縫隙連接是相鄰細胞之間直接交換離子和小分子物質的通道, 由相鄰細胞膜上的2個連接子相互錨定組成。連接子是由6個縫隙連接蛋白亞單位構成的六聚體。視網膜各層細胞均有縫隙連接蛋白表達。縫隙連接不僅參與視網膜發育過程的調控, 協助和增強視覺信息的傳遞以及維持神經元細胞外微環境的穩態; 也和糖尿病視網膜病變、青光眼、老年性黃斑變性、視網膜色素變性以及視網膜損傷等視網膜疾病的發生發展密切相關。以縫隙連接為靶點干預治療視網膜疾病將逐漸成為國內外眼底疾病研究的熱點。
引用本文： 于廣委, 張琰, 王紅星, 李筱榮. 縫隙連接在視網膜中的生理功能和視網膜疾病中的作用. 中華眼底病雜志, 2014, 30(4): 425-428. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.04.028 復制
視網膜相鄰細胞之間的縫隙連接介導的直接電信號和小分子化學信號傳遞對視網膜的生理功能發揮重要作用[1]。縫隙連接作為廣泛存在的細胞間交流渠道，與糖尿病視網膜病變(DR)、青光眼、老年性黃斑變性(AMD)、視網膜色素變性(RP)以及視網膜損傷等視網膜疾病的發生發展密切相關[2-5]。現就縫隙連接在視網膜的生理功能和視網膜疾病中的作用綜述如下。
1 縫隙連接的基本結構、功能和組織分布
縫隙連接是相鄰細胞之間直接交換離子和一些小分子物質的通道，由相鄰細胞膜上的2個連接子相互錨定組成。連接子是由6個縫隙連接蛋白亞(Cx)單位構成的六聚體。人類Cx是由1、6、7、10、13、15、17號以及X染色體上基因編碼的相對分子質量為23×103～62×103的膜蛋白家族，包括21個成員。由6個相同的Cx構成的連接子稱為同聚體連接子，同聚體連接子組成的縫隙連接稱為同型縫隙連接；由6個不完全相同的Cx構成的連接子稱為異聚體連接子，異聚體連接子參與組成的縫隙連接稱作異型縫隙連接。另外，單個連接子也可形成溝通細胞內外的通道，即半通道型縫隙連接[6]。由于大多Cx的半衰期為數小時，因此縫隙連接的通透性很大程度與Cx的動態合成與降解密切相關[7]。
縫隙連接在細胞之間形成電偶聯、離子偶聯和代謝偶聯以加強細胞間的信息傳遞，對細胞的生長、分化等正常生理功能有重要作用[8]。其還可以放大線粒體損傷造成的細胞凋亡，進而在中樞神經系統中加重谷氨酸誘導的興奮性毒性[9, 10]。研究發現，晶狀體中有Cx43、Cx46、Cx50的表達，這些Cx可促進晶狀體的循環，維持晶狀體的正常發育和透明，而此類Cx編碼基因的突變可導致先天性白內障和眼球發育異常[11]。視網膜中亦有多種縫隙連接和Cx表達，縫隙連接與視網膜的發育、生理活動及視網膜疾病均有密切關系[1]。
2 Cx在視網膜中的表達
在視網膜相同和不同類型的細胞之間均有縫隙連接存在。不同細胞類型上可有同一種Cx表達；同一細胞類型上也可有不同種類的Cx表達，其形成高度立體化的縫隙連接模式，使視覺信息可以在視網膜中進行高效、精確的傳遞和加工[12]。視網膜中主要有Cx36、Cx43、Cx45和Cx57的表達。Kihara等[13]研究發現，在大鼠視網膜發育過程中，Cx36表達量最高，其次為Cx43和Cx45，而Cx57只有中等量的表達。Cx36是神經元之間最重要的Cx之一，存在于視錐、視桿細胞之間，紅綠視錐細胞之間，無長突細胞之間，視錐和雙極細胞之間以及多數神經節細胞亞型之間，但藍視錐細胞之間以及視桿細胞之間則不表達Cx36[14-17]。Cx43主要在神經膠質細胞中表達。