引用本文： 王林妮, 曹靖靖, 邢東軍, 于榮國, 胡立影, 楊旸, 李嫦, 李志清, 李輝, 洪亞茹, 東莉潔. 白細胞介素-8拮抗劑通過抑制活性氧生成下調視網膜血管內皮細胞黏附和遷移. 中華眼底病雜志, 2023, 39(11): 913-917. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20220315-00148 復制
眼部病理性新生血管形成是視力受損的主要原因，糖尿病視網膜病變、老年性黃斑變性等多種眼部疾病均可誘導這一病理過程[1]。目前抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物是治療新生血管形成的主要藥物[2]。然而，部分患者對抗VEGF藥物治療無應答[3]。據此推測除VEGF外，還有其他信號通路參與視網膜新生血管的生成調控。白細胞介素-8（IL-8）是一種促炎性趨化因子，它由吞噬細胞和間充質細胞產生，并誘導中性粒細胞沿血管壁聚集[4]。在眼部，IL-8主要由視網膜色素上皮細胞和視網膜血管內皮細胞（RCEC）分泌，在炎癥和新生血管中發揮重要作用[5]。在肺腺癌中，IL-8的水平與VEGF表達呈正相關[6]。IL-8作用于內皮細胞的緊密連接，改變血管通透性[7]。氧化應激是指細胞內氧化成分和抗氧化成分之間比例的失衡，一直以來氧化應激被認為與新生血管密切相關，在眼部新生血管類疾病中發揮重要作用[8]。本課題組前期研究發現，缺氧和糖基化終末產物（AGE）可使細胞發生氧化應激，細胞遭受氧化損傷并發生增殖、遷移，與新生血管形成相關[9-10]。IL-8可通過VEGF依賴性和非依賴性途徑誘導血管生成[7]，但目前有關IL-8的VEGF非依賴性途徑研究尚少。為此，本研究通過氧化應激這一VEGF非依賴性途徑了解IL-8對RCEC的作用，旨在為眼部新生血管疾病治療提供新的靶點。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
人RCEC（hRCEC，北京北納科技有限公司）；C57小鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司）。胎牛血清（FBS，美國Gibco公司）；IL-8抑制劑SB225002（182498-32-4，美國MCE公司）；外周淋巴細胞分離液、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（美國Solarbio公司）；IL-8（美國Affinity公司）；熒光探針2′,7′-二氯二氫熒光素（DCFH-DA，美國Sigma公司）；細胞培養瓶、6孔板、48孔板、15 ml離心管、50 ml離心液、9 mm爬片（美國NEST公司）。
1.2 方法
細胞培養與分組。將對數生長期hRCEC分為正常對照組（N組）、AGE處理組（AGE組）、AGE誘導聯合IL-8抑制劑SB225002處理組（AGE+SB組）。hRCEC培養于含10% FBS的Dulbecco改良Eagle培養基中，5%CO2 37℃環境下培養。AGE組、AGE+SB組培養基加入150 μg/ml AGE刺激72 h，其后AGE+SB組加入10 ng/ml SB225002刺激24 h。N組細胞常規培養。
小鼠外周血單個核細胞（PBMC）提取。8周齡C57小鼠9只，無特定病原體級。實驗動物飼養及操作均遵循國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》的規定，并獲得天津醫科大學眼科醫院倫理委員會審核（批準號：TJYY20190103002）。小鼠脫頸處死，緩慢取小鼠心臟血液于肝素管中。等體積磷酸鹽緩沖液（PBS）與外周血混勻后緩慢且均勻地平鋪至等體積外周淋巴細胞分離液中，離心后將液體中間的白絮層細胞即PBMC吸取至新的離心管中，PBS洗滌2次，用于后續實驗。
