無脈絡膜癥（CHM）是一種X連鎖隱性遺傳性視網膜疾病，表現為光感受器、視網膜色素上皮和脈絡膜的進行性退化。臨床表現為緩慢進行性夜盲及視野缺損，目前尚無有效治療方法。眼底檢查技術的發展為臨床提供了更多輔助診斷和隨訪觀察的指標，二代測序技術的出現進一步提高了遺傳性視網膜疾病的診斷率，逐漸加深了對CHM發病機制及自然病程的認識。CHM基因治療的多項臨床試驗在十年內已經取得一定效果，在基因治療的載體優化、治療時間窗選擇及試驗不良事件的處理等方面均有重要進展。未來需要加深對CHM自然病程的認識，針對治療時間窗采取個性化的治療及終點評價指標。通過評估疾病嚴重程度的差異，針對不同階段采取個性化治療方案更有益于預后。
無脈絡膜癥（CHM）是一種罕見的X連鎖隱性遺傳性視網膜疾病，由X染色體q21.2上CHM基因突變引起，患病率約1/50 000～1/100 000，其特征表現為光感受器、視網膜色素上皮（RPE）和脈絡膜的進行性退化，典型眼底改變是脈絡膜下方可見的白色鞏膜[1]。男性患者10歲前大多以夜盲為首發癥狀并逐漸加重，隨后出現緩慢進行性與萎縮區域對應的視野缺損，晚期僅存管狀視野或因視網膜和脈絡膜結構遭到嚴重破壞而失明。女性攜帶者多無癥狀或僅有輕度眼底異常。眼底檢查顯示特征性的粗大網狀色素變化或白點，類似于營養不良或玻璃疣狀沉積物。CHM基因包含15個外顯子，編碼含653個氨基酸的蛋白質，稱為Rab護送蛋白1（REP1）。REP1不直接參與光轉導或視網膜細胞信號傳導過程，主要參與疏水性異戊二烯基團（異戊二烯化）與Rabs 三磷酸鳥苷酶結合及運輸過程，而異戊二烯基團是Rab錨定到細胞器和囊泡的膜上所必需的。REP1缺失會引起黑素體運輸缺陷、吞噬體降解延遲以及RPE細胞中沉積物的加速積累[2]。分子遺傳學的發展幫助發現更多的致病基因突變方式，已報道超過330種CHM基因的突變類型與CHM有關，包括點突變、易位、缺失、插入、無義和移碼突變，其中無義和移碼突變約占70%[3]。CHM發生致病的錯義突變數量極少，表明包含3個主要結構域的REP1蛋白在基因內沒有相應突變熱點的催化結構域，支持REP1作為伴侶蛋白對細胞結構和穩定性的作用[2]。
新的眼底檢查手段應用于探索CHM臨床表現及自然病程研究，對CHM有了進一步的認識。目前尚無CHM的特效治療藥物，多采用營養支持治療包括：戶外預防紫外線、適當攝取新鮮水果及綠葉蔬菜、補充抗氧化維生素、定期攝入長鏈奧米茄-3不飽和脂肪酸和二十二碳六烯酸等。過去十年中以腺相關病毒（AAV）作為載體的基因治療臨床試驗在全球范圍內大量開展，多個團隊公布針對CHM的Ⅰ/Ⅱ臨床試驗數據及隨訪結果，同時后續的III期臨床試驗也在積極招募中。現就CHM診斷技術及基因治療的新進展作一綜述，對基因治療公開數據、隨訪研究過程及存在的問題進行分析。
1 臨床表現及檢查技術
CHM患者首發癥狀一般為夜盲，隨后出現緩慢進行性周邊視野缺損，大多數患者在50歲之前保留一定程度中心視力，也有報道過較年輕患者出現嚴重視力損傷的病例。Freund等[4]對128例CHM患者進行回歸分析發現，患者出現夜盲癥的平均年齡為（12.6±1.0）歲，出現中心視力損傷或周邊視野缺損癥狀的平均年齡為（19.7±1.3）歲，患者40歲后最佳矯正視力（BCVA）以0.048最小分辨角對數（logMAR）/年的速度下降。Di Iorio等[5]對51例CHM患者縱向研究結果顯示，患者50歲前BCVA平均以0.011 logMAR/年的速度下降，50歲后以0.025 logMAR/年的速度下降。Shen等[6]對CHM患者1 004只眼統計發現，CHM患者BCVA表現出兩階段線性下降，過渡年齡約為39歲。而對我國10例CHM患者研究發現，超過35歲的患者中心視力明顯受損且快速進展，這提示中國CHM患者可能比西方患者經歷更早更快速的視力損傷[7]。CHM患者視野變化通常表現為萎縮區域對應的周邊視野缺損，視野敏感度閾值降低與中央視網膜結構和功能喪失顯著相關[8]。Freund等[4]研究發現，CHM患者20歲后視野水平寬度以0.87°/年速度下降[4]，Di Iorio等[5]的隨訪研究結果表明CHM患者視野面積40歲前平均每年下降2.7%，40歲后下降5.7%。我國學者的研究表明中國CHM患者的視野受損程度明顯重于國外的研究結果[7]。目前基因型與發病時間、視力和視野等臨床表型相關性的證據較少[9]。研究表明，疾病嚴重程度與CHM基因轉錄之間存在關聯[5]。此外，遺傳修飾和環境因素也可能在CHM的發生和發展中發揮作用。
