糖尿病視網膜病變(DR)神經損傷病理機制的研究顯示高血糖、谷氨酸興奮毒性損傷、氧化應激、神經營養因子缺乏等在損傷中發揮重要作用。多種藥物被用來研究DR的神經保護, 主要包括調控血糖、抑制谷氨酸興奮性毒性損傷、減少氧化應激、補充神經營養因子等機制中的一種或幾種發揮作用。間充質干細胞多向分化潛能、分泌細胞因子功能可為受損視網膜提供保護, 可成為將來研究的熱點。
引用本文： 王月欣, 陳松. 糖尿病視網膜病變神經損傷的發病機制和保護防治研究進展. 中華眼底病雜志, 2014, 30(2): 209-211. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.02.026 復制
糖尿病視網膜病變(DR)是一種神經血管性病變，在微血管系統出現病變前已存在神經組織的損傷。其病理特征包括神經元凋亡、神經膠質細胞活躍及內層視網膜變薄[1-3]。這與糖尿病患者的視網膜電圖(ERG)檢查結果異常、暗適應下降、對比敏感度下降、色覺異常、微視野差異相吻合[4]。神經組織損傷后的再生能力較差，越來越多的研究開始關注神經保護在DR治療中的重要作用。本文就當前DR神經損傷的病理機制和神經保護藥物方面的研究作一綜述。
1 DR神經損傷機制
DR神經損傷最早于1998年提出[5]，目前機制尚未明確。神經元凋亡和反應性神經膠質細胞增生是DR神經損傷的主要病理改變。視網膜神經節細胞最早受損同時也是凋亡率最高的細胞[6]。有研究顯示4周的糖尿病大鼠即可出現視網膜神經節細胞和少量光感受器細胞凋亡，隨后光感受器細胞凋亡率明顯增加；3個月時外核層細胞、無長突細胞和少數水平細胞發生壞死、缺失，同時視網膜內Müller細胞明顯增多[7]。Kern等[8]的研究證實DR的進展中發生視網膜內層神經細胞凋亡。Valverde等[9]發現早期DR患者微血管系統未出現改變前，視網膜組織中泛素配體(Fas L)、凋亡蛋白-3、凋亡蛋白-8等促凋亡因子表達增加，相對的抗凋亡因子卻未見明顯改變。可能是由于凋亡與抗凋亡因子之間的不平衡性在DR的早期階段介導神經視網膜的損傷所致。高血糖代謝障礙、谷氨酸興奮毒性產物、氧化應激等多種損傷因子增強和腦源性神經營養因子(BDNF)、色素上皮衍生因子(PEDF)、神經生長因子(NGF)、促紅細胞生成素(EPO)、血管內皮生長因子(VEGF)等神經保護因子缺乏破壞視網膜神經毒性損傷與神經保護因素之間的平衡，導致視網膜神經元凋亡、反應性神經膠質細胞增生[10]。
1.1 高血糖
高血糖導致視網膜代謝紊亂，對DR的神經損傷早于臨床血管病變[11-13]。過量葡萄糖通過多元醇通路和己糖胺通路損傷線粒體，使還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和還原型谷胱甘肽(GSH)下降介導氧化應激反應，放大對視網膜組織的損傷。Rolo和Palmeira[14]研究表明高血糖作用于線粒體電子傳遞鏈生成大量活性氧(ROS)，在DR的早期可導致周細胞和神經細胞的凋亡。其他高血糖誘導途徑包括激活的蛋白激酶C(PKC)和增加糖基化終末產物，導致氧化應激增加。
1.2 谷氨酸興奮毒性
