引用本文： 陳慶中, 江楓, 毛春潔, 顏華. 血管內皮生長抑制因子在糖尿病視網膜病變大鼠中的表達. 中華眼底病雜志, 2014, 30(2): 180-186. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.02.015 復制
血管內皮生長因子(VEGF)在糖尿病視網膜病變(DR)的發病機制中起到了關鍵作用[1-3]。血管內皮生長抑制因子(VEGI)是一種以自分泌形式表達于內皮細胞的多功能細胞因子，主要作用于內皮細胞，有顯著的抑制病理性新生血管(NV)生成、誘導增生期內皮細胞凋亡的作用[4, 5]。腫瘤壞死因子樣配體1(TL1A)是VEGI在活體內表達量最多且生物活性最大的一種亞型[6]。VEGI與腫瘤壞死因子(TNF)α(TNF-α)和白細胞介素1β(IL-1β)一起參與了輔助性T細胞1免疫反應，在腫瘤與某些自身免疫疾病的發病機制中發揮作用[4, 5]。我們早期的研究結果顯示，VEGI在增生型DR(PDR)患者的血清和玻璃體液中濃度顯著升高，經過激光光凝與手術的治療，視網膜缺血缺氧狀況改善后，VEGI濃度明顯降低[6]。提示VEGI可能參與DR的發生發展過程。為了更詳細地研究VEGI在DR發生發展過程中的表達情況，我們對TL1A、VEGF、TNF-α、IL-1β在不同病程糖尿病(DM)大鼠的外周血、玻璃體和視網膜組織中的表達進行了研究，以探討TL1A在DR發病機制中的作用，以及其與VEGF、TNF-α、IL-1β的關系。
1 材料和方法
由中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所實驗動物中心[實驗動物資質號scxk(軍)2009-003]提供的70只6周齡雄性Wistar大鼠，體重200～250 g。飼養于標準化動物中心且無特定病原體動物級動物房，自由攝食飲水。將大鼠進行隨機分入空白對照組和3個DM實驗組。其中，空白對照組10只，DM 1、3、6個月組各20只。采用文獻[7]的方法及標準建立大鼠DM模型，選取腹腔注射鏈脲佐菌素72 h后血糖達成模標準要求的16.5～22.5 mmol/L的大鼠納入DM實驗組。實驗期間每2周監測大鼠血糖，使DM實驗組大鼠血糖維持在成模標準要求的范圍，直至實驗結束。
DM大鼠模型建立后，分別于1、3、6個月時經股動脈取血2 ml置于無依地酸的真空采血管中，室溫靜置20 min，血液自然凝固后于20 ℃、離心半徑150 mm、2000 r/min離心10 min，取上層血清立即置于-80 ℃冰箱保存待測。腹腔注射10%水合氯醛麻醉后迅速摘取左眼球，無菌手術器械剪開角膜緣，取出玻璃體，保存于無菌的1.5 ml離心管中并迅速置于-80 ℃冰箱保存待測。同時摘取右眼球，置于4%多聚甲醛固定24 h。
采用翔天試劑公司進口分裝大鼠TL1A、VEGF、TNF-α、IL-1β成套試劑盒和奧地利SPECTRA-Ⅲ型酶標儀行酶聯免疫吸附測定(ELISA)。試劑盒靈敏度為＜0.5 ng/L。檢測前將待測樣本放置于20～28 ℃的室溫下平衡解凍，在30 min內檢測，讀取450 nm下的吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值。按試劑盒說明書操作，根據不同濃度標準品所測的A值繪制標準曲線。在標準曲線圖上根據每個待測樣本的A值查找出其相對應的濃度，重復檢測3次，取算術平均數作為實驗結果。
將經多聚甲醛固定24 h的右眼球常規脫水，石蠟包埋后連續切片，切片厚度5 μm。采用美國Abcam公司的抗大鼠TL1A、VEGF、TNF-α、IL-1β抗體行石蠟切片免疫組織化學技術檢測，二胺基聯苯胺(DAB)顯色，每個指標檢測6次；參照文獻[8]的方法，采用Image-Pro Plus 6.0分析軟件處理檢測結果，以各因子平均A值作為其表達強度值。余下切片行蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡觀察視網膜組織的病理變化。
采用SPSS 13.0統計學軟件進行統計學分析。數據用均數±標準差(
2 結果
ELISA檢測結果顯示，空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠血清TL1A濃度比較，差異有統計學意義(F=77.405，P＜0.05)；與空白對照組比較，DM 1、3、6個月組大鼠血清TL1A濃度顯著升高，差異均有統計學意義(t=-9.712、2.513、7.891，P＜0.05)；DM實驗組間大鼠血清TL1A濃度兩兩比較，差異均有統計學意義(t=9.164、2.473、12.958，P＜0.05)；LSD法多重比較結果顯示，空白對照組與3個DM實驗組間TL1A濃度比較，差異有統計學意義(P＜0.05)(表 1)。空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠血清VEGF濃度比較，差異無統計學意義(F=1.242，P＞0.05)(表 1)。空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠血清TNF-α濃度比較，差異有統計學意義(F=3.508，P＜0.05)；其中，DM 1個月組與空白對照組間大鼠血清TNF-α濃度比較，差異無統計學意義(t=-1.452，P＞0.05)，DM 3、6個月組與空白對照組間大鼠血清TNF-α濃度比較，差異有統計學意義(t=-2.217、-3.283，P＜0.05)；LSD法多重比較結果顯示，空白對照組與DM 3、6個月組間TNF-α濃度比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，其余組間TNF-α濃度比較，差異無統計學意義(P＞0.05)(表 1)。