RB1基因的一生殖細胞系新生突變致視網膜母細胞瘤_《中華眼底病雜志》

作者：

袁萍 , 鐘誠 , 潘啟豪 , 王一鳴 , 胡彬 , 王文軍 ,  楊冬梓

510120 廣州, 中山大學孫逸仙紀念醫院生殖中心(袁萍、王文軍、楊冬梓); 中山大學中山醫學院遺傳教研室(鐘誠、潘啟豪、王一鳴、胡彬);

關鍵詞：

視網膜母細胞瘤/病因學視網膜母細胞瘤/遺傳學生殖細胞系突變

DOI：

10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.06.019

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引用本文： 袁萍, 鐘誠, 潘啟豪, 王一鳴, 胡彬, 王文軍, 楊冬梓. RB1基因的一生殖細胞系新生突變致視網膜母細胞瘤. 中華眼底病雜志, 2014, 30(6): 616-618. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.06.019 復制

視網膜母細胞瘤(RB)是由于RB1基因在生殖細胞或體細胞上發生雙等位基因突變所致^[1]。RB1基因為抑癌基因，其編碼的RB1蛋白(pRB)在CDK3/cyclin-C的作用下被磷酸化，釋放轉錄因子并激活基因轉錄，在促使細胞周期由G0期進入G1期過程中起關鍵調控作用^[2-4]。目前已發現近1800個致RB的RB1基因突變，涵蓋各種突變類型，其中以無義突變和小的插入/缺失突變最為常見(http://rb1-lovd.d-lohmann.de/home.php?select_db=RB1)。由于RB患者多為散發病例，既往多集中于研究RB患者自身的表型和基因型相關性，較少對患兒父母進行檢查，分析突變特征^{[5, 6]}。為此，我們對臨床工作中發現的1例由新的生殖細胞系新生突變所致的RB患兒及其父母進行了臨床和遺傳學分析，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1個來自中國廣東的3口之家納入本研究。先證者為1例患兒，年齡3個半月。父母身體健康，非近親婚配，均無其他遺傳病史。患兒足月順產，無窒息、吸氧史，Apgar評分10分。依據RB臨床診斷方法^[7]并結合本例患兒B型超聲、CT、磁共振成像(MRI)及眼底檢查結果，考慮為遺傳型雙側RB。患兒父母眼底檢查無異常。

為明確患兒診斷并對其父母后續再生育時的產前診治提供依據，在取得患兒父母的知情同意及中山大學孫逸仙紀念醫院倫理委員會批準后，采集患兒及其父母外周血200 μl，嚴格按照天根血液基因組小提試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]說明書要求進行全基因組DNA提取。利用UCSC數據庫(http://genome.ucsc.edu/，人類參考序列選自Feb. 2009, NCBI37/hg19)獲取RB1基因的序列信息，其Genbank cDNA序為NM_000321。利用Oligo 6.0軟件(http://www.oligo.net/downloads.html)設計聚合酶鏈反應(PCR)引物。PCR引物擴增序列包含所有編碼外顯子區域及內含子-外顯子交界區。所有引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，通過普通PCR反應體系及其特異性引物退火溫度進行目標序列擴增(表 1)。

