括質粒[26]、仙臺病毒[27]、腺病毒[28]、合成RNAs和蛋白質[29]。此外，應用小分子誘導重組的嘗試也在進行。質粒和仙臺病毒現在常規用于許多實驗室，但這些非整合病毒和非病毒載體也存在重編轉錄率低、部分殘留載體序列或不能在人體細胞中使用等弊端。
除了轉錄因子和載體，靶細胞的選擇和細胞的培養環境等因素在整個iPSCs轉化過程中同樣十分重要。研究發現除了成纖維細胞外，還有多種體細胞，如造血細胞、骨髓間質細胞、神經前體細胞等，均可被重組轉化為iPSCs[30]。目前，胚胎干細胞和iPSCs系可在多種條件下培養，包括多種擴增方法、依賴飼養層和非依賴飼養層基質以及各種培養基配方等[31-38]。尤其發現與人工手動擴增法和酶消化法相比，用激光介導細胞增生可提高分化的潛能和效率，避免了干細胞傳代的可變性，減少了手動傳代技術所涉及的專業技術、勞動力和耗時的問題，也減少了兩種方法所造成的污染問題[39]。
2 iPSCs在視網膜中的研究
在過去的十多年，用于組織重建和功能重塑的干細胞和(或)祖細胞移植在再生醫學領域中被廣泛關注。眼科領域研究較多的是胚胎干細胞向視網膜細胞的誘導分化，相關研究已較為成熟。如借鑒皮膚黑色素細胞誘導時采用的ST2細胞層和類似的誘導條件，采用PA6間充質細胞系作為飼養層細胞層，小鼠胚胎干細胞能分化為呈六角形排列的、胞漿中出現色素顆粒的RPE細胞，但其誘導效率低[40]。已有研究報道，拮抗劑Dkk1+Lefty或是小分子抑制物Nodal/Activin和Wnt的聯合及其它早期的前神經因子的聯合，如Noggin、Dkk1、胰島素樣生長因子-1等均可提高人多能性干細胞誘導分化成視網膜細胞[41]。有研究證實，人胚胎干細胞起源的細胞可拯救營養不良鼠的視功能[1, 41, 43]，同時人胚胎干細胞還可有效產生視網膜祖細胞[44]。除了共培養[45]或組織移植，目前尚無較好的獲得有效RPE的高效方法。
移植治療過程需避免腫瘤分化傾向以及免疫排斥兩方面的問題。就這兩點而言，iPSCs在多能性和低分化方面與胚胎干細胞存在差異，iPSCs可同時表現出巨大的神經元分化能力[46]。因iPSCs來源于患者，避免了使用異源基因和載體，也就避免了不可控的分化[47]，減少腫瘤形成的幾率。美國一個研究組在體外實驗再次驗證了這一觀點[48]，他們提取來源于一位視網膜回旋型萎縮患者的iPSCs，隨后通過藥理學作用和修復靶基因兩種方法，成功使這位患者功能受損的RPE在體外得到修復。此外，在治療方法上，iPSCs自體同源的細胞來源豐富，不需要依靠動物器官等輔助治療，低分子復合物即可使iPSCs誘導分化成為RPE和光感受器細胞[49]。
研究證實，在體外，iPSCs可被誘導分化為RPE細胞和光感受器細胞[50-54]。由iPSCs誘導轉換而來的RPE細胞在營養不良小鼠實驗中也發現有保護作用[55]。國外已有文獻報道從猴iPSCs誘導分化出RPE細胞；采用特定無血清兩階段誘導培養法將鼠起源的iPSCs誘導分化成RPE細胞以及將人起源的胚胎干細胞與PA6基質細胞共培養產生RPE細胞[56-58]，而國內暫無類似報道。目前，Masayo Takahashi計劃首次驗證iPSCs在醫學上的潛力。由成體細胞重編程而來、可分化為人體各種細胞類型的類胚胎期細胞將被移植到患有退性性眼病的患者眼內。研究人員希望這種移植能夠減緩或停止疾病的發展，不過此研究的主要的目是證實這類細胞的安全性[41]。因此，iPSCs在視網膜方面的應用還有待進一步的研究。