谷氨酸在視網膜內代謝障礙，導致細胞外間隙谷氨酸含量增加，介導DR神經損傷的發展[15]。DR視網膜組織谷氨酸代謝障礙機制包括：(1)谷氨酸轉化為α-酮戊二酸能力下降；(2)Müller細胞的谷氨酰胺酶含量下降導致谷氨酸向谷氨酰胺轉化能力下降；(3)神經膠質細胞攝取谷氨酸能力下降，阻礙谷氨酸進入Müller細胞進行代謝，均可導致視網膜細胞外間隙谷氨酸異常增高。早期視網膜神經節細胞與谷氨酸代謝相關的谷氨酸轉運體和離子型谷氨酸受體基因表達下降，同時谷氨酸轉運體SLC1A3表達下降導致Müller細胞對細胞外隙谷氨酸攝取能力下降，降低谷氨酸轉運及代謝能力[16]。過量的谷氨酸激活N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體活化，Ca2+內流，產生興奮性毒性損傷，引起神經細胞凋亡和自由基產生[17]。
1.3 神經營養因子缺乏
神經營養因子在改善神經細胞存活與凋亡中發揮重要作用。糖尿病能夠改變視網膜內BDNF、VEGF、NGF等視網膜神經營養因子的表達，導致視網膜神經損傷[18]。視網膜內成熟神經營養因子釋放后，通過與酪氨酸激酶受體(Trks)配體結合，激活各種絲氨酸-蘇氨酸激酶對神經細胞與非神經細胞的生長、增生與穩定發揮作用。Ola等[19]研究發現DR視網膜組織內神經營養因子減少，可增強凋亡蛋白3活性，進而激活凋亡蛋白途徑，介導神經元凋亡發生。
2 神經保護治療策略
多種藥物用于研究DR的神經保護，一方面改善新陳代謝異常引起的損傷，如降低高血糖、抑制谷氨酸興奮毒性、降低氧化應激等；另一方面增加視網膜組織對損傷的抵抗力，如增加營養素和維生素攝入、補充神經營養因子均在DR的神經保護治療中發揮重要作用。
2.1 降低代謝損傷
降低高血糖、谷氨酸興奮毒性、氧化應激等代謝損傷對DR的神經保護具有重要作用。胰島素、碳酸酐酶抑制劑等降血糖藥物，均證實對視網膜神經組織具有保護作用[20, 21]。Gaspar等[22]將牛磺酸與高血糖損傷的視網膜神經節細胞體外共培養，結果顯示能明顯降低高血糖引起的氧化應激，蛋白質羰基化合物、ROS等氧化應激產物的生成減少，從而減少線粒體釋放凋亡誘導因子(AIF)，降低視網膜神經細胞凋亡。
谷氨酸介導NMDA受體過度活化引起興奮性毒性損傷，地卓西平馬來酸鹽(Dizocilpine，MK-801)作為NMDA受體抑制劑將會有效減少興奮性毒性介導的神經節細胞凋亡[23]；美金剛(Memantine)通過降低高血糖、干預谷氨酸介導的神經毒性損傷發揮神經保護作用[24]；噴他佐辛(Pentazocine)是一種σ1受體的配體，通過降低凋亡蛋白-3活性、減少ROS活性發揮神經保護作用[25]。
通過酶和非酶的途徑增加內源性抗氧化防御機制可降低氧化應激、平衡ROS引起的視網膜損傷。常見的抗氧化劑包括維生素A、C、E和GSH、錳超氧化物歧化酶(MnSOD)等[26]。Zuo等[27]將姜黃素注射到鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠腹腔內，檢測到視網膜內Müller細胞發生氧化應激的中間物質-膠質纖維酸性蛋白和谷氨酰胺合成酶含量下降，提示姜黃素可能通過降低Müller細胞的氧化應激反應來保護視網膜。Ola等[28]研究顯示，替米沙坦通過增加視網膜抗氧化劑GSH含量、增強神經營養保護，減少DR神經細胞凋亡的發生。然而抗氧化劑的生物利用率較差或無法透過血視網膜屏障限制了該類藥物的臨床應用。
2.2 補充神經營養因子