表1 RB1基因各外顯子的引物序列

表選項

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表1 RB1基因各外顯子的引物序列

外顯子	正向引物序列(5′-3′)	反向引物序列(5′-3′)	特異性退火溫度(℃)
1	GGACGCGGCGCTCAGTT	TGTCAAGTTGAAGCCGAGACCC	69
2	CAAAGTCACTGGCGTTGA	AAATTTCCTCTGGGTAATGG	58
3	TCCTTTCAAATATATGCCATCA	AATACACTTTCATAACGGCTCC	54
4	GAGGTGTAAGTTGAAGGCTAAT	AAGGCTTGGGAGATAAG	54
5	CATAAATTGGGTCTACTTG	GGACTTAAATCTATGGGCTTAAT	54
6	GGGCTAAATATCATATCTTAGA	GCTAACAGTTAATAAGCCAA	54
7	ATATACTCTACCCTGCGATT	TCCCCCAACACTTTACT	54
8	GCAGACTTACGCTTAGATT	TGCGAGTTAGCACTAATTAC	54
9	TTTTACTGCATGGGGGATT	CGCTTAATGAGGCTTACCAA	52
10	ATGCGAACTCAGTGTATATTAC	GGCAGGCAATAGTATATGA	54
11	GCTGGGTCATCTATTTTCTATCCT	CGGTCTCAAACTCCTAACCTCA	62
12	TTTGAGGGAATGTAGAGACAAG	GCAAGGCAAATAGGTAAACATA	56
13	TGTTTCCACATTTTTATGAACAAT	GCAGCAGGGATATAGTATCTGAC	50
14~16	GGCCAGTGAGACTCC	ATACTCAGAAGAGAAGCCTAGTGA	62
17	GGCTGATAAGATACTAAACCT	TATTCATTAAATTCCCTATATGT	50
18	TTTTTCTGTCTTTCCTCCTAACTT	TTTATTTGGGTCATGTACCTTTT	52
19	AATATATCTTTCCCAGCTTGCATT	GCCAGACGACTCTGAATAG	54
20	GGGGAAAGGAGTGGTAGA	ACATGTAAATGGTAGCCAAA	56
21	TTGGGTTAAACACTTCATGTAG	TTACCCTTATCTTTCCAATTCT	50
22, 23	TCTGCTGCTGCCTGGCTATTTC	TCACCCCGCCCCCATATT	60
24	CAGTGGTTCTAGGGTAGAGGTAA	ATTTCTATGCAATATGCCTG	52
25	TCATATCTTTTATTTGGTCCAAT	CATATCTATTATTTTGAGCCATTC	52
26	ATAATAGCATAAAGTAAGTCATCG	ATGTTTCACTTCTTAGTCTTCC	52
27	TTTTCTTTGCATTGGGAACATTA	CATTTCAAGTGGCTTAGGAATCAC	50

根據美國ABI公司BigDye Terminator v3.1試劑盒的說明書要求，對上述擴增的PCR產物進行直接測序。測序產物純化后，加入Hi-Di 10 μl，經95℃ 5 min變性上機。利用ABI 3730XL DNA Analyzer儀，按標準程序進行毛細管電泳、數據收集和序列分析。同時收集100名無血緣關系且無RB表型的正常人作為對照，通過直接測序法與患兒突變位點進行比對，以排除單核苷酸多態性(SNP)。

對遺傳變異進行鑒定。(1)運用Chromas v2.0軟件對測序結果進行分析。將測序結果與上述從UCSC數據庫中獲取的RB1基因的序列進行比對分析。(2)通過查詢dbSNP數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)和人類基因突變數據庫(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)，鑒定數據庫中已報道的SNP位點和突變位點。(3)按照人類基因組變異組織(HGVS，http://www.hgvs.org/mutnomen/)所制定的變異命名法則，以Genbank cDNA序列NM_000321中起始密碼子ATG的A為第+1位核苷酸，對測序所得變異進行命名。通過NCBI Open Reading Frame Finder軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)確定突變RB1蛋白(NP_000312)的氨基酸終止位置。(4)野生型的RB1蛋白結構域從Uniprot(http://www.uniprot.org/)和Interpro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)中獲得。

2 結果

經兩名獨立眼科醫生診斷，確診患兒為雙側RB，考慮為遺傳型。

患兒RB1基因編碼區、內含子-外顯子區及部分內含子區直接測序結果顯示，第4外顯子區域存在一個新的移碼突變c.397_400delAACT(p.Asn133Tyrfs*2)(圖 1A)。患兒父母的第4外顯子區域無任何突變(圖 1B，1C)。100例正常對照者均未出現該突變。

圖1 患兒及其父母RB1基因第4外顯子的部分測序圖。1A.新生突變型，可見患兒的突變位點c.397_400delAACT(黑箭)；1B.野生型，可見父源保守的397A位點(黑箭)；1C.野生型，可見母源保守的397A位點(黑箭)

圖選項

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患兒的新突變c.397_400delAACT (p.Asn133Tyrfs*2)使第133位的天冬酰胺突變為酪氨酸，并隨后發生移碼突變使肽鏈在第135位出現了提前終止，可導致其后含有重要結構域的793個氨基酸被截斷(圖 2)。

圖2 RB1野生蛋白結構域示意圖。患兒突變所在位置及肽鏈提前終止位置(黑箭)，該突變可導致其后793個氨基酸截斷，丟失的結構域含部分N-末端、細胞周期蛋白類似物A、細胞周期蛋白類似物B和C-末端