空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠血清IL-1β濃度比較，差異有統計學意義(F=15.416，P＜0.05)；與空白對照組比較，DM 1、3、6個月組大鼠血清IL-1β濃度顯著升高，差異均有統計學意義(t=-4.364、-5.601、-6.174，P＜0.05)；DM 1個月組與DM 6個月組間大鼠血清IL-1β濃度比較，差異有統計學意義(t=-2.184，P＜0.05)，DM 3個月組與DM 1、6個月組間大鼠血清IL-1β濃度比較，差異無統計學意義(t=-1.334、-0.916，P＞0.05)；LSD多重比較結果顯示，空白對照組與3個DM實驗組間IL-1β濃度比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，DM 1個月組與DM 6個月組間IL-1β濃度比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，其余組間IL-1β濃度比較，差異無統計學意義(P＞0.05)(表 1)。
表1
各組大鼠血清TL1A、VEGF、TNF-α、IL-1β檢測結果(空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠玻璃體液TL1A濃度比較，差異有統計學意義(F=114.777，P＜0.05)；與空白對照組比較，DM 1、3、6個月組大鼠玻璃體液TL1A濃度顯著降低，差異均有統計學意義(t=7.298、14.595、15.312，P＜0.05)；DM 1個月組與DM 3、6個月組間大鼠玻璃體液TL1A濃度比較，差異均有統計學意義(t=7.423、8.135，P＜0.05)，DM 3個月組與DM 6個月組間大鼠玻璃體液TL1A濃度比較，差異無統計學意義(t=0.673，P＞0.05)；LSD法多重比較結果顯示，空白對照組與3個DM實驗組間TL1A濃度比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)，DM 1個月組與DM 3、6個月組間TL1A濃度比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，而DM 3個月組與DM 6個月組間TL1A濃度比較，差異無統計學意義(P＞0.05)(表 2)。空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠玻璃體液VEGF濃度比較，差異有統計學意義(F=8.816，P＜0.05)；與空白對照組比較，DM 1、3、6個月組大鼠玻璃體液VEGF濃度顯著升高，差異均有統計學意義(t=-2.271、-2.941、-6.511，P＜0.05)；DM 1個月組與DM 6個月組間大鼠玻璃體液VEGF濃度比較，差異有統計學意義(t=-3.748，P＜0.05)，DM 3個月組與DM 1、6個月組間大鼠玻璃體液VEGF濃度比較，差異無統計學意義(t=-1.380、-1.290，P＞0.05)；LSD法多重比較結果顯示，空白對照組與3個DM實驗組間VEGF濃度比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)，DM 1個月組與DM 6個月組間VEGF濃度比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，而DM 3個月組與DM 1、6個月組間VEGF濃度比較，差異無統計學意義(P＞0.05)(表 2)。空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠玻璃體液TNF-α濃度比較，差異有統計學意義(F=4.392，P＜0.05)；其中，DM 6個月組與空白對照組間大鼠玻璃體液TNF-α濃度比較，差異有統計學意義(t=-5.145，P＜0.05)，DM 1、3個月組與空白對照組間大鼠玻璃體液TNF-α濃度比較，差異無統計學意義(t=-0.531、-1.632，P＞0.05)；LSD法多重比較結果顯示，空白對照、DM 1個月組與DM 6個月組間TNF-α濃度比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，其余組間TNF-α濃度比較，差異無統計學意義(P＞0.05)(表 2)。空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠玻璃體液IL-1β濃度比較，差異有統計學意義(F=3.635，P＜0.05)；DM 6個月組與空白對照組間大鼠玻璃體液IL-1β濃度比較，差異有統計學意義(t=-3.152，P＜0.05)，DM 1、3個月組與空白對照組間大鼠玻璃體液IL-1β濃度比較，差異無統計學意義(t=-0.311、-0.938，P＞0.05)；LSD法多重比較結果顯示，空白對照、DM 1個月組與DM 6個月組間IL-1β濃度比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，其余組間IL-1β濃度比較，差異無統計學意義(P＞0.05)(表 2)。
表2