CHM的診斷主要依據臨床檢查（視覺功能檢查和眼底影像學檢查）、家族史評估及基因檢測。臨床檢查方法包括視力、BCVA、色覺、視野、視網膜電圖（ERG）、眼前節及眼底照相、熒光素眼底血管造影、眼底自身熒光（FAF）、光相干斷層掃描（OCT）、OCT血管成像（OCTA）。在疾病早期階段，CHM眼底表現為RPE水平的外周色素團塊發展為區域性脈絡膜視網膜萎縮，起始于赤道部呈向心和離心分布，中心凹通常到疾病終末期才受影響。關于CHM病變結構順序存在爭議，有證據表明RPE是CHM的主要發病部位，光感受器和脈絡膜層通過間接影響的機制退化[2]，但一項CHM患者自然史的前瞻性橫斷面研究發現，視桿細胞功能障礙相關的光感受器外節異常最早出現[10]。ERG檢查表現為進行性a波和b波振幅降低伴峰值時間延遲，提示光感受器相關功能障礙，其中視桿細胞介導的暗適應振幅降低更為明顯，ERG檢查在CHM疾病晚期可表現為熄滅型。家族史符合X連鎖遺傳特征有助于進一步支持CHM的診斷。基因檢測手段主要包括Sanger測序以及基于二代測序（NGS）技術的靶向捕獲測序、全外顯子測序及全基因組測序等分子檢測方法。NGS技術因其高通量及低成本的特點廣泛應用于篩選遺傳病的突變位點，有助于發現更多突變類型，提高遺傳性視網膜疾病的診斷率[11]。同時隨著眼底檢查技術的發展，多種檢查手段如FAF、頻域OCT（SD-OCT）、OCTA開始應用于觀察CHM的病變過程。
1.1 眼底影像學檢查
1.1.1 FAF
RPE自身熒光由積累在RPE中的類視色素產物產生，可通過CHM的向心性變性視網膜特征來評估RPE病變情況[12]。研究表明，黃斑偏鼻側的區域更容易發生變性[13]。CHM早期以周邊視野缺失為主，FAF損失率約每年7.7%[14]，但視力下降相對較慢（0.5個字母/年）。通過短波FAF成像可動態觀察RPE及光感受器代謝特征和過程，CHM表現為萎縮的扇形區域自身熒光消失，而眼底中心凹和近中心凹區域呈斑駁狀外觀并保留自發熒光。女性攜帶者中短波自身熒光可以觀察到斑點狀低自身熒光病變和呈“馬賽克”或網狀外觀白點狀強自身熒光[15]。目前488 nm激發光的藍光自身熒光多見于臨床，其主要熒光團是RPE細胞中的脂褐素[16]，但存在強烈眩光、黃斑色素遮蔽以及潛在的光毒性效應等缺點。研究表明，787 nm近紅外激發光（主要源自RPE細胞和脈絡膜中的黑色素）也可用于監測CHM的疾病進展和治療效果[17]。Nabholz等[18]利用自適應光學紅外檢眼鏡觀察發現43%早期和無癥狀CHM患者（年齡范圍7～35歲）中心凹附近表現出視錐細胞密度降低及間距增加。
1.1.2 OCT
OCT檢查結果顯示，疾病早期病變區域RPE反射率降低和黃斑區視網膜變薄，隨后出現脈絡膜視網膜萎縮，伴有黃斑囊樣水腫或脈絡膜新生血管（CNV）。采用SD-OCT在CHM患者上觀察到邊界清晰的橢圓體帶萎縮、外核層厚度變薄[14]，強反射灶指視網膜和脈絡膜上反射率高于RPE離散的圓形病灶，可能成為CHM活動和嚴重程度的潛在生物標志物[19]。外層視網膜管樣結構由RPE功能障礙引起，也可作為CHM等退行性視網膜疾病的嚴重程度指標[20]。鞏膜凹坑是一種與RPE、脈絡膜和鞏膜中斷相關的特殊類型鞏膜擴張，近來被認為是CHM的臨床特征之一[21]。利用OCT觀察發現鞏膜凹坑隨疾病進展逐漸加重，且與視力下降及視野缺損顯著相關，提示鞏膜凹坑可能作為疾病嚴重程度的標志之一[22]。
1.1.3 OCTA