圖選項

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3 討論

RB是學齡兒童最常見的眼內惡性腫瘤，早診斷、早治療可極大程度地挽救患兒視力和生命，且對于RB1基因的突變檢測有利于遺傳風險的評估，對再生育后代有重要的指導意義^{[1, 7]}。本例患兒為雙側發病，從臨床表現看多為遺傳型。RB1基因的突變檢測結果顯示，父母均正常，而在患兒的第4外顯子發現了一個新的移碼突變c.397_400delAACT，該突變位置并非RB1基因的突變好發外顯子區，且未在國際上報道(http://rb1-lovd.d-lohmann.de/home.php?select_db=RB1，http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)。說明該突變為一生殖細胞系的新生突變(de novo mutation)。盡管無法獲得腫瘤組織，但我們根據“二次打擊假說”^[1]可以推測患兒RB的發生是由于在自身的生殖細胞中首發該突變，繼而因突變的RB1基因極易再次在體細胞中發生突變所致。既往通過對大量RB患者進行表型-基因型分析，發現這類生殖細胞系新生突變是遺傳型RB的主要突變類型，且其90%的突變來自父源^{[1, 7-9]}。而本例患兒父母基因型正常，我們推測該患兒的新生突變來源可能發生在配子形成期或胚胎發育早期。

同時我們通過生物信息學分析，發現該新生突變可導致基因編碼的pRB肽鏈在突變后第2個氨基酸隨即出現終止密碼子，使編碼肽鏈被截斷了793個氨基酸。根據無義介導的mRNA降解機制(“nonsense mediated mRNA decay”)^[10]，截斷后的pRB肽鏈僅剩的5′端135個氨基酸也會進一步被降解，而致整個肽鏈丟失。有研究發現，pRB中的細胞周期蛋白類似物(cyclin-like)結構域可與c-fos等某些癌基因蛋白結合，形成復合體后調控細胞內某些蛋白功能；作為腫瘤抑制因子能有效地抑制E2F介導的轉錄激活^[11]。因此，該生殖細胞的突變可導致編碼蛋白雜合性丟失含有重要功能域的細胞周期蛋白類似物，而視網膜母細胞中體細胞的突變進一步導致細胞周期蛋白類似物功能的完全丟失，使之喪失調控細胞周期的功能，細胞周期將不會被阻止在G1期，致使起源于不成熟視網膜細胞腫瘤形成。

本研究通過對該例患兒及其父母進行致病基因RB1的突變檢測，發現其存在一個致病性的生殖細胞系新生突變c.397_400delAACT (p.Asn133Tyrfs*2)，該突變為國際首次報道，補充了RB患者突變譜。為再發風險高達45%^[11]的RB新生突變家庭進行遺傳咨詢以及后代的臨床及基因檢測提供了依據。