各組大鼠玻璃體液TL1A、VEGF、TNF-α、IL-1β檢測結果(光學顯微鏡觀察，空白對照組大鼠視網膜組織可見TL1A表達，主要分布于神經上皮層、內叢狀層、外核層和視網膜色素上皮(RPE)層(圖 1)，DM 1、3、6個月組大鼠視網膜組織也可見到TL1A表達，分布與空白對照組基本相同。空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠視網膜組織TL1A表達A值比較，差異有統計學意義(F=74.498，P＜0.05)。DM 1、3個月組大鼠視網膜組織TL1A表達A值均較空白對照組顯著降低(t=6.851、6.066，P＜0.05)，但DM 6個月組與空白對照組TL1A表達A值比較，差異無統計學意義(t=1.401，P＞0.05)。DM 1、3、6個月組大鼠視網膜組織TL1A表達A值呈遞增趨勢，組間比較，差異均有統計學意義(t=-3.072、-4.328、-2.196，P＜0.05)；LSD法多重比較結果顯示，空白對照組與DM 1、3個月組間TL1A表達A值比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)，空白對照組與DM 6個月組間TL1A表達A值比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，而DM 1、3、6個月組間TL1A表達A值比較，差異有統計學意義(P＜0.05)(圖 2)。空白對照組大鼠視網膜各層組織均未見明顯的VEGF表達，而DM實驗組大鼠視網膜神經上皮層、內叢狀層可見VEGF表達(圖 3)。空白對照組大鼠視網膜神經上皮層可見少量TNF-α表達，而DM實驗組大鼠視網膜神經上皮層、內叢狀層、外叢狀層、外核層均可見TNF-α表達(圖 4)。空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠視網膜組織VEGF、TNF-α表達A值濃度比較，差異有統計學意義(F=124.288、97.465，P＜0.05)。DM實驗組大鼠視網膜組織VEGF、TNF-α表達A值均較空白對照組顯著升高(tVEGF=-4.709、-16.406、-9.228，P＜0.05；tTNF-α=-4.703、-6.583、-17.762，P＜0.05)，且DM 1、3、6個月組大鼠視網膜組織VEGF、TNF-α表達A值呈遞增趨勢，組間兩兩比較，差異均有統計學意義(tVEGF=4.847、-7.248、-5.589，P＜0.05；tTNF-α=-3.873、-14.338、-7.056，P＜0.05)；LSD法多重比較結果顯示，空白對照組與3個DM實驗組的VEGF和TNF-α表達A值比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)(圖 5，6)。空白對照組大鼠視網膜各層組織均未見明顯的IL-1β表達，而DM實驗組大鼠視網膜各層均可見IL-1β表達，以神經上皮層為主(圖 7)。空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠視網膜組織IL-1β表達A值濃度比較，差異有統計學意義(F=70.985，P＜0.05)。DM 1、6個月組大鼠視網膜組織IL-1β表達A值均較空白對照組顯著升高(t=-4.108、-3.495，P＜0.05)，但DM 3個月組與空白對照組IL-1β表達A值比較，差異無統計學意義(t=-0.997，P＞0.05)；DM 1、3、6個月組間大鼠視網膜組織IL-1β表達A值比較，差異均無統計學意義(t=1.053、-1.210、-1.688，P＞0.05)；LSD法多重比較結果顯示，空白對照組與DM 1、6個月組間IL-1β表達A值比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，空白對照組與DM 3個月組間IL-1β表達A值比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，而DM 1、3、6個月組間IL-1β表達A值兩兩比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)(圖 8)。
圖1
各組大鼠視網膜組織TL1A表達光學顯微鏡像。1A.空白對照組；1B.DM 1個月組；1C.DM 3個月組；1D.DM 6個月組。各組大鼠視網膜組織均可見TL1A表達(白箭)，主要分布在神經上皮層、內叢狀層、外核層和RPE層DAB ×400??圖 2??各組大鼠視網膜組織TL1A表達A值比較
圖3
各組大鼠視網膜組織VEGF表達光學顯微鏡像。3A.空白對照組；3B.DM 1個月組；3C.DM 3個月組；3D.DM 6個月組。空白對照組大鼠視網膜各層組織均未見明顯的VEGF表達，而DM實驗組大鼠視網膜神經上皮層、內叢狀層可見VEGF表達(白箭)??圖 4??各組大鼠視網膜組織TNF-α表達光學顯微鏡像。4A.空白對照組；4B.DM 1個月組；4C.DM 3個月組；4D.DM 6個月組。空白對照組大鼠視網膜神經上皮層可見少量TNF-α表達，而DM實驗組大鼠視網膜神經上皮層、內叢狀層、外叢狀層、外核層均可見TNF-α表達(白箭) DAB ×400??圖 5??各組大鼠視網膜組織VEGF表達A值比較??圖 6??各組大鼠視網膜組織TNF-α表達A值比較
圖7
各組大鼠視網膜組織IL-1β表達光學顯微鏡像。7A.空白對照組；7B.DM 1個月組；7C.DM 3個月組；7D.DM 6個月組。空白對照組大鼠視網膜各層組織均未見明顯的IL-1β表達，而DM實驗組大鼠視網膜各層均可見IL-1β表達(白箭) DAB ×400 ??圖 8??各組大鼠視網膜組織IL-1β表達A值比較??圖 9??各組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像。9A.空白對照組；9B.DM 1個月組；9C.DM 3個月組；9D.DM 6個月組。空白對照組與DM 1個月組大鼠視網膜組織結構基本正常；DM 3個月組大鼠視網膜組織水腫，細胞排列紊亂，神經節細胞減少，神經上皮層偶可見增生的毛細血管(綠箭)；DM 6個月組大鼠視網膜組織明顯水腫，各層結構不清晰，神經節細胞核染色加深(黑箭)，內叢狀層可見大量NV(綠箭)，內核層細胞排列紊亂、水腫(藍箭)，可見脂肪空泡(白箭) HE ×400