3 iPSCs技術發展中面臨的困難
雖然對iPSCs的研究已取得突破性進展，但目前仍存在許多亟待解決的問題，主要歸納為以下幾點：(1)iPSCs向RPE細胞誘導分化的效率和安全性有待進一步的提高，目前已有可提高iPSCs重組效率的報道[15]，但提高向RPE細胞分化效率及安全性的研究很少[44, 59]。(2)分化誘導后的RPE細胞的功能尚待全面驗證。(3)分化誘導后的RPE細胞純化技術有待進一步探討。(4)目前iPSCs誘導分化為RPE細胞尚多停留于人類起源的干細胞體外實驗階段，對動物的體內實驗研究較少[47, 60]。(5)iPSCs的生成、培養和分化的費用非常昂貴。(6)目前遺傳性視網膜疾病的防治未納入到國家的防盲治盲計劃中，國家對于遺傳性視網膜變性性疾病的投入相對較少。(7)技術上的不成熟不完善，目前無法從iPSCs中培育出能夠獨立生存的后代[61]。進一步的研究發現，iPSCs與胚胎干細胞之間存在一定的差異[47, 60]，可能iPSCs克隆體系顯示出更大的變異性，并且一些克隆體系與胚胎干細胞在基因表達，DNA甲基化或者是分化能力上有一定的差異[62]，說明細胞的直接轉錄對于誘導分化細胞轉錄為多能細胞是不合適的。(8)由于動物與人類無論在解剖結構、生理、對于疾病和創傷的反應以及臨床反應都存在明顯的差別，這些差異限制了小鼠實驗對于人體可能反應的療效評估[63]。如鼠iPSCs形成胚胎骶尾部畸胎瘤的可能性要遠高于人iPSCs。雖然通過四倍體補償技術培育小鼠，為一些iPSCs成為多能干細胞的可行性提供了確切的證據，但在體細胞核轉化領域中[63]，僅有一小部分分化型體細胞能夠被轉錄為iPSCs，仍是未來迫切需要深入探討的問題。大型哺乳動物模型在解剖、生理和病理方面都與人類相對接近，現在有關豬、狒狒和恒河猴iPSCs的研究已經陸續開展，但這僅只是一個開始。這些疑問和可能性，都有待于將來更加深入的研究。
干細胞起源的視網膜色素上皮(RPE)細胞是治療老年性黃斑變性和其他變性性視網膜疾病的種子資源[1-6]。誘導多能干細胞(iPSCs)是具有與胚胎干細胞相似性質的干細胞，由體細胞誘導產生，可分化為RPE細胞。因其避免了胚胎干細胞面臨的移植后免疫排斥問題，已成為再生醫學研究的熱點。現就iPSCs向視網膜細胞尤其RPE細胞分化研究和發展現狀作一綜述。
1 iPSCs概述
2006年，Takahashi和Yamanaka[7]報道，對鼠成纖維細胞引入4個基因(OCT3/4、SOX2、KLF4、C-MYC)可產生與胚胎干細胞有相似性質的干細胞，并將其命名為iPSCs。隨后，在鼠和人上以基因為基礎的這種重組報道陸續出現[8-11]。已有研究證實，僅3種轉錄因子(OCT3/4、SOX2、KLF4)的強制表達即能將體細胞重組成iPSCs[7, 12-14]，揭示了iPSCs的分化能力并不依賴于重組因子間的特殊聯合作用。
重編程的各個環節都在不斷的研究和優化中，從最初的Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc等4個經典轉錄因子，到后來發現在一定情況下其中的某些轉錄因子可以被調整或替代，如用Sox1、Sox3、Sox15、Sox17和Sox18可以替代Sox2，Klf2或Klf 5可以模擬Klf4的功能等[15]。雌激素相關受體、beta(Esrrb)等有助于Oct3/4和Sox2的直接重組[16]。