OCTA是一種無創的視網膜脈絡膜檢查手段，可用來觀察RPE、脈絡膜厚度和毛細血管密度血流變化。利用OCTA觀察CHM患者的橫斷面臨床研究顯示，神經節細胞層、外核層、橢圓體帶-RPE層和脈絡膜顯著變薄，在萎縮區域尤為明顯，但在RPE完整的區域相對保留[23]。內核層和內叢狀層在視網膜萎縮區域和RPE完整的區域表現出相同程度的變薄，表明CHM患者的視網膜改變不僅限于外層視網膜，還累及內層視網膜[24]。同時CHM患者血流密度降低比光感受器喪失更早[25]。深層毛細血管叢在萎縮區域和RPE完整的區域都受到嚴重影響，而脈絡膜毛細血管僅在萎縮的視網膜中發生改變，可能與細胞因子和生長因子的下調和釋放減少有關[23, 25-26]。OCTA也是對治療結果進行隨訪的重要定量工具，可評估基因治療過程中脈絡膜毛細血管和視網膜血管密度恢復情況[27]。
CNV產生于正常和萎縮的RPE的交界處。RPE細胞、巨噬細胞、Müller細胞、內皮細胞和成纖維細胞是導致血管內皮細胞生長因子相關的新生血管組織生長的潛在來源[28]。Patel等[29]利用OCTA發現，CHM患者RPE下纖維血管組織出現強血流信號的CNV表現，CNV的出現可能繼發于RPE變性，其程度高于脈絡膜毛細血管向黃斑部丟失的程度[30]。
1.2 血清學檢查
以往CHM被認為是一種孤立的視網膜疾病，因為CHML基因編碼的蛋白質REP2可以為視網膜以外組織提供足夠的異戊二烯化過程，但對CHM患者的血漿樣本進行全代謝組學分析，結果顯示氧化應激相關代謝物和色氨酸代謝改變導致血清素水平顯著升高、脂質氧化功能失調以及數種鞘脂和甘油磷脂失衡[31]，這提示CHM患者可能合并全身代謝指標變化。生物測定方法，如RAB6A的體外異戊二烯化可檢測外周血細胞中REP1的水平及其異戊二烯化活性，為致病性不確定的變異類型提供更多診斷證據，同時也是一種可重復且靈敏的評價基因治療效果的方法[32]。關于全身性系統代謝與表型的相關性還需大量臨床樣本來證實。
2 基因治療
在基因治療上CHM具有一定優勢，因為所需的編碼基因的互補DNA容量比較小（1.9 kb），同時還具有疾病進展緩慢、治療窗口期長及視網膜下腔免疫是赦免區域等特點。2007年至2020年間，全球范圍包括Nightstar Therapeutics、Spark Therapeutics和Roche/4D Therapeutics在內的多個團隊啟動基因治療的研究，截止目前約10項CHM相關的基因治療項目處于臨床試驗階段，數據來源于Clinical Trials（https://clinicaltrials.gov）（表1）。
表1
CHM相關基因治療臨床試驗
2.1 基因治療有效性
針對CHM基因治療首個Ⅰ/Ⅱ期試驗（NCT01461213）于2011年在英國牛津大學開始，招募14例患者并進行為期2年的隨訪，視網膜下注射AAV2-REP1后24個月患者視力增長4.5個字母，而未治療的眼睛視力下降1.5個字母[33]。盡管出現2例并發癥（分別為手術中視網膜牽拉及眼內炎），AAV2-REP1總體顯示出良好的安全性。在德國圖賓根大學進行的臨床試驗（NCT02671539）采用的載體AAV2-REP1包含可以增強靶向視網膜的土撥鼠肝炎病毒翻譯后調控元件，公布的數據顯示恢復效果最好患者視力提高17個字母，其余4例患者視力發生輕微變化（－4～1個字母）。不良事件包括與視網膜下注射相關的黃斑裂孔和并發性白內障[34]。在美國邁阿密大學進行的臨床試驗（NCT02553135）中同樣采用AAV2-REP1載體，治療隨訪2年顯示平均增加了（2±4）個SD字母（－1～10個字母）。手術中采用OCT引導視網膜下注射操作，無嚴重不良事件發生，顯示出良好的安全性[35]。在加拿大阿爾伯塔大學（NCT02077361）的Ⅰ期臨床試驗招募了6例CHM患者評估重組AAV2（rAAV2）-REP1的安全性，結果顯示受試者視力提高（0±7.5）個字母，1例受試者出現嚴重的免疫反應和視功能顯著下降[36]。美國費城大學（NCT02341807）招募10名CHM患者平均分兩組分別接受低劑量（5×1010 vg/0.1 ml）和高劑量（1×1011 vg/0.1 ml）視網膜下注射。治療2年后與對照眼相比，2例患者視力提高5～6個字母，但1例患者下降17個字母[14]。總結已公開的CHM基因治療臨床試驗數據分析發現，招募的40例患者整體視力平均增加3.1個字母，顯示出一定的視功能改善，但也存在樣本量少及隨訪時間短的局限性。