1 對象和方法

表1 RB1基因各外顯子的引物序列

表選項

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表1 RB1基因各外顯子的引物序列

外顯子	正向引物序列(5′-3′)	反向引物序列(5′-3′)	特異性退火溫度(℃)
1	GGACGCGGCGCTCAGTT	TGTCAAGTTGAAGCCGAGACCC	69
2	CAAAGTCACTGGCGTTGA	AAATTTCCTCTGGGTAATGG	58
3	TCCTTTCAAATATATGCCATCA	AATACACTTTCATAACGGCTCC	54
4	GAGGTGTAAGTTGAAGGCTAAT	AAGGCTTGGGAGATAAG	54
5	CATAAATTGGGTCTACTTG	GGACTTAAATCTATGGGCTTAAT	54
6	GGGCTAAATATCATATCTTAGA	GCTAACAGTTAATAAGCCAA	54
7	ATATACTCTACCCTGCGATT	TCCCCCAACACTTTACT	54
8	GCAGACTTACGCTTAGATT	TGCGAGTTAGCACTAATTAC	54
9	TTTTACTGCATGGGGGATT	CGCTTAATGAGGCTTACCAA	52
10	ATGCGAACTCAGTGTATATTAC	GGCAGGCAATAGTATATGA	54
11	GCTGGGTCATCTATTTTCTATCCT	CGGTCTCAAACTCCTAACCTCA	62
12	TTTGAGGGAATGTAGAGACAAG	GCAAGGCAAATAGGTAAACATA	56
13	TGTTTCCACATTTTTATGAACAAT	GCAGCAGGGATATAGTATCTGAC	50
14~16	GGCCAGTGAGACTCC	ATACTCAGAAGAGAAGCCTAGTGA	62
17	GGCTGATAAGATACTAAACCT	TATTCATTAAATTCCCTATATGT	50
18	TTTTTCTGTCTTTCCTCCTAACTT	TTTATTTGGGTCATGTACCTTTT	52
19	AATATATCTTTCCCAGCTTGCATT	GCCAGACGACTCTGAATAG	54
20	GGGGAAAGGAGTGGTAGA	ACATGTAAATGGTAGCCAAA	56
21	TTGGGTTAAACACTTCATGTAG	TTACCCTTATCTTTCCAATTCT	50
22, 23	TCTGCTGCTGCCTGGCTATTTC	TCACCCCGCCCCCATATT	60
24	CAGTGGTTCTAGGGTAGAGGTAA	ATTTCTATGCAATATGCCTG	52
25	TCATATCTTTTATTTGGTCCAAT	CATATCTATTATTTTGAGCCATTC	52
26	ATAATAGCATAAAGTAAGTCATCG	ATGTTTCACTTCTTAGTCTTCC	52
27	TTTTCTTTGCATTGGGAACATTA	CATTTCAAGTGGCTTAGGAATCAC	50

2 結果

經兩名獨立眼科醫生診斷，確診患兒為雙側RB，考慮為遺傳型。

圖選項

圖選項

3 討論

表1 RB1基因各外顯子的引物序列

外顯子	正向引物序列(5′-3′)	反向引物序列(5′-3′)	特異性退火溫度(℃)
1	GGACGCGGCGCTCAGTT	TGTCAAGTTGAAGCCGAGACCC	69
2	CAAAGTCACTGGCGTTGA	AAATTTCCTCTGGGTAATGG	58
3	TCCTTTCAAATATATGCCATCA	AATACACTTTCATAACGGCTCC	54
4	GAGGTGTAAGTTGAAGGCTAAT	AAGGCTTGGGAGATAAG	54
5	CATAAATTGGGTCTACTTG	GGACTTAAATCTATGGGCTTAAT	54
6	GGGCTAAATATCATATCTTAGA	GCTAACAGTTAATAAGCCAA	54
7	ATATACTCTACCCTGCGATT	TCCCCCAACACTTTACT	54
8	GCAGACTTACGCTTAGATT	TGCGAGTTAGCACTAATTAC	54
9	TTTTACTGCATGGGGGATT	CGCTTAATGAGGCTTACCAA	52
10	ATGCGAACTCAGTGTATATTAC	GGCAGGCAATAGTATATGA	54
11	GCTGGGTCATCTATTTTCTATCCT	CGGTCTCAAACTCCTAACCTCA	62
12	TTTGAGGGAATGTAGAGACAAG	GCAAGGCAAATAGGTAAACATA	56
13	TGTTTCCACATTTTTATGAACAAT	GCAGCAGGGATATAGTATCTGAC	50
14~16	GGCCAGTGAGACTCC	ATACTCAGAAGAGAAGCCTAGTGA	62
17	GGCTGATAAGATACTAAACCT	TATTCATTAAATTCCCTATATGT	50
18	TTTTTCTGTCTTTCCTCCTAACTT	TTTATTTGGGTCATGTACCTTTT	52
19	AATATATCTTTCCCAGCTTGCATT	GCCAGACGACTCTGAATAG	54
20	GGGGAAAGGAGTGGTAGA	ACATGTAAATGGTAGCCAAA	56
21	TTGGGTTAAACACTTCATGTAG	TTACCCTTATCTTTCCAATTCT	50
22, 23	TCTGCTGCTGCCTGGCTATTTC	TCACCCCGCCCCCATATT	60
24	CAGTGGTTCTAGGGTAGAGGTAA	ATTTCTATGCAATATGCCTG	52
25	TCATATCTTTTATTTGGTCCAAT	CATATCTATTATTTTGAGCCATTC	52
26	ATAATAGCATAAAGTAAGTCATCG	ATGTTTCACTTCTTAGTCTTCC	52
27	TTTTCTTTGCATTGGGAACATTA	CATTTCAAGTGGCTTAGGAATCAC	50