此外，用一種化學藥物kenpaullone治療，協同Oct3/4和Sox2的轉導也能夠從成纖維細胞產生出胚胎樣克隆[17]。所有Myc家族基因(c-Myc、N-Myc、L-Myc)均可提高iPSCs的產生效率[14]，但Myc不是直接重組過程中必需的轉錄因子。盡管如此，如果沒有Myc的參與，iPSCs的產生將會大大減少[14, 18]。Myc在iPSCs產生的作用可被權威的Wnt通路的激活所替代[19]。有研究報道，用組蛋白去乙酰化酶抑制劑如曲古抑菌素A及丙戊酸、DNA甲基化轉移酶抑制劑、氮雜胞嘧啶脫氧核苷酸(5-Aza-2′-deoxycytidine)，可以提高iPSCs系的建立[20, 21]。用小分子BIX-01294治療，通過抑制組氨酸甲基化轉移酶G9a，也可提高iPSCs系的建立。這些數據表明，表觀遺傳學的修飾與核重組也密切相關[22]。
轉錄載體的選擇也在不斷得到優化。最初iPSCs用逆轉錄病毒或者慢病毒產生，這些載體都能確保在細胞重編程轉化過程所需的足夠時間內高效表達轉錄因子。但是，這些病毒載體可能會引起插入突變的發生，并因此增加翻譯錯譯的風險，改變細胞分化潛能，甚至可能導致副作用的發生[23]。起源于逆轉錄病毒的鼠iPSCs表面上很正常，只是c-Myc轉基因的表達被抑制[14, 24]。但過單獨對鼠的研究，人iPSCs的長期的安全性還不能被保證。此外，逆轉錄病毒可能會引起iPSCs免疫源性的產生[25]。因此，需要避免涉及載體整合入宿主基因組的誘導方法。目前許多產生無整合的iPSCs的方法已經被報道。包括質粒[26]、仙臺病毒[27]、腺病毒[28]、合成RNAs和蛋白質[29]。此外，應用小分子誘導重組的嘗試也在進行。質粒和仙臺病毒現在常規用于許多實驗室，但這些非整合病毒和非病毒載體也存在重編轉錄率低、部分殘留載體序列或不能在人體細胞中使用等弊端。
除了轉錄因子和載體，靶細胞的選擇和細胞的培養環境等因素在整個iPSCs轉化過程中同樣十分重要。研究發現除了成纖維細胞外，還有多種體細胞，如造血細胞、骨髓間質細胞、神經前體細胞等，均可被重組轉化為iPSCs[30]。目前，胚胎干細胞和iPSCs系可在多種條件下培養，包括多種擴增方法、依賴飼養層和非依賴飼養層基質以及各種培養基配方等[31-38]。尤其發現與人工手動擴增法和酶消化法相比，用激光介導細胞增生可提高分化的潛能和效率，避免了干細胞傳代的可變性，減少了手動傳代技術所涉及的專業技術、勞動力和耗時的問題，也減少了兩種方法所造成的污染問題[39]。
2 iPSCs在視網膜中的研究
在過去的十多年，用于組織重建和功能重塑的干細胞和(或)祖細胞移植在再生醫學領域中被廣泛關注。眼科領域研究較多的是胚胎干細胞向視網膜細胞的誘導分化，相關研究已較為成熟。如借鑒皮膚黑色素細胞誘導時采用的ST2細胞層和類似的誘導條件，采用PA6間充質細胞系作為飼養層細胞層，小鼠胚胎干細胞能分化為呈六角形排列的、胞漿中出現色素顆粒的RPE細胞，但其誘導效率低[40]。已有研究報道，拮抗劑Dkk1+Lefty或是小分子抑制物Nodal/Activin和Wnt的聯合及其它早期的前神經因子的聯合，如Noggin、Dkk1、胰島素樣生長因子-1等均可提高人多能性干細胞誘導分化成視網膜細胞[41]。有研究證實，人胚胎干細胞起源的細胞可拯救營養不良鼠的視功能[1, 41, 43]，同時人胚胎干細胞還可有效產生視網膜祖細胞[44]。除了共培養[45]或組織移植，目前尚無較好的獲得有效RPE的高效方法。