蛋白質免疫印跡法觀察AGE組、N組細胞中IL-8的表達。收集各組細胞總蛋白，調整蛋白濃度。每個樣孔加入60 μg待測樣品，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳；80 V 恒壓0.5 h，樣品進入分離膠后100 V恒壓2 h，進行蛋白分離。將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，90 V恒壓100 min。5%脫脂牛奶封閉1 h，與特定一抗 4℃孵育過夜。PBS洗膜，加入1∶5 000稀釋的山羊抗兔免疫球蛋白G辣根過氧化物室溫孵育2 h。化學發光試劑盒顯色，以磷酸甘油醛脫氫酶為內參照，多光譜成像系統掃描蛋白條帶并應用Image J進行半定量分析。
細胞劃痕實驗檢測SB225002對hRCEC增生率的影響。細胞密度為70%～80%時，以細胞密度6×105個/ml接種于6孔板中。除N組外，AGE組、AGE+SB組于孔板中央作“十”字狀劃痕處理并將此時計作0 h，常規培養24 h后在相同劃痕位置拍照記錄。采用Image J軟件測量裸區面積。實驗重復3次，按以下公式計算遷移率，遷移率=（S0-St）/S0×100%（S0：原始裸區面積；St：各時間點裸區面積）。
DCFH-DA探針檢測SB225002對hRCEC內活性氧（ROS）表達的影響。不同處理組細胞與含有10 μmol/L DCFH-DA的30 μl PBS于37 °C下孵育30 min，PBS洗滌2次，流式細胞儀檢測ROS表達情況。實驗重復3次。
白細胞-內皮細胞黏附實驗觀察SB225002對hRCEC上白細胞黏附的影響。hRCEC以細胞密度5×105個/孔接種于6孔板中，使其達到融合。hRCEC于37 ℃下與2 ng/ml腫瘤壞死因子-α（TNF-α）孵育6 h；N組不作相應處理。部分PBMC與hRCEC共同孵育1 h，清洗去除未黏附的PBMC后，剩余細胞4%多聚甲醛固定15 min。DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察拍照。另一部分PBMC置于37 ℃無血清RPMI1640培養基中，羧基熒光素乙酰氧基甲酯標記45 min；漢可氏平衡鹽溶液洗滌去除游離染料，與AGE誘導且經TNF-α處理的hRMEC于37 ℃下孵育1 h。去除非黏附細胞并細胞重懸后，流式細胞儀采集熒光信號，FlowJo軟件定量分析黏附的白細胞數量。實驗重復3次。
1.3 統計學方法
采用SPSS18.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示。兩組間比較行Student-t檢驗；三組間比較行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 AGE誘導hRCEC中IL-8表達水平升高
與N組比較，AGE組細胞中IL-8表達水平顯著升高，差異有統計學意義（t=25.661，P＜0.001）（圖1）。
圖1
N組、AGE組hRCEC中IL-8表達水平比較（n=3）
1A示電泳像；1B示N組、AGE組hRCEC中IL-8水平比較，**
2.2 AGE抑制劑SB225002顯著抑制hRCEC遷移
與N組、AGE+SB組比較，AGE組細胞遷移率顯著升高，差異有統計學意義（F=29.776，P＜0.05）；與AGE組比較，AGE+SB組細胞遷移率顯著降低，差異有統計學意義（t=27.273，P＜0.05）（圖2）。
圖2
N組、AGE組、AGF+SB組hRCEC遷移率比較（n=3）