BDNF、VEGF、NGF等生長因子對DR具有神經保護作用[29]。其中BDNF影響細胞分化、突觸連接、可塑性、生長和細胞生存。Ola等[30]研究發現DR視網膜內BDNF含量下降可導致視網膜神經損傷，凋亡蛋白-3表達增加量與BDNF下降程度具有相關性，提出BDNF減少導致的視網膜神經損傷機制可能與其參與凋亡有關。Seki等[31]研究證實糖尿病大鼠視網膜內BDNF表達量下降可損傷視網膜神經組織，經玻璃體腔注射BDNF后視網膜神經損傷減弱，其機制可能是眼內注射BDNF能夠減少無長突多巴胺能神經細胞的凋亡、降低酪氨酸羥化酶的免疫活性。
外源性EPO能夠抑制DR早期神經細胞的凋亡。Zhang等[32]發現在STZ誘導的糖尿病大鼠玻璃體腔內注射EPO可同時發揮神經血管保護作用。近來有研究證實對DR小鼠經腹腔長期注射低劑量EPO能夠降低是視網膜神經節細胞的凋亡，明顯延緩視網膜神經退行性病變的進展[33]。Chen等[34]認為DR早期應用EPO可保護視網膜神經組織，減少其凋亡的發生。然而，一旦出現視網膜新生血管，視網膜內EPOmRNA表達量絕對增加后，此時外源性EPO則發揮促血管生成作用，加重病情進展。考慮到EPO的促血管生成及血栓形成的風險，McVicar等[35]將EPO中具有神經保護作用的蛋白質片段(pHBSP多肽)分離出來對糖尿病大鼠進行干預，不僅可顯著降低視網膜神經組織和血管損傷，同時血細胞比容及新生血管均未見增加。
VEGF對保持內皮細胞完整性及神經細胞保護方面具有重要作用。Zachary等[36]發現VEGF對正常成人視網膜具有神經保護作用。Nishijima等[37]給予大鼠抗VEGF藥物阻斷視網膜VEGF受體，發現視網膜神經節細胞凋亡量與藥物的劑量具有相關性。有關VEGF在DR神經損傷中的作用有待進一步研究。外源性神經營養因子種類繁多，其臨床療效正待進一步發現，兩種及以上營養因子聯合使用的效果有待進一步觀察。然而局部應用外源性神經營養因子存在需多次注射且因子活性容易失活等缺點，限制其在臨床上的廣泛應用[38]。如何將外源性神經營養因子安全有效的移植到DR患者體內是該類藥物臨床應用研究的難點問題之一。
2.3 間充質干細胞(MSC)
MSC是中胚層的一類多能干細胞，具有定向分化替代受損細胞、抗炎、調節免疫、神經營養保護、抗凋亡、抑制血管新生等多種生物學作用，成為視網膜神經退性病變理想的種子細胞之一。其中分化為視網膜功能細胞和旁分泌神經營養因子作用值得進一步研究[39]。
Yang等[40]發現MSC不僅能夠改善全身的血糖，還能定值于視網膜組織內，分化為光感受器細胞和星形膠質細胞，提高視網膜組織完整性。Scalinci等[41]發現MSC可以通過分泌神經營養因子降低視網膜神經細胞的凋亡，從而延緩DR的進展。MSC體外培養可分泌多種神經營養因子，使MSC移植比局部單純應用生長因子更具優勢[38]。MSC在體內歸巢能力及其促VEGF表達的調節，是該類細胞在DR的研究應用中值得思考的問題，聯合使用阿托伐他汀或許能夠解決這一問題[42]。盡管MSC在疾病的應用研究中尚未發現腫瘤形成及其他副作用[43]，但MSC的成腫瘤風險依然存在。此外MSC來源、移植免疫、自身增生能力、倫理學障礙等都影響了這類細胞在研究中的應用。
3 展望
DR的發病機制一直都是研究的熱點，神經損傷機制的研究為DR的防治提供了新的治療方向，神經保護治療成為改善DR患者生存質量的一項重要策略。神經損傷發生在DR的早期，高血糖、谷氨酸代謝障礙、氧化應激等在DR的神經損傷中發揮重要作用；視網膜保護機制的減弱如BDNF、PEDF、NGF、EPO、VEGF等神經營養因子的缺乏，在DR的神經損傷中重要性亦引起大家的關注。當前很多藥物正試驗性的用于該類疾病的治療，具體療效有待進一步研究[44]。MSC一方面可以分化為視網膜功能細胞替換受損組織，另一方面還通過調節血糖、分泌眾多營養因子等途徑增強神經保護因素，在DR的治療中具有很好的應用前景。理論上來講，MSC可以通過DR患者調節血糖、減少谷氨酸興奮毒性損傷、降低氧化應激、分化為受損的視網膜組織、作為基因載體等機制中的兩種及以上改善或延緩DR的進展，其療效及安全性有待進一步研究[45]。