HE染色結果顯示，空白對照組大鼠視網膜組織各層結構清晰，細胞排列整齊；DM 1個月組大鼠視網膜組織結構基本正常，與空白對照組相比未見明顯改變；DM 3個月組大鼠視網膜組織水腫，細胞排列紊亂，神經節細胞減少，神經上皮層偶可見增生的毛細血管；DM 6個月組大鼠視網膜組織明顯水腫，各層結構不清晰，神經節細胞核染色加深，內叢狀層可見大量NV，內核層細胞排列紊亂、水腫，可見脂肪空泡(圖 9)。
3 討論
DR的發病機制包括微血管的堵塞和滲漏、神經細胞的損傷和炎癥反應，其中炎性因子在DR的發病機制中起到了關鍵作用。DM增加了視網膜IL-1β、TNF-α、VEGF等因子的釋放，其中IL-1β、TNF-α可通過激活小膠質細胞、增加內皮細胞粘附力等方式造成白細胞阻滯和毛細血管的滲漏[9-11]。VEGF是公認的造成DR微血管病變的關鍵因子[2]。目前抗VEGF藥物和TNF-α拮抗劑依那西普均對DR的疾病發展有抑制作用，說明這些炎性因子促進了DR病程的進展[12]。我們觀察了DM大鼠模型中TL1A、VEGF、TNF-α、IL-1β在血清、玻璃體液和視網膜組織中的變化，以了解TL1A在DR發生發展過程中的作用。通過觀察HE染色的DM大鼠視網膜切片，可以看出，從DM 3個月開始，DM大鼠視網膜出現了DR的表現，到第6個月則已形成較典型的DR改變，除視網膜組織明顯水腫，各層結構不清晰外，神經節細胞核染色加深，內叢狀層可見大量NV，內核層細胞排列紊亂、水腫，可見大量脂肪空泡。結合ELISA和免疫組織化學檢測結果，我們發現，隨著玻璃體液IL-1β、TNF-α、VEGF的持續升高，以及TL1A表達的降低，DR的病理改變越來越重，甚至出現NV。
Kaul等[9]和Koleva-Georgieva等[13]發現，DR患者血清IL-1β、TNF-α和VEGF濃度較正常組升高，且與DR的病程和嚴重程度呈正相關，他們認為這些因子濃度的升高是造成DR的一種重要的全身因素。然而，Burgos等[14]發現，DR患者血清的VEGF水平升高并不能影響疾病的進程和微血管的病變。我們的研究結果與Burgos等[14]的觀點相符，在DM大鼠外周血中并未發現VEGF水平的改變，而IL-1β、TNF-α則均較空白對照組有所升高，與Kaul等[9]和Koleva-Georgieva等[13]的觀點相符。血清VEGF水平檢測結果與其他研究者有差異的原因考慮為：(1)VEGF的升高主要是由于高糖環境引起微循環障礙導致的組織缺氧所引起，這種組織缺氧最早是發生在末稍血管，如視網膜血管，而DM早期這種缺氧在大血管中還不明顯，因此，VEGF在視網膜組織和玻璃體液中的濃度升高先于外周血；(2)由于血-視網膜屏障的存在，視網膜組織和玻璃體液中大量升高和蓄積的VEGF并不能自由地釋放入循環系統中，而是集中在局部發揮作用，故對外周血的VEGF影響不大；(3)隨著DM病程延長，全身微血管并發癥的加重，血清VEGF也開始升高，視網膜血管病變進一步加重，最終發展成為DR。這也能解釋Kaul等[9]和Koleva-Georgieva等[13]得出的外周血VEGF水平的升高與DR病程呈正相關的結論。Meleth等[15]發現，TNF-α是促進DR發展的一種局部因素。Suzuki等[16]、Funatsu等[17]和Murugeswari等[18]發現，PDR患者玻璃體液中VEGF水平顯著升高。我們的研究結果顯示，DM大鼠玻璃體液的VEGF從DM第1個月即開始持續升高，而IL-1β、TNF-α也呈升高趨勢，這表明它們可能參與了DR的發生發展。VEGF是促進DR形成的局部因素，IL-1β和TNF-α則即是局部因素又是全身因素，它們對DR的全身因素影響出現得比局部影響要早，而隨著DM病程延長，VEGF也可能成為一種全身影響因素，提示DR的嚴重程度。
TL1A屬于TNF家族，主要表達于內皮細胞，屬于Ⅱ型跨膜蛋白，通過與特異性受體死亡受體3和誘騙受體3結合發揮其生理作用[5, 19]。Yu等[20]發現，TL1A對內皮細胞具有雙重作用：使G0/G1期細胞的生長停滯，誘導S期細胞的凋亡。VEGI通過多種信號通路發揮其對內皮細胞的生物學效應[4, 21, 22]。Bikfalvi[23]觀察到，環狀VEGI可以阻止碘化VEGF165與內皮細胞的結合，從而達到抗血管生成的作用。我們發現，DM 1個月組大鼠血清TL1A濃度較空白對照組升高，而DM 3個月組大鼠血清TL1A濃度卻降到了空白對照組以下的水平，DM 6個月組大鼠血清TL1A濃度仍持續降低。而DM大鼠玻璃體液中TL1A的濃度從第1個月開始即明顯下降，第3、6個月仍持續下降，這與血清中的檢測結果不同。從視網膜免疫組織化學檢測結果來看，TL1A在視網膜各層均有表達，以神經上皮層、內叢狀層和RPE層為主，DM 1個月組TL1A表達量較空白對照組明顯降低，DM 3個月組TL1A表達量雖較DM 1個月組略為升高，但仍明顯低于空白對照組，DM 6個月組與空白對照組TL1A表達量基本持平。TL1A在血清、玻璃體液及視網膜組織中表達存在差異。Kim和Zhang[24]報道，IL-1和TNF-α可以誘導VEGI的表達，且IL-1的促進作用大于TNF-α，分別為5倍和2倍。我們推測，DM大鼠在1個月組時即已出現血清IL-1β的顯著升高，這是促成TL1A在DM 1個月組時血清濃度升高的原因之一；另一方面，TL1A消耗量增加造成血清、玻璃體液TL1A在后期持續下降。由于VEGF在玻璃體液和視網膜組織中顯著升高，TL1A為阻止VEGF與內皮細胞結合而大量損耗；同時，高糖環境對血管內皮的破壞也在加重，損傷的內皮細胞需要更多的TL1A來促進它們的凋亡。因此，盡管視網膜組織的TL1A表達逐漸回升，然而這種回升不足以補償增長的TL1A消耗量，DM 3個月組的玻璃體液中TL1A表達仍然低于空白對照組，這種情況延續至DM 6個月，此時視網膜組織的TL1A表達基本恢復至空白對照組水平。但DM大鼠TL1A消耗量增加只是我們的推論，造成TL1A在血清、玻璃體液及視網膜組織中表達差異的機制，以及其在DR發生發展中的作用，尚有待進一步研究。DR患者血清與玻璃體液的TL1A表達情況是否與DM大鼠的表現一致也需進一步研究。