在兔和小鼠視網膜的星形膠質細胞和Müller細胞中有Cx43的表達[18, 19]；而在人視網膜中，Cx43則分布于星形膠質細胞、Müller細胞和視網膜色素上皮(RPE)細胞之間[20]。Cx45在視網膜發育過程中，廣泛表達于視網膜前體細胞之中，用以維持視網膜前體細胞的增生狀態[13]；在成年小鼠視網膜中，Cx45可以構成給光型與撤光型雙極細胞到無長突細胞、神經節細胞之間的縫隙連接[21, 22]。發育中的大鼠、小鼠和兔視網膜中Cx57表達只限于水平細胞，且在胚胎后期的表達量開始增加[13, 23, 24]。
3 縫隙連接在視網膜中的生理功能
縫隙連接是中樞神經系統神經元之間直接、迅速進行信息交流的結構基礎。視網膜作為中樞神經系統的外延，是經縫隙連接進行信息交流的典型范例[25]。在視網膜發育過程中，縫隙連接可以調控神經上皮層的增生和凋亡，視網膜各層的遷移和分層，以及參與突觸發生和神經環路的形成[26]。然而，神經元-神經網絡的發育過程是各種縫隙連接相互協調的結果，其精細的調節機制還需進一步研究。
在成熟的視網膜中，Cx36存在于光感受器細胞之間以及無長突細胞與節細胞之間，構成這些視網膜神經元之間的縫隙連接偶聯。視錐細胞之間的縫隙連接偶聯能夠有效提高“信噪比”，視錐-視桿細胞之間的偶聯能夠為視桿信號進入視錐途徑提供直接通路，而部分無長突細胞與神經節細胞亞型之間的偶聯與視網膜到大腦的同步電活動有關[14, 17]。Cx36還廣泛存在于視桿細胞、視錐細胞和AⅡ型無長突細胞之間。在Cx36基因敲除的小鼠視網膜中，由視桿細胞介導的給光中心型反應在神經節細胞層面上完全消失[27]。鑒于視桿細胞通路在暗光覺信號傳遞中的重要作用，Cx36組成的縫隙連接被認為是夜視力中最重要的偶聯[28]。Cx43在視網膜的生理作用尚缺乏明確的認識，在中樞神經系統，星形膠質細胞可以通過Cx43構成的縫隙連接形成功能性合胞體，維持神經元細胞外環境的穩態[29]。我們推測，視網膜中的Cx43也可能起類似作用。Cx45構成的縫隙連接可以起到傳遞視桿細胞源信號的作用[21, 22]；這種縫隙連接亦可存在于雙層神經節細胞之間，其兩側存在的電壓差可能與維持視覺信號傳遞的方向性有關[30]。由于Cx57在視網膜中的表達只限于水平細胞，因此利用內源性Cx57基因啟動子驅動表達的白喉毒素受體系統可以選擇性地在視網膜中去除水平細胞。水平細胞在生理狀態下，可通過反饋和前饋抑制來調節光感受器細胞和雙極細胞之間的信號傳遞；而失去水平細胞后，視桿細胞的軸突從外叢狀層萎縮，部分視桿細胞退行性病變，但視錐細胞基本存活。另外，失去水平細胞造成視網膜外層的形態學改變對節細胞層的電生理功能和動物視功能影響不大[31]。提示視網膜具有網絡代償能力。另有研究表明，Cx57對維持水平細胞的細胞膜性能起重要作用，基因敲除小鼠水平細胞中的Cx57可以導致此類細胞的感受域明顯減小[32]。
4 縫隙連接在視網膜疾病中的作用
4.1 DR
正常情況下，縫隙連接介導的細胞間交流有助于維持血視網膜屏障的完整性。Sato等[33]研究發現，高糖刺激下血管內皮細胞中的Cx43 mRNA水平降低30%，而Cx43蛋白表達下降45%。另外，高糖可使Cx43蛋白磷酸化失活，進而使血管內皮細胞間交流減少，造成細胞間平衡的破壞，損害血視網膜屏障[34]。在細胞器水平上，高糖處理后的血管內皮細胞線粒體上Cx43明顯減少，導致血管內皮細胞線粒體形態改變、裂解、細胞色素C釋放以及血管內皮細胞凋亡，這種線粒體的功能障礙在糖尿病誘發的細胞凋亡中起重要作用[35]。Manasson等[36]研究發現，高糖刺激亦可使Cx30.2表達下降，減少血管內皮細胞間縫隙連接的數目。Cx30.2基因敲除小鼠也表現出視網膜中異常毛細血管增加和周細胞減少。這些研究結果表明，Cx30.2的表達下調在促進DR特征性血管損害和視網膜血管平衡破壞過程中起到一定的作用。Shibata等[37]研究發現，糖尿病引起的縫隙連接偶聯破壞可以損害視盤血流的自身調節能力，對內層視網膜的代謝產生不利影響。縫隙連接在DR發病機制中的研究為早期實施DR干預措施提供了理論支持。