糖尿病視網膜病變(DR)是一種神經血管性病變，在微血管系統出現病變前已存在神經組織的損傷。其病理特征包括神經元凋亡、神經膠質細胞活躍及內層視網膜變薄[1-3]。這與糖尿病患者的視網膜電圖(ERG)檢查結果異常、暗適應下降、對比敏感度下降、色覺異常、微視野差異相吻合[4]。神經組織損傷后的再生能力較差，越來越多的研究開始關注神經保護在DR治療中的重要作用。本文就當前DR神經損傷的病理機制和神經保護藥物方面的研究作一綜述。
1 DR神經損傷機制
DR神經損傷最早于1998年提出[5]，目前機制尚未明確。神經元凋亡和反應性神經膠質細胞增生是DR神經損傷的主要病理改變。視網膜神經節細胞最早受損同時也是凋亡率最高的細胞[6]。有研究顯示4周的糖尿病大鼠即可出現視網膜神經節細胞和少量光感受器細胞凋亡，隨后光感受器細胞凋亡率明顯增加；3個月時外核層細胞、無長突細胞和少數水平細胞發生壞死、缺失，同時視網膜內Müller細胞明顯增多[7]。Kern等[8]的研究證實DR的進展中發生視網膜內層神經細胞凋亡。Valverde等[9]發現早期DR患者微血管系統未出現改變前，視網膜組織中泛素配體(Fas L)、凋亡蛋白-3、凋亡蛋白-8等促凋亡因子表達增加，相對的抗凋亡因子卻未見明顯改變。可能是由于凋亡與抗凋亡因子之間的不平衡性在DR的早期階段介導神經視網膜的損傷所致。高血糖代謝障礙、谷氨酸興奮毒性產物、氧化應激等多種損傷因子增強和腦源性神經營養因子(BDNF)、色素上皮衍生因子(PEDF)、神經生長因子(NGF)、促紅細胞生成素(EPO)、血管內皮生長因子(VEGF)等神經保護因子缺乏破壞視網膜神經毒性損傷與神經保護因素之間的平衡，導致視網膜神經元凋亡、反應性神經膠質細胞增生[10]。
1.1 高血糖
高血糖導致視網膜代謝紊亂，對DR的神經損傷早于臨床血管病變[11-13]。過量葡萄糖通過多元醇通路和己糖胺通路損傷線粒體，使還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和還原型谷胱甘肽(GSH)下降介導氧化應激反應，放大對視網膜組織的損傷。Rolo和Palmeira[14]研究表明高血糖作用于線粒體電子傳遞鏈生成大量活性氧(ROS)，在DR的早期可導致周細胞和神經細胞的凋亡。其他高血糖誘導途徑包括激活的蛋白激酶C(PKC)和增加糖基化終末產物，導致氧化應激增加。
1.2 谷氨酸興奮毒性
谷氨酸在視網膜內代謝障礙，導致細胞外間隙谷氨酸含量增加，介導DR神經損傷的發展[15]。DR視網膜組織谷氨酸代謝障礙機制包括：(1)谷氨酸轉化為α-酮戊二酸能力下降；(2)Müller細胞的谷氨酰胺酶含量下降導致谷氨酸向谷氨酰胺轉化能力下降；(3)神經膠質細胞攝取谷氨酸能力下降，阻礙谷氨酸進入Müller細胞進行代謝，均可導致視網膜細胞外間隙谷氨酸異常增高。早期視網膜神經節細胞與谷氨酸代謝相關的谷氨酸轉運體和離子型谷氨酸受體基因表達下降，同時谷氨酸轉運體SLC1A3表達下降導致Müller細胞對細胞外隙谷氨酸攝取能力下降，降低谷氨酸轉運及代謝能力[16]。過量的谷氨酸激活N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體活化，Ca2+內流，產生興奮性毒性損傷，引起神經細胞凋亡和自由基產生[17]。