2A～2C分別示N組、AGE組、AGE+SB組細胞顯微鏡像（標尺：100 μm）， N組、AGF+SB組僅有少量細胞遷移進入裸區，AGF組可見大量細胞遷移進入裸區；2D示3組細胞遷移率比較，*
2.3 AGE抑制劑SB225002降低hRCEC上白細胞黏附
流式細胞儀檢測結果顯示，與N組、AGE+SB組比較，AGE組黏附于血管內皮的白細胞數明顯增多，差異有統計學意義（F=38.556，P＜0.001）；與AGE組比較，AGE+SB組黏附于血管內皮的白細胞數明顯減少，差異有統計學意義（t=35.185，P＜0.01）（圖3）。
圖3
N組、AGE組、AGE+SB組共培養hRMEC上白細胞黏附情況比較（n=3）
3A～3C分別示N組、AGE組、AGE+SB組流式細胞儀檢測像；3D示3組共培養hRMEC上白細胞黏附數量比較，**
2.4 AGE抑制劑SB225002抑制hRCEC內ROS水平
與N組、AGE+SB組比較，AGE組細胞內ROS表達水平顯著增高，差異有統計學意義（F=22.336，P＜0.01）；與AGE組比較，AGE+SB組細胞內ROS表達水平顯著降低，差異有統計學意義（t=34.274，P＜0.05）（圖4）。
圖4
N組、AGE組、AGE+SB組hRCEC內ROS水平比較（n=3）
4A～4C分別示N組、AGE組、AGE+SB組流式細胞儀檢測像；4D示3組hRMEC內ROS表達水平比較，**
3 討論
作為促炎趨化因子，IL-8的持續存在導致組織發生不同程度損傷[11]。炎癥在眼部新生血管中發揮重要作用，其誘導白細胞黏附于血管內皮時，一方面白細胞聚集可引起血管阻塞進而影響血管功能；另一方面白細胞黏附可導致內皮損傷，血管滲漏出血[12-13]。白細胞黏附初期，內皮細胞會分泌IL-8誘導白細胞定向遷移[14]。有研究發現，視網膜色素上皮細胞也會產生IL-8等細胞炎性因子，誘導眼底新生血管形成[15]。可見IL-8與眼部炎癥以及新生血管的形成密切相關。本研究通過白細胞黏附實驗定性、定量地驗證了IL-8抑制劑SB225002可顯著下調白細胞黏附數量。
氧化應激會誘導眼部多種疾病病理性新生血管形成。ROS可由血管細胞產生，是氧化應激的重要產物，也是新生血管形成的重要誘導物質，而新生血管形成會導致組織缺氧，反過來又促進ROS的生成[16]。AGE與氧化應激聯系密切，既往多數研究中IL-8僅僅作為一個炎癥因子存在，關于氧化應激和IL-8之間的研究尚不深入。有研究發現，氧化應激誘導IL-8的水平升高[17]。AGE可誘導內皮細胞氧化應激，并且與炎癥密切相關[18]。在缺氧條件下RCEC會發生線粒體功能失調，誘導ROS產生，也與新生血管形成相關[19]。本研究首先發現氧化應激細胞中IL-8高表達，為明確IL-8與氧化應激之間的關系，我們進一步檢測了SB225002對hRCEC內ROS的影響。結果顯示，SB225002可顯著下調細胞內ROS的產生。但本研究僅發現了SB225002對hRCEC內ROS的影響，其內在機制并未進行分析，這也是我們今后研究的方向。
IL-8通過VEGF受體和缺氧誘導因子-1和核因子κB途徑誘導新生血管[20]。另有研究報道，IL-8可以通過依賴性和非依賴性VEGF途徑誘導新生血管，但其針對VEGF非依賴性途徑并未解釋清楚[7]。本研究通過細胞劃痕實驗證實SB225002可以抑制hRCEC遷移。RCEC的遷移與新生血管形成密切相關，據此我們推測，SB225002對RCEC遷移的影響或許是通過氧化應激途徑實現的。
ROS可加重氧化應激和炎癥反應，損傷RCEC并引起細胞增殖、遷移[18]。本研究結果顯示，IL-8可通過促進ROS的生成誘導RCEC遷移、白細胞黏附。未來我們將建立小鼠氧誘導視網膜病變模型，提取模型鼠PBMC與RCEC進行共培養，觀察白細胞黏附，去除種屬間差異，采用Seahorse觀察細胞線粒體氧化磷酸化和糖酵解水平，并通過轉錄組學與代謝組學聯合尋求與IL-8抑制劑SB225002相關的差異基因，探究其影響ROS產生與新生血管形成的機制。希望可以為治療眼部新生血管疾病提供新的思路。