血管內皮生長因子(VEGF)在糖尿病視網膜病變(DR)的發病機制中起到了關鍵作用[1-3]。血管內皮生長抑制因子(VEGI)是一種以自分泌形式表達于內皮細胞的多功能細胞因子，主要作用于內皮細胞，有顯著的抑制病理性新生血管(NV)生成、誘導增生期內皮細胞凋亡的作用[4, 5]。腫瘤壞死因子樣配體1(TL1A)是VEGI在活體內表達量最多且生物活性最大的一種亞型[6]。VEGI與腫瘤壞死因子(TNF)α(TNF-α)和白細胞介素1β(IL-1β)一起參與了輔助性T細胞1免疫反應，在腫瘤與某些自身免疫疾病的發病機制中發揮作用[4, 5]。我們早期的研究結果顯示，VEGI在增生型DR(PDR)患者的血清和玻璃體液中濃度顯著升高，經過激光光凝與手術的治療，視網膜缺血缺氧狀況改善后，VEGI濃度明顯降低[6]。提示VEGI可能參與DR的發生發展過程。為了更詳細地研究VEGI在DR發生發展過程中的表達情況，我們對TL1A、VEGF、TNF-α、IL-1β在不同病程糖尿病(DM)大鼠的外周血、玻璃體和視網膜組織中的表達進行了研究，以探討TL1A在DR發病機制中的作用，以及其與VEGF、TNF-α、IL-1β的關系。
1 材料和方法
由中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所實驗動物中心[實驗動物資質號scxk(軍)2009-003]提供的70只6周齡雄性Wistar大鼠，體重200～250 g。飼養于標準化動物中心且無特定病原體動物級動物房，自由攝食飲水。將大鼠進行隨機分入空白對照組和3個DM實驗組。其中，空白對照組10只，DM 1、3、6個月組各20只。采用文獻[7]的方法及標準建立大鼠DM模型，選取腹腔注射鏈脲佐菌素72 h后血糖達成模標準要求的16.5～22.5 mmol/L的大鼠納入DM實驗組。實驗期間每2周監測大鼠血糖，使DM實驗組大鼠血糖維持在成模標準要求的范圍，直至實驗結束。
DM大鼠模型建立后，分別于1、3、6個月時經股動脈取血2 ml置于無依地酸的真空采血管中，室溫靜置20 min，血液自然凝固后于20 ℃、離心半徑150 mm、2000 r/min離心10 min，取上層血清立即置于-80 ℃冰箱保存待測。腹腔注射10%水合氯醛麻醉后迅速摘取左眼球，無菌手術器械剪開角膜緣，取出玻璃體，保存于無菌的1.5 ml離心管中并迅速置于-80 ℃冰箱保存待測。同時摘取右眼球，置于4%多聚甲醛固定24 h。
采用翔天試劑公司進口分裝大鼠TL1A、VEGF、TNF-α、IL-1β成套試劑盒和奧地利SPECTRA-Ⅲ型酶標儀行酶聯免疫吸附測定(ELISA)。試劑盒靈敏度為＜0.5 ng/L。檢測前將待測樣本放置于20～28 ℃的室溫下平衡解凍，在30 min內檢測，讀取450 nm下的吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值。按試劑盒說明書操作，根據不同濃度標準品所測的A值繪制標準曲線。在標準曲線圖上根據每個待測樣本的A值查找出其相對應的濃度，重復檢測3次，取算術平均數作為實驗結果。
將經多聚甲醛固定24 h的右眼球常規脫水，石蠟包埋后連續切片，切片厚度5 μm。采用美國Abcam公司的抗大鼠TL1A、VEGF、TNF-α、IL-1β抗體行石蠟切片免疫組織化學技術檢測，二胺基聯苯胺(DAB)顯色，每個指標檢測6次；參照文獻[8]的方法，采用Image-Pro Plus 6.0分析軟件處理檢測結果，以各因子平均A值作為其表達強度值。余下切片行蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡觀察視網膜組織的病理變化。
采用SPSS 13.0統計學軟件進行統計學分析。數據用均數±標準差(
2 結果
ELISA檢測結果顯示，空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠血清TL1A濃度比較，差異有統計學意義(F=77.405，P＜0.05)；與空白對照組比較，DM 1、3、6個月組大鼠血清TL1A濃度顯著升高，差異均有統計學意義(t=-9.712、2.513、7.891，P＜0.05)；DM實驗組間大鼠血清TL1A濃度兩兩比較，差異均有統計學意義(t=9.164、2.473、12.958，P＜0.05)；LSD法多重比較結果顯示，空白對照組與3個DM實驗組間TL1A濃度比較，差異有統計學意義(P＜0.05)(表 1)。空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠血清VEGF濃度比較，差異無統計學意義(F=1.242，P＞0.05)(表 1)。空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠血清TNF-α濃度比較，差異有統計學意義(F=3.508，P＜0.05)；其中，DM 1個月組與空白對照組間大鼠血清TNF-α濃度比較，差異無統計學意義(t=-1.452，P＞0.05)，DM 3、6個月組與空白對照組間大鼠血清TNF-α濃度比較，差異有統計學意義(t=-2.217、-3.283，P＜0.05)；LSD法多重比較結果顯示，空白對照組與DM 3、6個月組間TNF-α濃度比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，其余組間TNF-α濃度比較，差異無統計學意義(P＞0.05)(表 1)。