1.3 神經營養因子缺乏
神經營養因子在改善神經細胞存活與凋亡中發揮重要作用。糖尿病能夠改變視網膜內BDNF、VEGF、NGF等視網膜神經營養因子的表達，導致視網膜神經損傷[18]。視網膜內成熟神經營養因子釋放后，通過與酪氨酸激酶受體(Trks)配體結合，激活各種絲氨酸-蘇氨酸激酶對神經細胞與非神經細胞的生長、增生與穩定發揮作用。Ola等[19]研究發現DR視網膜組織內神經營養因子減少，可增強凋亡蛋白3活性，進而激活凋亡蛋白途徑，介導神經元凋亡發生。
2 神經保護治療策略
多種藥物用于研究DR的神經保護，一方面改善新陳代謝異常引起的損傷，如降低高血糖、抑制谷氨酸興奮毒性、降低氧化應激等；另一方面增加視網膜組織對損傷的抵抗力，如增加營養素和維生素攝入、補充神經營養因子均在DR的神經保護治療中發揮重要作用。
2.1 降低代謝損傷
降低高血糖、谷氨酸興奮毒性、氧化應激等代謝損傷對DR的神經保護具有重要作用。胰島素、碳酸酐酶抑制劑等降血糖藥物，均證實對視網膜神經組織具有保護作用[20, 21]。Gaspar等[22]將牛磺酸與高血糖損傷的視網膜神經節細胞體外共培養，結果顯示能明顯降低高血糖引起的氧化應激，蛋白質羰基化合物、ROS等氧化應激產物的生成減少，從而減少線粒體釋放凋亡誘導因子(AIF)，降低視網膜神經細胞凋亡。
谷氨酸介導NMDA受體過度活化引起興奮性毒性損傷，地卓西平馬來酸鹽(Dizocilpine，MK-801)作為NMDA受體抑制劑將會有效減少興奮性毒性介導的神經節細胞凋亡[23]；美金剛(Memantine)通過降低高血糖、干預谷氨酸介導的神經毒性損傷發揮神經保護作用[24]；噴他佐辛(Pentazocine)是一種σ1受體的配體，通過降低凋亡蛋白-3活性、減少ROS活性發揮神經保護作用[25]。
通過酶和非酶的途徑增加內源性抗氧化防御機制可降低氧化應激、平衡ROS引起的視網膜損傷。常見的抗氧化劑包括維生素A、C、E和GSH、錳超氧化物歧化酶(MnSOD)等[26]。Zuo等[27]將姜黃素注射到鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠腹腔內，檢測到視網膜內Müller細胞發生氧化應激的中間物質-膠質纖維酸性蛋白和谷氨酰胺合成酶含量下降，提示姜黃素可能通過降低Müller細胞的氧化應激反應來保護視網膜。Ola等[28]研究顯示，替米沙坦通過增加視網膜抗氧化劑GSH含量、增強神經營養保護，減少DR神經細胞凋亡的發生。然而抗氧化劑的生物利用率較差或無法透過血視網膜屏障限制了該類藥物的臨床應用。
2.2 補充神經營養因子
BDNF、VEGF、NGF等生長因子對DR具有神經保護作用[29]。其中BDNF影響細胞分化、突觸連接、可塑性、生長和細胞生存。Ola等[30]研究發現DR視網膜內BDNF含量下降可導致視網膜神經損傷，凋亡蛋白-3表達增加量與BDNF下降程度具有相關性，提出BDNF減少導致的視網膜神經損傷機制可能與其參與凋亡有關。Seki等[31]研究證實糖尿病大鼠視網膜內BDNF表達量下降可損傷視網膜神經組織，經玻璃體腔注射BDNF后視網膜神經損傷減弱，其機制可能是眼內注射BDNF能夠減少無長突多巴胺能神經細胞的凋亡、降低酪氨酸羥化酶的免疫活性。