眼部病理性新生血管形成是視力受損的主要原因，糖尿病視網膜病變、老年性黃斑變性等多種眼部疾病均可誘導這一病理過程[1]。目前抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物是治療新生血管形成的主要藥物[2]。然而，部分患者對抗VEGF藥物治療無應答[3]。據此推測除VEGF外，還有其他信號通路參與視網膜新生血管的生成調控。白細胞介素-8（IL-8）是一種促炎性趨化因子，它由吞噬細胞和間充質細胞產生，并誘導中性粒細胞沿血管壁聚集[4]。在眼部，IL-8主要由視網膜色素上皮細胞和視網膜血管內皮細胞（RCEC）分泌，在炎癥和新生血管中發揮重要作用[5]。在肺腺癌中，IL-8的水平與VEGF表達呈正相關[6]。IL-8作用于內皮細胞的緊密連接，改變血管通透性[7]。氧化應激是指細胞內氧化成分和抗氧化成分之間比例的失衡，一直以來氧化應激被認為與新生血管密切相關，在眼部新生血管類疾病中發揮重要作用[8]。本課題組前期研究發現，缺氧和糖基化終末產物（AGE）可使細胞發生氧化應激，細胞遭受氧化損傷并發生增殖、遷移，與新生血管形成相關[9-10]。IL-8可通過VEGF依賴性和非依賴性途徑誘導血管生成[7]，但目前有關IL-8的VEGF非依賴性途徑研究尚少。為此，本研究通過氧化應激這一VEGF非依賴性途徑了解IL-8對RCEC的作用，旨在為眼部新生血管疾病治療提供新的靶點。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
人RCEC（hRCEC，北京北納科技有限公司）；C57小鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司）。胎牛血清（FBS，美國Gibco公司）；IL-8抑制劑SB225002（182498-32-4，美國MCE公司）；外周淋巴細胞分離液、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（美國Solarbio公司）；IL-8（美國Affinity公司）；熒光探針2′,7′-二氯二氫熒光素（DCFH-DA，美國Sigma公司）；細胞培養瓶、6孔板、48孔板、15 ml離心管、50 ml離心液、9 mm爬片（美國NEST公司）。
1.2 方法
細胞培養與分組。將對數生長期hRCEC分為正常對照組（N組）、AGE處理組（AGE組）、AGE誘導聯合IL-8抑制劑SB225002處理組（AGE+SB組）。hRCEC培養于含10% FBS的Dulbecco改良Eagle培養基中，5%CO2 37℃環境下培養。AGE組、AGE+SB組培養基加入150 μg/ml AGE刺激72 h，其后AGE+SB組加入10 ng/ml SB225002刺激24 h。N組細胞常規培養。
小鼠外周血單個核細胞（PBMC）提取。8周齡C57小鼠9只，無特定病原體級。實驗動物飼養及操作均遵循國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》的規定，并獲得天津醫科大學眼科醫院倫理委員會審核（批準號：TJYY20190103002）。小鼠脫頸處死，緩慢取小鼠心臟血液于肝素管中。等體積磷酸鹽緩沖液（PBS）與外周血混勻后緩慢且均勻地平鋪至等體積外周淋巴細胞分離液中，離心后將液體中間的白絮層細胞即PBMC吸取至新的離心管中，PBS洗滌2次，用于后續實驗。