4.2 青光眼
視盤的星形膠質細胞為神經節細胞及其軸突提供支持和營養作用，由Cx43構成的星形膠質細胞合胞體對神經節細胞的離子和代謝平衡意義重大[38]。Malone等[38]研究發現，液體壓力可以引起星形膠質細胞的細胞膜上Cx43數量減少，細胞漿中Cx43數量增加，以及Cx43磷酸化失活和由Cx43所組成的縫隙連接關閉。這些改變進一步打破了視網膜節細胞軸突的穩態，最終導致以視盤重塑為特征的青光眼視神經病變。Kerr等[3]研究發現，原發性開角型青光眼患者視盤周圍和視網膜中周部神經節細胞層Cx43表達增加，并且Cx43的表達上調與星形膠質細胞活化增生表現出來的形態學肥大和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)陽性染色有關。長期過度的膠質細胞增生可以釋放活性氧離子、細胞因子和前列腺素等毒性物質，還可誘導一氧化氮合酶的表達和一氧化氮的合成增加，引起神經節細胞的氧化應激損傷[39]。Deva等[40]在兔青光眼小梁切口部位注射Cx43的反義寡核苷酸(AsODN)，手術后第5、21天檢測發現Cx43 AsODN使結膜下肌成纖維細胞活性明顯降低，瘢痕組織顯著減少。提示Cx43 AsODN作為一種無毒性的制劑對減輕臨床上小梁切除手術后的瘢痕形成有潛在價值。
4.3 AMD
人RPE細胞系ARPE-19中有大量的Cx43表達[41]。Cx43的表達下降和功能降低均可導致RPE分泌VEGF增加；而過表達Cx43可以在氧化應激條件下，抑制RPE細胞中VEGF的表達上調，使VEGF的分泌減少，進而起到拮抗新生血管形成的作用[42]。VEGF對RPE細胞中Cx43表達的影響有助于揭示VEGF與Cx43在AMD中的相互作用機制，從而為研究AMD的發病機制提供新的思路。
4.4 RP
由于視錐-視桿細胞間廣泛存在的縫隙連接，盡管RP的基因缺陷僅發生在視桿細胞，但視錐細胞最終也會受到損害。由此有學者推測，RP中死亡信號的蔓延類似于視網膜發育過程中縫隙連接介導的“旁觀者”效應[5, 43]。但最新研究發現，對RP小鼠模型敲除Cx36后，其仍然發生了繼發性的視錐細胞死亡[44]。所以，有關視桿細胞是否產生了可以通過視錐-視桿細胞之間縫隙連接的細胞毒性代謝產物，導致視錐細胞的繼發性死亡還存在爭議。
4.5 局部缺血造成的視網膜損傷
高血壓、DR、青光眼、視網膜中央動脈阻塞、缺血性視網膜中央靜脈阻塞、眼缺血綜合征均會造成視網膜局部的缺血狀態[45, 46]。在高眼壓形成的視網膜缺血中，Cx43在神經纖維層、神經節細胞、血管內皮細胞內高表達，繼而引發神經節細胞減少，星形膠質細胞增生和血管重塑[47]。Cx43阻斷劑可以降低缺血再灌注造成的血管滲漏，減少血管內皮細胞死亡，保護神經節細胞[48]。