空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠血清IL-1β濃度比較，差異有統計學意義(F=15.416，P＜0.05)；與空白對照組比較，DM 1、3、6個月組大鼠血清IL-1β濃度顯著升高，差異均有統計學意義(t=-4.364、-5.601、-6.174，P＜0.05)；DM 1個月組與DM 6個月組間大鼠血清IL-1β濃度比較，差異有統計學意義(t=-2.184，P＜0.05)，DM 3個月組與DM 1、6個月組間大鼠血清IL-1β濃度比較，差異無統計學意義(t=-1.334、-0.916，P＞0.05)；LSD多重比較結果顯示，空白對照組與3個DM實驗組間IL-1β濃度比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，DM 1個月組與DM 6個月組間IL-1β濃度比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，其余組間IL-1β濃度比較，差異無統計學意義(P＞0.05)(表 1)。
表1
各組大鼠血清TL1A、VEGF、TNF-α、IL-1β檢測結果(空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠玻璃體液TL1A濃度比較，差異有統計學意義(F=114.777，P＜0.05)；與空白對照組比較，DM 1、3、6個月組大鼠玻璃體液TL1A濃度顯著降低，差異均有統計學意義(t=7.298、14.595、15.312，P＜0.05)；DM 1個月組與DM 3、6個月組間大鼠玻璃體液TL1A濃度比較，差異均有統計學意義(t=7.423、8.135，P＜0.05)，DM 3個月組與DM 6個月組間大鼠玻璃體液TL1A濃度比較，差異無統計學意義(t=0.673，P＞0.05)；LSD法多重比較結果顯示，空白對照組與3個DM實驗組間TL1A濃度比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)，DM 1個月組與DM 3、6個月組間TL1A濃度比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，而DM 3個月組與DM 6個月組間TL1A濃度比較，差異無統計學意義(P＞0.05)(表 2)。空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠玻璃體液VEGF濃度比較，差異有統計學意義(F=8.816，P＜0.05)；與空白對照組比較，DM 1、3、6個月組大鼠玻璃體液VEGF濃度顯著升高，差異均有統計學意義(t=-2.271、-2.941、-6.511，P＜0.05)；DM 1個月組與DM 6個月組間大鼠玻璃體液VEGF濃度比較，差異有統計學意義(t=-3.748，P＜0.05)，DM 3個月組與DM 1、6個月組間大鼠玻璃體液VEGF濃度比較，差異無統計學意義(t=-1.380、-1.290，P＞0.05)；LSD法多重比較結果顯示，空白對照組與3個DM實驗組間VEGF濃度比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)，DM 1個月組與DM 6個月組間VEGF濃度比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，而DM 3個月組與DM 1、6個月組間VEGF濃度比較，差異無統計學意義(P＞0.05)(表 2)。空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠玻璃體液TNF-α濃度比較，差異有統計學意義(F=4.392，P＜0.05)；其中，DM 6個月組與空白對照組間大鼠玻璃體液TNF-α濃度比較，差異有統計學意義(t=-5.145，P＜0.05)，DM 1、3個月組與空白對照組間大鼠玻璃體液TNF-α濃度比較，差異無統計學意義(t=-0.531、-1.632，P＞0.05)；LSD法多重比較結果顯示，空白對照、DM 1個月組與DM 6個月組間TNF-α濃度比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，其余組間TNF-α濃度比較，差異無統計學意義(P＞0.05)(表 2)。空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠玻璃體液IL-1β濃度比較，差異有統計學意義(F=3.635，P＜0.05)；DM 6個月組與空白對照組間大鼠玻璃體液IL-1β濃度比較，差異有統計學意義(t=-3.152，P＜0.05)，DM 1、3個月組與空白對照組間大鼠玻璃體液IL-1β濃度比較，差異無統計學意義(t=-0.311、-0.938，P＞0.05)；LSD法多重比較結果顯示，空白對照、DM 1個月組與DM 6個月組間IL-1β濃度比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，其余組間IL-1β濃度比較，差異無統計學意義(P＞0.05)(表 2)。
表2