2021年6月，渤健公司發起的AAV2-CHM治療CHM的隨機多中心Ⅲ期研究宣布未達到主要治療指標，即治療后12個月患者BCVA較基線提高15個字母及以上的患者比例未達到目標，主要終點及關鍵的次要終點均未達到預期。盡管詳細的臨床試驗數據沒有公布，此研究未達到預期并不表示受試者沒有在治療中受益，因為對于早期CHM患者，中心視力變化可能并不是最敏感的指標，而晚期視網膜嚴重萎縮的情況下，視力提高15個字母對于臨床試驗而言也是很大的挑戰。所以根據不同階段的病人選擇恰當的主要終點及關鍵次要終點，還需要深入的論證。
關于臨床試驗的優化，有部分研究通過優化載體提高CHM基因治療效果，4D-100包含攜帶編碼密碼子優化的人CHM基因的AAV衣殼突變體，臨床試驗（NCT04483440）評估玻璃體腔內注射4D-110的初步安全性、耐受性和生物活性，顯示出一定前景[14]。也有研究表明表面活性劑泊洛沙姆188（Pluronic F-68，PF68）可以提高rAAV2-REP1載體溶液的生物相容性和穩定性[37]。
2.2 基因治療相關不良事件
AAV介導的基因治療常見不良事件包括視物變形、結膜下出血、并發性白內障、眼壓波動、閃光感和葡萄膜炎等。大部分不良事件可以通過對癥治療控制。
人體中AAV中和抗體的存在，可能是影響其基因治療效果的主要因素之一，而疾病進展引發的眼部免疫屏障破壞又會增加該風險。基因治療在眼部產生免疫原性稱為基因治療相關葡萄膜炎，在已報道的研究中AAV介導的免疫相關不良事件結果差異很大，導致炎癥和視力下降的嚴重程度不一。AAV產生的視網膜毒性可能來自宿主細胞對載體直接和（或）間接有害免疫反應。證據顯示視網膜下注射AAV后2～3周出現血視網膜屏障損害，組織學表現為巨噬細胞和中性粒細胞標志物的炎癥細胞浸潤，OCT表現為提示神經膠質等免疫細胞浸潤的超反射斑點，同時局部AAV給藥還可以誘導全身細胞反應。目前臨床試驗中多采用全身應用糖皮質激素降低基因治療圍手術期的免疫反應。其他降低基因治療免疫反應包括選擇高效無毒啟動子序列、降低載體免疫原性、選擇恰當視網膜下注射途徑、免疫抑制劑優化圍手術期管理等[38]。基因治療靶組織的選擇尤為重要，有觀點認為沒有證據表明脈絡膜毛細血管獨立變性，CHM基因治療的靶向組織應傾向于RPE和外層視網膜[23]。中心凹細胞單層結構具有易受到機械損傷特點，對于疾病早期的患者，采用玻璃體腔注射途徑可以靶向更大范圍面積及減少中心凹損傷 ，而疾病晚期針對特定區域采用視網膜下注射可能是更優的途徑[39]。同時視網膜下注射存在積氣和出血等風險，通過手術中OCT提高手術精確度以及開發機器人輔助注射系統有利于提高手術的一致性和安全性[33]。
2.3 其他療法
氨基糖苷類的小分子藥物通過競爭性結合近同源氨酰轉運RNA促進提前終止的密碼子（PTC）的核糖體通讀，已應用于無義突變所致的遺傳病[40]，已證明具有通讀活性的化合物包括傳統氨基糖苷類、毒性較小氨基糖苷類衍生物、非氨基糖苷類小分子藥物和小分子的通讀化合物[14]。約30%CHM患者與PTC突變有關，PTC124（也稱為Ataluren或Translarna）已用于治療由無義突變引起的杜氏肌營養不良癥，在CHM模型中對Ataluren的臨床前試驗顯示對REP1表達具有改善作用[41]。但存在因缺乏特異性覆蓋基因組中其他隨機PTC的風險，以及由于無義介導的信使RNA降解引起轉錄本可用性降低導致藥物作用的底物減少[40]。反義寡核苷酸治療在一些遺傳性視網膜疾病中顯示出一定效果，也可能為CHM提供另一種潛在療法，但有僅適用于特定突變類型的局限性[42]。同時干細胞治療、光遺傳療法及視網膜假體已經應用于RPE等遺傳性視網膜疾病，在CHM中的療效還需進一步探索。