表選項

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圖選項

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1.	Horsthemke B. Genetics and cytogenetics of retinoblastoma[J]. Cancer Genet Cytogenet, 1992, 63:1-7.
2.	Dryja TP, Friend S, Weinberg RA. Isolation of a cDNA fragment derived from human retina mRNA which detects a locus within 13q14 often deleted in retinoblastomas[J]. Am J Hum Genet, 1986, 39:29.
3.	Toguchida J, McGee TL, Paterson JC, et al. Complete genomic sequence of the human retinoblastoma susceptibility gene[J]. Genomics, 1993, 17:535-543.
4.	Ren S, Rollins BJ. Cyclin C/cdk3 promotes Rb-dependent G0 exit[J]. Cell, 2004, 117:239-251.
5.	He MY, An Y, Gao YJ, et al. Screening of RB1 gene mutations in Chinese patients with retinoblastoma and preliminary exploration of genotype-phenotype correlations[J]. Mol Vis, 2014, 20:545-552.
6.	Lohmann DR, Brandt B, H pping W, et al. Spectrum of small length germline mutations in the RB1 gene[J]. Hum Mol Genet, 1994, 3:2187-2193.
7.	Balmer A, Zografos L, Munier F. Diagnosis and current management of retinoblastoma[J]. Oncogene, 2006, 25:5341-5349.
8.	Dryja TP, Mukai S, Petersen R, et al. Parental origin of mutations of the retinoblastoma gene[J]. Nature, 1989, 339:556-558.
9.	Zhu X, Dunn JM, Phillips RA, et al. Preferential germline mutation of the paternal allele in retinoblastoma[J]. Nature, 1989, 340:312-313.
10.	Hentze MW, Kulozik AE. A perfect message:RNA surveillance and nonsense-mediated decay[J]. Cell, 1999, 96:307-310.
11.	Gibson TJ, Thompson JD, Blocker A, et al. Evidence for a protein domain superfamily shared by the cyclins, TFIIB and RB/p107[J]. Nucleic Acids Res, 1994, 22:946-952.

1. Horsthemke B. Genetics and cytogenetics of retinoblastoma[J]. Cancer Genet Cytogenet, 1992, 63:1-7.
2. Dryja TP, Friend S, Weinberg RA. Isolation of a cDNA fragment derived from human retina mRNA which detects a locus within 13q14 often deleted in retinoblastomas[J]. Am J Hum Genet, 1986, 39:29.
3. Toguchida J, McGee TL, Paterson JC, et al. Complete genomic sequence of the human retinoblastoma susceptibility gene[J]. Genomics, 1993, 17:535-543.
4. Ren S, Rollins BJ. Cyclin C/cdk3 promotes Rb-dependent G0 exit[J]. Cell, 2004, 117:239-251.
5. He MY, An Y, Gao YJ, et al. Screening of RB1 gene mutations in Chinese patients with retinoblastoma and preliminary exploration of genotype-phenotype correlations[J]. Mol Vis, 2014, 20:545-552.
6. Lohmann DR, Brandt B, H pping W, et al. Spectrum of small length germline mutations in the RB1 gene[J]. Hum Mol Genet, 1994, 3:2187-2193.
7. Balmer A, Zografos L, Munier F. Diagnosis and current management of retinoblastoma[J]. Oncogene, 2006, 25:5341-5349.
8. Dryja TP, Mukai S, Petersen R, et al. Parental origin of mutations of the retinoblastoma gene[J]. Nature, 1989, 339:556-558.
9. Zhu X, Dunn JM, Phillips RA, et al. Preferential germline mutation of the paternal allele in retinoblastoma[J]. Nature, 1989, 340:312-313.
10. Hentze MW, Kulozik AE. A perfect message:RNA surveillance and nonsense-mediated decay[J]. Cell, 1999, 96:307-310.
11. Gibson TJ, Thompson JD, Blocker A, et al. Evidence for a protein domain superfamily shared by the cyclins, TFIIB and RB/p107[J]. Nucleic Acids Res, 1994, 22:946-952.

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RB1基因的一生殖細胞系新生突變致視網膜母細胞瘤

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1 對象和方法

2 結果

3 討論

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RB1基因的一生殖細胞系新生突變致視網膜母細胞瘤

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