縫隙連接介導的視網膜細胞之間的交流對神經元損傷起著重要作用[45, 46]。在小鼠激光損害的模型中，Cx36在繼發性退行性病變的神經元中高表達；在使用Cx36阻斷劑或敲除Cx36基因后，激光造成的視網膜損害加重[46]。提示Cx36在小鼠激光損害的模型中具有拮抗視網膜損傷的作用。Paschon等[45]研究發現，應用Cx36特異性阻斷劑或廣譜縫隙連接阻斷劑，對機械性損傷造成的雞視網膜細胞凋亡卻有保護作用。表明在不同的視網膜損傷模型和不同的種屬中，縫隙連接對繼發性神經元死亡可能起到相反的作用。提示深入細致地研究縫隙連接與繼發性神經元死亡之間的關系很有必要。
視網膜相鄰細胞之間的縫隙連接介導的直接電信號和小分子化學信號傳遞對視網膜的生理功能發揮重要作用[1]。縫隙連接作為廣泛存在的細胞間交流渠道，與糖尿病視網膜病變(DR)、青光眼、老年性黃斑變性(AMD)、視網膜色素變性(RP)以及視網膜損傷等視網膜疾病的發生發展密切相關[2-5]。現就縫隙連接在視網膜的生理功能和視網膜疾病中的作用綜述如下。
1 縫隙連接的基本結構、功能和組織分布
縫隙連接是相鄰細胞之間直接交換離子和一些小分子物質的通道，由相鄰細胞膜上的2個連接子相互錨定組成。連接子是由6個縫隙連接蛋白亞(Cx)單位構成的六聚體。人類Cx是由1、6、7、10、13、15、17號以及X染色體上基因編碼的相對分子質量為23×103～62×103的膜蛋白家族，包括21個成員。由6個相同的Cx構成的連接子稱為同聚體連接子，同聚體連接子組成的縫隙連接稱為同型縫隙連接；由6個不完全相同的Cx構成的連接子稱為異聚體連接子，異聚體連接子參與組成的縫隙連接稱作異型縫隙連接。另外，單個連接子也可形成溝通細胞內外的通道，即半通道型縫隙連接[6]。由于大多Cx的半衰期為數小時，因此縫隙連接的通透性很大程度與Cx的動態合成與降解密切相關[7]。
縫隙連接在細胞之間形成電偶聯、離子偶聯和代謝偶聯以加強細胞間的信息傳遞，對細胞的生長、分化等正常生理功能有重要作用[8]。其還可以放大線粒體損傷造成的細胞凋亡，進而在中樞神經系統中加重谷氨酸誘導的興奮性毒性[9, 10]。研究發現，晶狀體中有Cx43、Cx46、Cx50的表達，這些Cx可促進晶狀體的循環，維持晶狀體的正常發育和透明，而此類Cx編碼基因的突變可導致先天性白內障和眼球發育異常[11]。視網膜中亦有多種縫隙連接和Cx表達，縫隙連接與視網膜的發育、生理活動及視網膜疾病均有密切關系[1]。
2 Cx在視網膜中的表達
在視網膜相同和不同類型的細胞之間均有縫隙連接存在。不同細胞類型上可有同一種Cx表達；同一細胞類型上也可有不同種類的Cx表達，其形成高度立體化的縫隙連接模式，使視覺信息可以在視網膜中進行高效、精確的傳遞和加工[12]。視網膜中主要有Cx36、Cx43、Cx45和Cx57的表達。Kihara等[13]研究發現，在大鼠視網膜發育過程中，Cx36表達量最高，其次為Cx43和Cx45，而Cx57只有中等量的表達。Cx36是神經元之間最重要的Cx之一，存在于視錐、視桿細胞之間，紅綠視錐細胞之間，無長突細胞之間，視錐和雙極細胞之間以及多數神經節細胞亞型之間，但藍視錐細胞之間以及視桿細胞之間則不表達Cx36[14-17]。Cx43主要在神經膠質細胞中表達。在兔和小鼠視網膜的星形膠質細胞和Müller細胞中有Cx43的表達[18, 19]；而在人視網膜中，Cx43則分布于星形膠質細胞、Müller細胞和視網膜色素上皮(RPE)細胞之間[20]。Cx45在視網膜發育過程中，廣泛表達于視網膜前體細胞之中，用以維持視網膜前體細胞的增生狀態[13]；在成年小鼠視網膜中，Cx45可以構成給光型與撤光型雙極細胞到無長突細胞、神經節細胞之間的縫隙連接[21, 22]。發育中的大鼠、小鼠和兔視網膜中Cx57表達只限于水平細胞，且在胚胎后期的表達量開始增加[13, 23, 24]。