外源性EPO能夠抑制DR早期神經細胞的凋亡。Zhang等[32]發現在STZ誘導的糖尿病大鼠玻璃體腔內注射EPO可同時發揮神經血管保護作用。近來有研究證實對DR小鼠經腹腔長期注射低劑量EPO能夠降低是視網膜神經節細胞的凋亡，明顯延緩視網膜神經退行性病變的進展[33]。Chen等[34]認為DR早期應用EPO可保護視網膜神經組織，減少其凋亡的發生。然而，一旦出現視網膜新生血管，視網膜內EPOmRNA表達量絕對增加后，此時外源性EPO則發揮促血管生成作用，加重病情進展。考慮到EPO的促血管生成及血栓形成的風險，McVicar等[35]將EPO中具有神經保護作用的蛋白質片段(pHBSP多肽)分離出來對糖尿病大鼠進行干預，不僅可顯著降低視網膜神經組織和血管損傷，同時血細胞比容及新生血管均未見增加。
VEGF對保持內皮細胞完整性及神經細胞保護方面具有重要作用。Zachary等[36]發現VEGF對正常成人視網膜具有神經保護作用。Nishijima等[37]給予大鼠抗VEGF藥物阻斷視網膜VEGF受體，發現視網膜神經節細胞凋亡量與藥物的劑量具有相關性。有關VEGF在DR神經損傷中的作用有待進一步研究。外源性神經營養因子種類繁多，其臨床療效正待進一步發現，兩種及以上營養因子聯合使用的效果有待進一步觀察。然而局部應用外源性神經營養因子存在需多次注射且因子活性容易失活等缺點，限制其在臨床上的廣泛應用[38]。如何將外源性神經營養因子安全有效的移植到DR患者體內是該類藥物臨床應用研究的難點問題之一。
2.3 間充質干細胞(MSC)
MSC是中胚層的一類多能干細胞，具有定向分化替代受損細胞、抗炎、調節免疫、神經營養保護、抗凋亡、抑制血管新生等多種生物學作用，成為視網膜神經退性病變理想的種子細胞之一。其中分化為視網膜功能細胞和旁分泌神經營養因子作用值得進一步研究[39]。
Yang等[40]發現MSC不僅能夠改善全身的血糖，還能定值于視網膜組織內，分化為光感受器細胞和星形膠質細胞，提高視網膜組織完整性。Scalinci等[41]發現MSC可以通過分泌神經營養因子降低視網膜神經細胞的凋亡，從而延緩DR的進展。MSC體外培養可分泌多種神經營養因子，使MSC移植比局部單純應用生長因子更具優勢[38]。MSC在體內歸巢能力及其促VEGF表達的調節，是該類細胞在DR的研究應用中值得思考的問題，聯合使用阿托伐他汀或許能夠解決這一問題[42]。盡管MSC在疾病的應用研究中尚未發現腫瘤形成及其他副作用[43]，但MSC的成腫瘤風險依然存在。此外MSC來源、移植免疫、自身增生能力、倫理學障礙等都影響了這類細胞在研究中的應用。
3 展望
DR的發病機制一直都是研究的熱點，神經損傷機制的研究為DR的防治提供了新的治療方向，神經保護治療成為改善DR患者生存質量的一項重要策略。神經損傷發生在DR的早期，高血糖、谷氨酸代謝障礙、氧化應激等在DR的神經損傷中發揮重要作用；視網膜保護機制的減弱如BDNF、PEDF、NGF、EPO、VEGF等神經營養因子的缺乏，在DR的神經損傷中重要性亦引起大家的關注。當前很多藥物正試驗性的用于該類疾病的治療，具體療效有待進一步研究[44]。MSC一方面可以分化為視網膜功能細胞替換受損組織，另一方面還通過調節血糖、分泌眾多營養因子等途徑增強神經保護因素，在DR的治療中具有很好的應用前景。理論上來講，MSC可以通過DR患者調節血糖、減少谷氨酸興奮毒性損傷、降低氧化應激、分化為受損的視網膜組織、作為基因載體等機制中的兩種及以上改善或延緩DR的進展，其療效及安全性有待進一步研究[45]。