各組大鼠玻璃體液TL1A、VEGF、TNF-α、IL-1β檢測結果(光學顯微鏡觀察，空白對照組大鼠視網膜組織可見TL1A表達，主要分布于神經上皮層、內叢狀層、外核層和視網膜色素上皮(RPE)層(圖 1)，DM 1、3、6個月組大鼠視網膜組織也可見到TL1A表達，分布與空白對照組基本相同。空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠視網膜組織TL1A表達A值比較，差異有統計學意義(F=74.498，P＜0.05)。DM 1、3個月組大鼠視網膜組織TL1A表達A值均較空白對照組顯著降低(t=6.851、6.066，P＜0.05)，但DM 6個月組與空白對照組TL1A表達A值比較，差異無統計學意義(t=1.401，P＞0.05)。DM 1、3、6個月組大鼠視網膜組織TL1A表達A值呈遞增趨勢，組間比較，差異均有統計學意義(t=-3.072、-4.328、-2.196，P＜0.05)；LSD法多重比較結果顯示，空白對照組與DM 1、3個月組間TL1A表達A值比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)，空白對照組與DM 6個月組間TL1A表達A值比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，而DM 1、3、6個月組間TL1A表達A值比較，差異有統計學意義(P＜0.05)(圖 2)。空白對照組大鼠視網膜各層組織均未見明顯的VEGF表達，而DM實驗組大鼠視網膜神經上皮層、內叢狀層可見VEGF表達(圖 3)。空白對照組大鼠視網膜神經上皮層可見少量TNF-α表達，而DM實驗組大鼠視網膜神經上皮層、內叢狀層、外叢狀層、外核層均可見TNF-α表達(圖 4)。空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠視網膜組織VEGF、TNF-α表達A值濃度比較，差異有統計學意義(F=124.288、97.465，P＜0.05)。DM實驗組大鼠視網膜組織VEGF、TNF-α表達A值均較空白對照組顯著升高(tVEGF=-4.709、-16.406、-9.228，P＜0.05；tTNF-α=-4.703、-6.583、-17.762，P＜0.05)，且DM 1、3、6個月組大鼠視網膜組織VEGF、TNF-α表達A值呈遞增趨勢，組間兩兩比較，差異均有統計學意義(tVEGF=4.847、-7.248、-5.589，P＜0.05；tTNF-α=-3.873、-14.338、-7.056，P＜0.05)；LSD法多重比較結果顯示，空白對照組與3個DM實驗組的VEGF和TNF-α表達A值比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)(圖 5，6)。空白對照組大鼠視網膜各層組織均未見明顯的IL-1β表達，而DM實驗組大鼠視網膜各層均可見IL-1β表達，以神經上皮層為主(圖 7)。空白對照組、DM 1、3、6個月組間大鼠視網膜組織IL-1β表達A值濃度比較，差異有統計學意義(F=70.985，P＜0.05)。DM 1、6個月組大鼠視網膜組織IL-1β表達A值均較空白對照組顯著升高(t=-4.108、-3.495，P＜0.05)，但DM 3個月組與空白對照組IL-1β表達A值比較，差異無統計學意義(t=-0.997，P＞0.05)；DM 1、3、6個月組間大鼠視網膜組織IL-1β表達A值比較，差異均無統計學意義(t=1.053、-1.210、-1.688，P＞0.05)；LSD法多重比較結果顯示，空白對照組與DM 1、6個月組間IL-1β表達A值比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，空白對照組與DM 3個月組間IL-1β表達A值比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，而DM 1、3、6個月組間IL-1β表達A值兩兩比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)(圖 8)。
圖1
各組大鼠視網膜組織TL1A表達光學顯微鏡像。1A.空白對照組；1B.DM 1個月組；1C.DM 3個月組；1D.DM 6個月組。各組大鼠視網膜組織均可見TL1A表達(白箭)，主要分布在神經上皮層、內叢狀層、外核層和RPE層DAB ×400??圖 2??各組大鼠視網膜組織TL1A表達A值比較
圖3
各組大鼠視網膜組織VEGF表達光學顯微鏡像。3A.空白對照組；3B.DM 1個月組；3C.DM 3個月組；3D.DM 6個月組。空白對照組大鼠視網膜各層組織均未見明顯的VEGF表達，而DM實驗組大鼠視網膜神經上皮層、內叢狀層可見VEGF表達(白箭)??圖 4??各組大鼠視網膜組織TNF-α表達光學顯微鏡像。4A.空白對照組；4B.DM 1個月組；4C.DM 3個月組；4D.DM 6個月組。空白對照組大鼠視網膜神經上皮層可見少量TNF-α表達，而DM實驗組大鼠視網膜神經上皮層、內叢狀層、外叢狀層、外核層均可見TNF-α表達(白箭) DAB ×400??圖 5??各組大鼠視網膜組織VEGF表達A值比較??圖 6??各組大鼠視網膜組織TNF-α表達A值比較
圖7
各組大鼠視網膜組織IL-1β表達光學顯微鏡像。7A.空白對照組；7B.DM 1個月組；7C.DM 3個月組；7D.DM 6個月組。空白對照組大鼠視網膜各層組織均未見明顯的IL-1β表達，而DM實驗組大鼠視網膜各層均可見IL-1β表達(白箭) DAB ×400 ??圖 8??各組大鼠視網膜組織IL-1β表達A值比較??圖 9??各組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像。9A.空白對照組；9B.DM 1個月組；9C.DM 3個月組；9D.DM 6個月組。空白對照組與DM 1個月組大鼠視網膜組織結構基本正常；DM 3個月組大鼠視網膜組織水腫，細胞排列紊亂，神經節細胞減少，神經上皮層偶可見增生的毛細血管(綠箭)；DM 6個月組大鼠視網膜組織明顯水腫，各層結構不清晰，神經節細胞核染色加深(黑箭)，內叢狀層可見大量NV(綠箭)，內核層細胞排列紊亂、水腫(藍箭)，可見脂肪空泡(白箭) HE ×400
HE染色結果顯示，空白對照組大鼠視網膜組織各層結構清晰，細胞排列整齊；DM 1個月組大鼠視網膜組織結構基本正常，與空白對照組相比未見明顯改變；DM 3個月組大鼠視網膜組織水腫，細胞排列紊亂，神經節細胞減少，神經上皮層偶可見增生的毛細血管；DM 6個月組大鼠視網膜組織明顯水腫，各層結構不清晰，神經節細胞核染色加深，內叢狀層可見大量NV，內核層細胞排列紊亂、水腫，可見脂肪空泡(圖 9)。