蛋白質免疫印跡法觀察AGE組、N組細胞中IL-8的表達。收集各組細胞總蛋白，調整蛋白濃度。每個樣孔加入60 μg待測樣品，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳；80 V 恒壓0.5 h，樣品進入分離膠后100 V恒壓2 h，進行蛋白分離。將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，90 V恒壓100 min。5%脫脂牛奶封閉1 h，與特定一抗 4℃孵育過夜。PBS洗膜，加入1∶5 000稀釋的山羊抗兔免疫球蛋白G辣根過氧化物室溫孵育2 h。化學發光試劑盒顯色，以磷酸甘油醛脫氫酶為內參照，多光譜成像系統掃描蛋白條帶并應用Image J進行半定量分析。
細胞劃痕實驗檢測SB225002對hRCEC增生率的影響。細胞密度為70%～80%時，以細胞密度6×105個/ml接種于6孔板中。除N組外，AGE組、AGE+SB組于孔板中央作“十”字狀劃痕處理并將此時計作0 h，常規培養24 h后在相同劃痕位置拍照記錄。采用Image J軟件測量裸區面積。實驗重復3次，按以下公式計算遷移率，遷移率=（S0-St）/S0×100%（S0：原始裸區面積；St：各時間點裸區面積）。
DCFH-DA探針檢測SB225002對hRCEC內活性氧（ROS）表達的影響。不同處理組細胞與含有10 μmol/L DCFH-DA的30 μl PBS于37 °C下孵育30 min，PBS洗滌2次，流式細胞儀檢測ROS表達情況。實驗重復3次。
白細胞-內皮細胞黏附實驗觀察SB225002對hRCEC上白細胞黏附的影響。hRCEC以細胞密度5×105個/孔接種于6孔板中，使其達到融合。hRCEC于37 ℃下與2 ng/ml腫瘤壞死因子-α（TNF-α）孵育6 h；N組不作相應處理。部分PBMC與hRCEC共同孵育1 h，清洗去除未黏附的PBMC后，剩余細胞4%多聚甲醛固定15 min。DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察拍照。另一部分PBMC置于37 ℃無血清RPMI1640培養基中，羧基熒光素乙酰氧基甲酯標記45 min；漢可氏平衡鹽溶液洗滌去除游離染料，與AGE誘導且經TNF-α處理的hRMEC于37 ℃下孵育1 h。去除非黏附細胞并細胞重懸后，流式細胞儀采集熒光信號，FlowJo軟件定量分析黏附的白細胞數量。實驗重復3次。
1.3 統計學方法
采用SPSS18.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示。兩組間比較行Student-t檢驗；三組間比較行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 AGE誘導hRCEC中IL-8表達水平升高
與N組比較，AGE組細胞中IL-8表達水平顯著升高，差異有統計學意義（t=25.661，P＜0.001）（圖1）。
圖1
N組、AGE組hRCEC中IL-8表達水平比較（n=3）
1A示電泳像；1B示N組、AGE組hRCEC中IL-8水平比較，**
2.2 AGE抑制劑SB225002顯著抑制hRCEC遷移
與N組、AGE+SB組比較，AGE組細胞遷移率顯著升高，差異有統計學意義（F=29.776，P＜0.05）；與AGE組比較，AGE+SB組細胞遷移率顯著降低，差異有統計學意義（t=27.273，P＜0.05）（圖2）。
圖2
N組、AGE組、AGF+SB組hRCEC遷移率比較（n=3）
2A～2C分別示N組、AGE組、AGE+SB組細胞顯微鏡像（標尺：100 μm）， N組、AGF+SB組僅有少量細胞遷移進入裸區，AGF組可見大量細胞遷移進入裸區；2D示3組細胞遷移率比較，*
2.3 AGE抑制劑SB225002降低hRCEC上白細胞黏附