3 小結與展望
在無脈絡膜癥研究基金會臨床報告中提到，目前CHM相關的基因治療結果尚不如RPE65相關的Leber先天性黑朦成功，可能還需要進一步改進AAV載體并優化靶組織表達、治療劑量及不良反應，同時挑選最有可能受益的合適的患者[43]。中國人群遺傳性視網膜病的突變類型及表型譜與西方人群存在顯著差異[44]，目前國內針對CHM的前瞻性的自然病程和臨床表型的研究較少。近年來CHM診斷率的提高為大樣本的臨床觀察提供了良好的基礎，我們需加深對CHM自然病程的認識，針對治療時間窗采取個性化的治療及終點評價指標。通過評估疾病嚴重程度差異，針對不同階段采取個性化治療方案更有益于疾病的預后。
無脈絡膜癥（CHM）是一種罕見的X連鎖隱性遺傳性視網膜疾病，由X染色體q21.2上CHM基因突變引起，患病率約1/50 000～1/100 000，其特征表現為光感受器、視網膜色素上皮（RPE）和脈絡膜的進行性退化，典型眼底改變是脈絡膜下方可見的白色鞏膜[1]。男性患者10歲前大多以夜盲為首發癥狀并逐漸加重，隨后出現緩慢進行性與萎縮區域對應的視野缺損，晚期僅存管狀視野或因視網膜和脈絡膜結構遭到嚴重破壞而失明。女性攜帶者多無癥狀或僅有輕度眼底異常。眼底檢查顯示特征性的粗大網狀色素變化或白點，類似于營養不良或玻璃疣狀沉積物。CHM基因包含15個外顯子，編碼含653個氨基酸的蛋白質，稱為Rab護送蛋白1（REP1）。REP1不直接參與光轉導或視網膜細胞信號傳導過程，主要參與疏水性異戊二烯基團（異戊二烯化）與Rabs 三磷酸鳥苷酶結合及運輸過程，而異戊二烯基團是Rab錨定到細胞器和囊泡的膜上所必需的。REP1缺失會引起黑素體運輸缺陷、吞噬體降解延遲以及RPE細胞中沉積物的加速積累[2]。分子遺傳學的發展幫助發現更多的致病基因突變方式，已報道超過330種CHM基因的突變類型與CHM有關，包括點突變、易位、缺失、插入、無義和移碼突變，其中無義和移碼突變約占70%[3]。CHM發生致病的錯義突變數量極少，表明包含3個主要結構域的REP1蛋白在基因內沒有相應突變熱點的催化結構域，支持REP1作為伴侶蛋白對細胞結構和穩定性的作用[2]。
新的眼底檢查手段應用于探索CHM臨床表現及自然病程研究，對CHM有了進一步的認識。目前尚無CHM的特效治療藥物，多采用營養支持治療包括：戶外預防紫外線、適當攝取新鮮水果及綠葉蔬菜、補充抗氧化維生素、定期攝入長鏈奧米茄-3不飽和脂肪酸和二十二碳六烯酸等。過去十年中以腺相關病毒（AAV）作為載體的基因治療臨床試驗在全球范圍內大量開展，多個團隊公布針對CHM的Ⅰ/Ⅱ臨床試驗數據及隨訪結果，同時后續的III期臨床試驗也在積極招募中。現就CHM診斷技術及基因治療的新進展作一綜述，對基因治療公開數據、隨訪研究過程及存在的問題進行分析。
1 臨床表現及檢查技術
CHM患者首發癥狀一般為夜盲，隨后出現緩慢進行性周邊視野缺損，大多數患者在50歲之前保留一定程度中心視力，也有報道過較年輕患者出現嚴重視力損傷的病例。Freund等[4]對128例CHM患者進行回歸分析發現，患者出現夜盲癥的平均年齡為（12.6±1.0）歲，出現中心視力損傷或周邊視野缺損癥狀的平均年齡為（19.7±1.3）歲，患者40歲后最佳矯正視力（BCVA）以0.048最小分辨角對數（logMAR）/年的速度下降。Di Iorio等[5]對51例CHM患者縱向研究結果顯示，患者50歲前BCVA平均以0.011 logMAR/年的速度下降，50歲后以0.025 logMAR/年的速度下降。Shen等[6]對CHM患者1 004只眼統計發現，CHM患者BCVA表現出兩階段線性下降，過渡年齡約為39歲。而對我國10例CHM患者研究發現，超過35歲的患者中心視力明顯受損且快速進展，這提示中國CHM患者可能比西方患者經歷更早更快速的視力損傷[7]。CHM患者視野變化通常表現為萎縮區域對應的周邊視野缺損，視野敏感度閾值降低與中央視網膜結構和功能喪失顯著相關[8]。Freund等[4]研究發現，CHM患者20歲后視野水平寬度以0.87°/年速度下降[4]，Di Iorio等[5]的隨訪研究結果表明CHM患者視野面積40歲前平均每年下降2.7%，40歲后下降5.7%。我國學者的研究表明中國CHM患者的視野受損程度明顯重于國外的研究結果[7]。目前基因型與發病時間、視力和視野等臨床表型相關性的證據較少[9]。研究表明，疾病嚴重程度與CHM基因轉錄之間存在關聯[5]。此外，遺傳修飾和環境因素也可能在CHM的發生和發展中發揮作用。