3 討論
DR的發病機制包括微血管的堵塞和滲漏、神經細胞的損傷和炎癥反應，其中炎性因子在DR的發病機制中起到了關鍵作用。DM增加了視網膜IL-1β、TNF-α、VEGF等因子的釋放，其中IL-1β、TNF-α可通過激活小膠質細胞、增加內皮細胞粘附力等方式造成白細胞阻滯和毛細血管的滲漏[9-11]。VEGF是公認的造成DR微血管病變的關鍵因子[2]。目前抗VEGF藥物和TNF-α拮抗劑依那西普均對DR的疾病發展有抑制作用，說明這些炎性因子促進了DR病程的進展[12]。我們觀察了DM大鼠模型中TL1A、VEGF、TNF-α、IL-1β在血清、玻璃體液和視網膜組織中的變化，以了解TL1A在DR發生發展過程中的作用。通過觀察HE染色的DM大鼠視網膜切片，可以看出，從DM 3個月開始，DM大鼠視網膜出現了DR的表現，到第6個月則已形成較典型的DR改變，除視網膜組織明顯水腫，各層結構不清晰外，神經節細胞核染色加深，內叢狀層可見大量NV，內核層細胞排列紊亂、水腫，可見大量脂肪空泡。結合ELISA和免疫組織化學檢測結果，我們發現，隨著玻璃體液IL-1β、TNF-α、VEGF的持續升高，以及TL1A表達的降低，DR的病理改變越來越重，甚至出現NV。
Kaul等[9]和Koleva-Georgieva等[13]發現，DR患者血清IL-1β、TNF-α和VEGF濃度較正常組升高，且與DR的病程和嚴重程度呈正相關，他們認為這些因子濃度的升高是造成DR的一種重要的全身因素。然而，Burgos等[14]發現，DR患者血清的VEGF水平升高并不能影響疾病的進程和微血管的病變。我們的研究結果與Burgos等[14]的觀點相符，在DM大鼠外周血中并未發現VEGF水平的改變，而IL-1β、TNF-α則均較空白對照組有所升高，與Kaul等[9]和Koleva-Georgieva等[13]的觀點相符。血清VEGF水平檢測結果與其他研究者有差異的原因考慮為：(1)VEGF的升高主要是由于高糖環境引起微循環障礙導致的組織缺氧所引起，這種組織缺氧最早是發生在末稍血管，如視網膜血管，而DM早期這種缺氧在大血管中還不明顯，因此，VEGF在視網膜組織和玻璃體液中的濃度升高先于外周血；(2)由于血-視網膜屏障的存在，視網膜組織和玻璃體液中大量升高和蓄積的VEGF并不能自由地釋放入循環系統中，而是集中在局部發揮作用，故對外周血的VEGF影響不大；(3)隨著DM病程延長，全身微血管并發癥的加重，血清VEGF也開始升高，視網膜血管病變進一步加重，最終發展成為DR。這也能解釋Kaul等[9]和Koleva-Georgieva等[13]得出的外周血VEGF水平的升高與DR病程呈正相關的結論。Meleth等[15]發現，TNF-α是促進DR發展的一種局部因素。Suzuki等[16]、Funatsu等[17]和Murugeswari等[18]發現，PDR患者玻璃體液中VEGF水平顯著升高。我們的研究結果顯示，DM大鼠玻璃體液的VEGF從DM第1個月即開始持續升高，而IL-1β、TNF-α也呈升高趨勢，這表明它們可能參與了DR的發生發展。VEGF是促進DR形成的局部因素，IL-1β和TNF-α則即是局部因素又是全身因素，它們對DR的全身因素影響出現得比局部影響要早，而隨著DM病程延長，VEGF也可能成為一種全身影響因素，提示DR的嚴重程度。
TL1A屬于TNF家族，主要表達于內皮細胞，屬于Ⅱ型跨膜蛋白，通過與特異性受體死亡受體3和誘騙受體3結合發揮其生理作用[5, 19]。Yu等[20]發現，TL1A對內皮細胞具有雙重作用：使G0/G1期細胞的生長停滯，誘導S期細胞的凋亡。VEGI通過多種信號通路發揮其對內皮細胞的生物學效應[4, 21, 22]。Bikfalvi[23]觀察到，環狀VEGI可以阻止碘化VEGF165與內皮細胞的結合，從而達到抗血管生成的作用。我們發現，DM 1個月組大鼠血清TL1A濃度較空白對照組升高，而DM 3個月組大鼠血清TL1A濃度卻降到了空白對照組以下的水平，DM 6個月組大鼠血清TL1A濃度仍持續降低。而DM大鼠玻璃體液中TL1A的濃度從第1個月開始即明顯下降，第3、6個月仍持續下降，這與血清中的檢測結果不同。從視網膜免疫組織化學檢測結果來看，TL1A在視網膜各層均有表達，以神經上皮層、內叢狀層和RPE層為主，DM 1個月組TL1A表達量較空白對照組明顯降低，DM 3個月組TL1A表達量雖較DM 1個月組略為升高，但仍明顯低于空白對照組，DM 6個月組與空白對照組TL1A表達量基本持平。TL1A在血清、玻璃體液及視網膜組織中表達存在差異。Kim和Zhang[24]報道，IL-1和TNF-α可以誘導VEGI的表達，且IL-1的促進作用大于TNF-α，分別為5倍和2倍。我們推測，DM大鼠在1個月組時即已出現血清IL-1β的顯著升高，這是促成TL1A在DM 1個月組時血清濃度升高的原因之一；另一方面，TL1A消耗量增加造成血清、玻璃體液TL1A在后期持續下降。由于VEGF在玻璃體液和視網膜組織中顯著升高，TL1A為阻止VEGF與內皮細胞結合而大量損耗；同時，高糖環境對血管內皮的破壞也在加重，損傷的內皮細胞需要更多的TL1A來促進它們的凋亡。因此，盡管視網膜組織的TL1A表達逐漸回升，然而這種回升不足以補償增長的TL1A消耗量，DM 3個月組的玻璃體液中TL1A表達仍然低于空白對照組，這種情況延續至DM 6個月，此時視網膜組織的TL1A表達基本恢復至空白對照組水平。但DM大鼠TL1A消耗量增加只是我們的推論，造成TL1A在血清、玻璃體液及視網膜組織中表達差異的機制，以及其在DR發生發展中的作用，尚有待進一步研究。DR患者血清與玻璃體液的TL1A表達情況是否與DM大鼠的表現一致也需進一步研究。