移植治療過程需避免腫瘤分化傾向以及免疫排斥兩方面的問題。就這兩點而言，iPSCs在多能性和低分化方面與胚胎干細胞存在差異，iPSCs可同時表現出巨大的神經元分化能力[46]。因iPSCs來源于患者，避免了使用異源基因和載體，也就避免了不可控的分化[47]，減少腫瘤形成的幾率。美國一個研究組在體外實驗再次驗證了這一觀點[48]，他們提取來源于一位視網膜回旋型萎縮患者的iPSCs，隨后通過藥理學作用和修復靶基因兩種方法，成功使這位患者功能受損的RPE在體外得到修復。此外，在治療方法上，iPSCs自體同源的細胞來源豐富，不需要依靠動物器官等輔助治療，低分子復合物即可使iPSCs誘導分化成為RPE和光感受器細胞[49]。
研究證實，在體外，iPSCs可被誘導分化為RPE細胞和光感受器細胞[50-54]。由iPSCs誘導轉換而來的RPE細胞在營養不良小鼠實驗中也發現有保護作用[55]。國外已有文獻報道從猴iPSCs誘導分化出RPE細胞；采用特定無血清兩階段誘導培養法將鼠起源的iPSCs誘導分化成RPE細胞以及將人起源的胚胎干細胞與PA6基質細胞共培養產生RPE細胞[56-58]，而國內暫無類似報道。目前，Masayo Takahashi計劃首次驗證iPSCs在醫學上的潛力。由成體細胞重編程而來、可分化為人體各種細胞類型的類胚胎期細胞將被移植到患有退性性眼病的患者眼內。研究人員希望這種移植能夠減緩或停止疾病的發展，不過此研究的主要的目是證實這類細胞的安全性[41]。因此，iPSCs在視網膜方面的應用還有待進一步的研究。
3 iPSCs技術發展中面臨的困難
雖然對iPSCs的研究已取得突破性進展，但目前仍存在許多亟待解決的問題，主要歸納為以下幾點：(1)iPSCs向RPE細胞誘導分化的效率和安全性有待進一步的提高，目前已有可提高iPSCs重組效率的報道[15]，但提高向RPE細胞分化效率及安全性的研究很少[44, 59]。(2)分化誘導后的RPE細胞的功能尚待全面驗證。(3)分化誘導后的RPE細胞純化技術有待進一步探討。(4)目前iPSCs誘導分化為RPE細胞尚多停留于人類起源的干細胞體外實驗階段，對動物的體內實驗研究較少[47, 60]。(5)iPSCs的生成、培養和分化的費用非常昂貴。(6)目前遺傳性視網膜疾病的防治未納入到國家的防盲治盲計劃中，國家對于遺傳性視網膜變性性疾病的投入相對較少。(7)技術上的不成熟不完善，目前無法從iPSCs中培育出能夠獨立生存的后代[61]。進一步的研究發現，iPSCs與胚胎干細胞之間存在一定的差異[47, 60]，可能iPSCs克隆體系顯示出更大的變異性，并且一些克隆體系與胚胎干細胞在基因表達，DNA甲基化或者是分化能力上有一定的差異[62]，說明細胞的直接轉錄對于誘導分化細胞轉錄為多能細胞是不合適的。(8)由于動物與人類無論在解剖結構、生理、對于疾病和創傷的反應以及臨床反應都存在明顯的差別，這些差異限制了小鼠實驗對于人體可能反應的療效評估[63]。如鼠iPSCs形成胚胎骶尾部畸胎瘤的可能性要遠高于人iPSCs。雖然通過四倍體補償技術培育小鼠，為一些iPSCs成為多能干細胞的可行性提供了確切的證據，但在體細胞核轉化領域中[63]，僅有一小部分分化型體細胞能夠被轉錄為iPSCs，仍是未來迫切需要深入探討的問題。大型哺乳動物模型在解剖、生理和病理方面都與人類相對接近，現在有關豬、狒狒和恒河猴iPSCs的研究已經陸續開展，但這僅只是一個開始。這些疑問和可能性，都有待于將來更加深入的研究。