CHM的診斷主要依據臨床檢查（視覺功能檢查和眼底影像學檢查）、家族史評估及基因檢測。臨床檢查方法包括視力、BCVA、色覺、視野、視網膜電圖（ERG）、眼前節及眼底照相、熒光素眼底血管造影、眼底自身熒光（FAF）、光相干斷層掃描（OCT）、OCT血管成像（OCTA）。在疾病早期階段，CHM眼底表現為RPE水平的外周色素團塊發展為區域性脈絡膜視網膜萎縮，起始于赤道部呈向心和離心分布，中心凹通常到疾病終末期才受影響。關于CHM病變結構順序存在爭議，有證據表明RPE是CHM的主要發病部位，光感受器和脈絡膜層通過間接影響的機制退化[2]，但一項CHM患者自然史的前瞻性橫斷面研究發現，視桿細胞功能障礙相關的光感受器外節異常最早出現[10]。ERG檢查表現為進行性a波和b波振幅降低伴峰值時間延遲，提示光感受器相關功能障礙，其中視桿細胞介導的暗適應振幅降低更為明顯，ERG檢查在CHM疾病晚期可表現為熄滅型。家族史符合X連鎖遺傳特征有助于進一步支持CHM的診斷。基因檢測手段主要包括Sanger測序以及基于二代測序（NGS）技術的靶向捕獲測序、全外顯子測序及全基因組測序等分子檢測方法。NGS技術因其高通量及低成本的特點廣泛應用于篩選遺傳病的突變位點，有助于發現更多突變類型，提高遺傳性視網膜疾病的診斷率[11]。同時隨著眼底檢查技術的發展，多種檢查手段如FAF、頻域OCT（SD-OCT）、OCTA開始應用于觀察CHM的病變過程。
1.1 眼底影像學檢查
1.1.1 FAF
RPE自身熒光由積累在RPE中的類視色素產物產生，可通過CHM的向心性變性視網膜特征來評估RPE病變情況[12]。研究表明，黃斑偏鼻側的區域更容易發生變性[13]。CHM早期以周邊視野缺失為主，FAF損失率約每年7.7%[14]，但視力下降相對較慢（0.5個字母/年）。通過短波FAF成像可動態觀察RPE及光感受器代謝特征和過程，CHM表現為萎縮的扇形區域自身熒光消失，而眼底中心凹和近中心凹區域呈斑駁狀外觀并保留自發熒光。女性攜帶者中短波自身熒光可以觀察到斑點狀低自身熒光病變和呈“馬賽克”或網狀外觀白點狀強自身熒光[15]。目前488 nm激發光的藍光自身熒光多見于臨床，其主要熒光團是RPE細胞中的脂褐素[16]，但存在強烈眩光、黃斑色素遮蔽以及潛在的光毒性效應等缺點。研究表明，787 nm近紅外激發光（主要源自RPE細胞和脈絡膜中的黑色素）也可用于監測CHM的疾病進展和治療效果[17]。Nabholz等[18]利用自適應光學紅外檢眼鏡觀察發現43%早期和無癥狀CHM患者（年齡范圍7～35歲）中心凹附近表現出視錐細胞密度降低及間距增加。
1.1.2 OCT
OCT檢查結果顯示，疾病早期病變區域RPE反射率降低和黃斑區視網膜變薄，隨后出現脈絡膜視網膜萎縮，伴有黃斑囊樣水腫或脈絡膜新生血管（CNV）。采用SD-OCT在CHM患者上觀察到邊界清晰的橢圓體帶萎縮、外核層厚度變薄[14]，強反射灶指視網膜和脈絡膜上反射率高于RPE離散的圓形病灶，可能成為CHM活動和嚴重程度的潛在生物標志物[19]。外層視網膜管樣結構由RPE功能障礙引起，也可作為CHM等退行性視網膜疾病的嚴重程度指標[20]。鞏膜凹坑是一種與RPE、脈絡膜和鞏膜中斷相關的特殊類型鞏膜擴張，近來被認為是CHM的臨床特征之一[21]。利用OCT觀察發現鞏膜凹坑隨疾病進展逐漸加重，且與視力下降及視野缺損顯著相關，提示鞏膜凹坑可能作為疾病嚴重程度的標志之一[22]。
1.1.3 OCTA