3 縫隙連接在視網膜中的生理功能
縫隙連接是中樞神經系統神經元之間直接、迅速進行信息交流的結構基礎。視網膜作為中樞神經系統的外延，是經縫隙連接進行信息交流的典型范例[25]。在視網膜發育過程中，縫隙連接可以調控神經上皮層的增生和凋亡，視網膜各層的遷移和分層，以及參與突觸發生和神經環路的形成[26]。然而，神經元-神經網絡的發育過程是各種縫隙連接相互協調的結果，其精細的調節機制還需進一步研究。
在成熟的視網膜中，Cx36存在于光感受器細胞之間以及無長突細胞與節細胞之間，構成這些視網膜神經元之間的縫隙連接偶聯。視錐細胞之間的縫隙連接偶聯能夠有效提高“信噪比”，視錐-視桿細胞之間的偶聯能夠為視桿信號進入視錐途徑提供直接通路，而部分無長突細胞與神經節細胞亞型之間的偶聯與視網膜到大腦的同步電活動有關[14, 17]。Cx36還廣泛存在于視桿細胞、視錐細胞和AⅡ型無長突細胞之間。在Cx36基因敲除的小鼠視網膜中，由視桿細胞介導的給光中心型反應在神經節細胞層面上完全消失[27]。鑒于視桿細胞通路在暗光覺信號傳遞中的重要作用，Cx36組成的縫隙連接被認為是夜視力中最重要的偶聯[28]。Cx43在視網膜的生理作用尚缺乏明確的認識，在中樞神經系統，星形膠質細胞可以通過Cx43構成的縫隙連接形成功能性合胞體，維持神經元細胞外環境的穩態[29]。我們推測，視網膜中的Cx43也可能起類似作用。Cx45構成的縫隙連接可以起到傳遞視桿細胞源信號的作用[21, 22]；這種縫隙連接亦可存在于雙層神經節細胞之間，其兩側存在的電壓差可能與維持視覺信號傳遞的方向性有關[30]。由于Cx57在視網膜中的表達只限于水平細胞，因此利用內源性Cx57基因啟動子驅動表達的白喉毒素受體系統可以選擇性地在視網膜中去除水平細胞。水平細胞在生理狀態下，可通過反饋和前饋抑制來調節光感受器細胞和雙極細胞之間的信號傳遞；而失去水平細胞后，視桿細胞的軸突從外叢狀層萎縮，部分視桿細胞退行性病變，但視錐細胞基本存活。另外，失去水平細胞造成視網膜外層的形態學改變對節細胞層的電生理功能和動物視功能影響不大[31]。提示視網膜具有網絡代償能力。另有研究表明，Cx57對維持水平細胞的細胞膜性能起重要作用，基因敲除小鼠水平細胞中的Cx57可以導致此類細胞的感受域明顯減小[32]。
4 縫隙連接在視網膜疾病中的作用
4.1 DR
正常情況下，縫隙連接介導的細胞間交流有助于維持血視網膜屏障的完整性。Sato等[33]研究發現，高糖刺激下血管內皮細胞中的Cx43 mRNA水平降低30%，而Cx43蛋白表達下降45%。另外，高糖可使Cx43蛋白磷酸化失活，進而使血管內皮細胞間交流減少，造成細胞間平衡的破壞，損害血視網膜屏障[34]。在細胞器水平上，高糖處理后的血管內皮細胞線粒體上Cx43明顯減少，導致血管內皮細胞線粒體形態改變、裂解、細胞色素C釋放以及血管內皮細胞凋亡，這種線粒體的功能障礙在糖尿病誘發的細胞凋亡中起重要作用[35]。Manasson等[36]研究發現，高糖刺激亦可使Cx30.2表達下降，減少血管內皮細胞間縫隙連接的數目。Cx30.2基因敲除小鼠也表現出視網膜中異常毛細血管增加和周細胞減少。這些研究結果表明，Cx30.2的表達下調在促進DR特征性血管損害和視網膜血管平衡破壞過程中起到一定的作用。Shibata等[37]研究發現，糖尿病引起的縫隙連接偶聯破壞可以損害視盤血流的自身調節能力，對內層視網膜的代謝產生不利影響。縫隙連接在DR發病機制中的研究為早期實施DR干預措施提供了理論支持。