流式細胞儀檢測結果顯示，與N組、AGE+SB組比較，AGE組黏附于血管內皮的白細胞數明顯增多，差異有統計學意義（F=38.556，P＜0.001）；與AGE組比較，AGE+SB組黏附于血管內皮的白細胞數明顯減少，差異有統計學意義（t=35.185，P＜0.01）（圖3）。
圖3
N組、AGE組、AGE+SB組共培養hRMEC上白細胞黏附情況比較（n=3）
3A～3C分別示N組、AGE組、AGE+SB組流式細胞儀檢測像；3D示3組共培養hRMEC上白細胞黏附數量比較，**
2.4 AGE抑制劑SB225002抑制hRCEC內ROS水平
與N組、AGE+SB組比較，AGE組細胞內ROS表達水平顯著增高，差異有統計學意義（F=22.336，P＜0.01）；與AGE組比較，AGE+SB組細胞內ROS表達水平顯著降低，差異有統計學意義（t=34.274，P＜0.05）（圖4）。
圖4
N組、AGE組、AGE+SB組hRCEC內ROS水平比較（n=3）
4A～4C分別示N組、AGE組、AGE+SB組流式細胞儀檢測像；4D示3組hRMEC內ROS表達水平比較，**
3 討論
作為促炎趨化因子，IL-8的持續存在導致組織發生不同程度損傷[11]。炎癥在眼部新生血管中發揮重要作用，其誘導白細胞黏附于血管內皮時，一方面白細胞聚集可引起血管阻塞進而影響血管功能；另一方面白細胞黏附可導致內皮損傷，血管滲漏出血[12-13]。白細胞黏附初期，內皮細胞會分泌IL-8誘導白細胞定向遷移[14]。有研究發現，視網膜色素上皮細胞也會產生IL-8等細胞炎性因子，誘導眼底新生血管形成[15]。可見IL-8與眼部炎癥以及新生血管的形成密切相關。本研究通過白細胞黏附實驗定性、定量地驗證了IL-8抑制劑SB225002可顯著下調白細胞黏附數量。
氧化應激會誘導眼部多種疾病病理性新生血管形成。ROS可由血管細胞產生，是氧化應激的重要產物，也是新生血管形成的重要誘導物質，而新生血管形成會導致組織缺氧，反過來又促進ROS的生成[16]。AGE與氧化應激聯系密切，既往多數研究中IL-8僅僅作為一個炎癥因子存在，關于氧化應激和IL-8之間的研究尚不深入。有研究發現，氧化應激誘導IL-8的水平升高[17]。AGE可誘導內皮細胞氧化應激，并且與炎癥密切相關[18]。在缺氧條件下RCEC會發生線粒體功能失調，誘導ROS產生，也與新生血管形成相關[19]。本研究首先發現氧化應激細胞中IL-8高表達，為明確IL-8與氧化應激之間的關系，我們進一步檢測了SB225002對hRCEC內ROS的影響。結果顯示，SB225002可顯著下調細胞內ROS的產生。但本研究僅發現了SB225002對hRCEC內ROS的影響，其內在機制并未進行分析，這也是我們今后研究的方向。
IL-8通過VEGF受體和缺氧誘導因子-1和核因子κB途徑誘導新生血管[20]。另有研究報道，IL-8可以通過依賴性和非依賴性VEGF途徑誘導新生血管，但其針對VEGF非依賴性途徑并未解釋清楚[7]。本研究通過細胞劃痕實驗證實SB225002可以抑制hRCEC遷移。RCEC的遷移與新生血管形成密切相關，據此我們推測，SB225002對RCEC遷移的影響或許是通過氧化應激途徑實現的。
ROS可加重氧化應激和炎癥反應，損傷RCEC并引起細胞增殖、遷移[18]。本研究結果顯示，IL-8可通過促進ROS的生成誘導RCEC遷移、白細胞黏附。未來我們將建立小鼠氧誘導視網膜病變模型，提取模型鼠PBMC與RCEC進行共培養，觀察白細胞黏附，去除種屬間差異，采用Seahorse觀察細胞線粒體氧化磷酸化和糖酵解水平，并通過轉錄組學與代謝組學聯合尋求與IL-8抑制劑SB225002相關的差異基因，探究其影響ROS產生與新生血管形成的機制。希望可以為治療眼部新生血管疾病提供新的思路。