OCTA是一種無創的視網膜脈絡膜檢查手段，可用來觀察RPE、脈絡膜厚度和毛細血管密度血流變化。利用OCTA觀察CHM患者的橫斷面臨床研究顯示，神經節細胞層、外核層、橢圓體帶-RPE層和脈絡膜顯著變薄，在萎縮區域尤為明顯，但在RPE完整的區域相對保留[23]。內核層和內叢狀層在視網膜萎縮區域和RPE完整的區域表現出相同程度的變薄，表明CHM患者的視網膜改變不僅限于外層視網膜，還累及內層視網膜[24]。同時CHM患者血流密度降低比光感受器喪失更早[25]。深層毛細血管叢在萎縮區域和RPE完整的區域都受到嚴重影響，而脈絡膜毛細血管僅在萎縮的視網膜中發生改變，可能與細胞因子和生長因子的下調和釋放減少有關[23, 25-26]。OCTA也是對治療結果進行隨訪的重要定量工具，可評估基因治療過程中脈絡膜毛細血管和視網膜血管密度恢復情況[27]。
CNV產生于正常和萎縮的RPE的交界處。RPE細胞、巨噬細胞、Müller細胞、內皮細胞和成纖維細胞是導致血管內皮細胞生長因子相關的新生血管組織生長的潛在來源[28]。Patel等[29]利用OCTA發現，CHM患者RPE下纖維血管組織出現強血流信號的CNV表現，CNV的出現可能繼發于RPE變性，其程度高于脈絡膜毛細血管向黃斑部丟失的程度[30]。
1.2 血清學檢查
以往CHM被認為是一種孤立的視網膜疾病，因為CHML基因編碼的蛋白質REP2可以為視網膜以外組織提供足夠的異戊二烯化過程，但對CHM患者的血漿樣本進行全代謝組學分析，結果顯示氧化應激相關代謝物和色氨酸代謝改變導致血清素水平顯著升高、脂質氧化功能失調以及數種鞘脂和甘油磷脂失衡[31]，這提示CHM患者可能合并全身代謝指標變化。生物測定方法，如RAB6A的體外異戊二烯化可檢測外周血細胞中REP1的水平及其異戊二烯化活性，為致病性不確定的變異類型提供更多診斷證據，同時也是一種可重復且靈敏的評價基因治療效果的方法[32]。關于全身性系統代謝與表型的相關性還需大量臨床樣本來證實。
2 基因治療
在基因治療上CHM具有一定優勢，因為所需的編碼基因的互補DNA容量比較小（1.9 kb），同時還具有疾病進展緩慢、治療窗口期長及視網膜下腔免疫是赦免區域等特點。2007年至2020年間，全球范圍包括Nightstar Therapeutics、Spark Therapeutics和Roche/4D Therapeutics在內的多個團隊啟動基因治療的研究，截止目前約10項CHM相關的基因治療項目處于臨床試驗階段，數據來源于Clinical Trials（https://clinicaltrials.gov）（表1）。
表1
CHM相關基因治療臨床試驗
2.1 基因治療有效性
針對CHM基因治療首個Ⅰ/Ⅱ期試驗（NCT01461213）于2011年在英國牛津大學開始，招募14例患者并進行為期2年的隨訪，視網膜下注射AAV2-REP1后24個月患者視力增長4.5個字母，而未治療的眼睛視力下降1.5個字母[33]。盡管出現2例并發癥（分別為手術中視網膜牽拉及眼內炎），AAV2-REP1總體顯示出良好的安全性。在德國圖賓根大學進行的臨床試驗（NCT02671539）采用的載體AAV2-REP1包含可以增強靶向視網膜的土撥鼠肝炎病毒翻譯后調控元件，公布的數據顯示恢復效果最好患者視力提高17個字母，其余4例患者視力發生輕微變化（－4～1個字母）。不良事件包括與視網膜下注射相關的黃斑裂孔和并發性白內障[34]。在美國邁阿密大學進行的臨床試驗（NCT02553135）中同樣采用AAV2-REP1載體，治療隨訪2年顯示平均增加了（2±4）個SD字母（－1～10個字母）。手術中采用OCT引導視網膜下注射操作，無嚴重不良事件發生，顯示出良好的安全性[35]。在加拿大阿爾伯塔大學（NCT02077361）的Ⅰ期臨床試驗招募了6例CHM患者評估重組AAV2（rAAV2）-REP1的安全性，結果顯示受試者視力提高（0±7.5）個字母，1例受試者出現嚴重的免疫反應和視功能顯著下降[36]。美國費城大學（NCT02341807）招募10名CHM患者平均分兩組分別接受低劑量（5×1010 vg/0.1 ml）和高劑量（1×1011 vg/0.1 ml）視網膜下注射。治療2年后與對照眼相比，2例患者視力提高5～6個字母，但1例患者下降17個字母[14]。總結已公開的CHM基因治療臨床試驗數據分析發現，招募的40例患者整體視力平均增加3.1個字母，顯示出一定的視功能改善，但也存在樣本量少及隨訪時間短的局限性。