4.2 青光眼
視盤的星形膠質細胞為神經節細胞及其軸突提供支持和營養作用，由Cx43構成的星形膠質細胞合胞體對神經節細胞的離子和代謝平衡意義重大[38]。Malone等[38]研究發現，液體壓力可以引起星形膠質細胞的細胞膜上Cx43數量減少，細胞漿中Cx43數量增加，以及Cx43磷酸化失活和由Cx43所組成的縫隙連接關閉。這些改變進一步打破了視網膜節細胞軸突的穩態，最終導致以視盤重塑為特征的青光眼視神經病變。Kerr等[3]研究發現，原發性開角型青光眼患者視盤周圍和視網膜中周部神經節細胞層Cx43表達增加，并且Cx43的表達上調與星形膠質細胞活化增生表現出來的形態學肥大和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)陽性染色有關。長期過度的膠質細胞增生可以釋放活性氧離子、細胞因子和前列腺素等毒性物質，還可誘導一氧化氮合酶的表達和一氧化氮的合成增加，引起神經節細胞的氧化應激損傷[39]。Deva等[40]在兔青光眼小梁切口部位注射Cx43的反義寡核苷酸(AsODN)，手術后第5、21天檢測發現Cx43 AsODN使結膜下肌成纖維細胞活性明顯降低，瘢痕組織顯著減少。提示Cx43 AsODN作為一種無毒性的制劑對減輕臨床上小梁切除手術后的瘢痕形成有潛在價值。
4.3 AMD
人RPE細胞系ARPE-19中有大量的Cx43表達[41]。Cx43的表達下降和功能降低均可導致RPE分泌VEGF增加；而過表達Cx43可以在氧化應激條件下，抑制RPE細胞中VEGF的表達上調，使VEGF的分泌減少，進而起到拮抗新生血管形成的作用[42]。VEGF對RPE細胞中Cx43表達的影響有助于揭示VEGF與Cx43在AMD中的相互作用機制，從而為研究AMD的發病機制提供新的思路。
4.4 RP
由于視錐-視桿細胞間廣泛存在的縫隙連接，盡管RP的基因缺陷僅發生在視桿細胞，但視錐細胞最終也會受到損害。由此有學者推測，RP中死亡信號的蔓延類似于視網膜發育過程中縫隙連接介導的“旁觀者”效應[5, 43]。但最新研究發現，對RP小鼠模型敲除Cx36后，其仍然發生了繼發性的視錐細胞死亡[44]。所以，有關視桿細胞是否產生了可以通過視錐-視桿細胞之間縫隙連接的細胞毒性代謝產物，導致視錐細胞的繼發性死亡還存在爭議。
4.5 局部缺血造成的視網膜損傷
高血壓、DR、青光眼、視網膜中央動脈阻塞、缺血性視網膜中央靜脈阻塞、眼缺血綜合征均會造成視網膜局部的缺血狀態[45, 46]。在高眼壓形成的視網膜缺血中，Cx43在神經纖維層、神經節細胞、血管內皮細胞內高表達，繼而引發神經節細胞減少，星形膠質細胞增生和血管重塑[47]。Cx43阻斷劑可以降低缺血再灌注造成的血管滲漏，減少血管內皮細胞死亡，保護神經節細胞[48]。
縫隙連接介導的視網膜細胞之間的交流對神經元損傷起著重要作用[45, 46]。在小鼠激光損害的模型中，Cx36在繼發性退行性病變的神經元中高表達；在使用Cx36阻斷劑或敲除Cx36基因后，激光造成的視網膜損害加重[46]。提示Cx36在小鼠激光損害的模型中具有拮抗視網膜損傷的作用。Paschon等[45]研究發現，應用Cx36特異性阻斷劑或廣譜縫隙連接阻斷劑，對機械性損傷造成的雞視網膜細胞凋亡卻有保護作用。表明在不同的視網膜損傷模型和不同的種屬中，縫隙連接對繼發性神經元死亡可能起到相反的作用。提示深入細致地研究縫隙連接與繼發性神經元死亡之間的關系很有必要。