2021年6月，渤健公司發起的AAV2-CHM治療CHM的隨機多中心Ⅲ期研究宣布未達到主要治療指標，即治療后12個月患者BCVA較基線提高15個字母及以上的患者比例未達到目標，主要終點及關鍵的次要終點均未達到預期。盡管詳細的臨床試驗數據沒有公布，此研究未達到預期并不表示受試者沒有在治療中受益，因為對于早期CHM患者，中心視力變化可能并不是最敏感的指標，而晚期視網膜嚴重萎縮的情況下，視力提高15個字母對于臨床試驗而言也是很大的挑戰。所以根據不同階段的病人選擇恰當的主要終點及關鍵次要終點，還需要深入的論證。
關于臨床試驗的優化，有部分研究通過優化載體提高CHM基因治療效果，4D-100包含攜帶編碼密碼子優化的人CHM基因的AAV衣殼突變體，臨床試驗（NCT04483440）評估玻璃體腔內注射4D-110的初步安全性、耐受性和生物活性，顯示出一定前景[14]。也有研究表明表面活性劑泊洛沙姆188（Pluronic F-68，PF68）可以提高rAAV2-REP1載體溶液的生物相容性和穩定性[37]。
2.2 基因治療相關不良事件
AAV介導的基因治療常見不良事件包括視物變形、結膜下出血、并發性白內障、眼壓波動、閃光感和葡萄膜炎等。大部分不良事件可以通過對癥治療控制。
人體中AAV中和抗體的存在，可能是影響其基因治療效果的主要因素之一，而疾病進展引發的眼部免疫屏障破壞又會增加該風險。基因治療在眼部產生免疫原性稱為基因治療相關葡萄膜炎，在已報道的研究中AAV介導的免疫相關不良事件結果差異很大，導致炎癥和視力下降的嚴重程度不一。AAV產生的視網膜毒性可能來自宿主細胞對載體直接和（或）間接有害免疫反應。證據顯示視網膜下注射AAV后2～3周出現血視網膜屏障損害，組織學表現為巨噬細胞和中性粒細胞標志物的炎癥細胞浸潤，OCT表現為提示神經膠質等免疫細胞浸潤的超反射斑點，同時局部AAV給藥還可以誘導全身細胞反應。目前臨床試驗中多采用全身應用糖皮質激素降低基因治療圍手術期的免疫反應。其他降低基因治療免疫反應包括選擇高效無毒啟動子序列、降低載體免疫原性、選擇恰當視網膜下注射途徑、免疫抑制劑優化圍手術期管理等[38]。基因治療靶組織的選擇尤為重要，有觀點認為沒有證據表明脈絡膜毛細血管獨立變性，CHM基因治療的靶向組織應傾向于RPE和外層視網膜[23]。中心凹細胞單層結構具有易受到機械損傷特點，對于疾病早期的患者，采用玻璃體腔注射途徑可以靶向更大范圍面積及減少中心凹損傷 ，而疾病晚期針對特定區域采用視網膜下注射可能是更優的途徑[39]。同時視網膜下注射存在積氣和出血等風險，通過手術中OCT提高手術精確度以及開發機器人輔助注射系統有利于提高手術的一致性和安全性[33]。
2.3 其他療法
氨基糖苷類的小分子藥物通過競爭性結合近同源氨酰轉運RNA促進提前終止的密碼子（PTC）的核糖體通讀，已應用于無義突變所致的遺傳病[40]，已證明具有通讀活性的化合物包括傳統氨基糖苷類、毒性較小氨基糖苷類衍生物、非氨基糖苷類小分子藥物和小分子的通讀化合物[14]。約30%CHM患者與PTC突變有關，PTC124（也稱為Ataluren或Translarna）已用于治療由無義突變引起的杜氏肌營養不良癥，在CHM模型中對Ataluren的臨床前試驗顯示對REP1表達具有改善作用[41]。但存在因缺乏特異性覆蓋基因組中其他隨機PTC的風險，以及由于無義介導的信使RNA降解引起轉錄本可用性降低導致藥物作用的底物減少[40]。反義寡核苷酸治療在一些遺傳性視網膜疾病中顯示出一定效果，也可能為CHM提供另一種潛在療法，但有僅適用于特定突變類型的局限性[42]。同時干細胞治療、光遺傳療法及視網膜假體已經應用于RPE等遺傳性視網膜疾病，在CHM中的療效還需進一步探索。
3 小結與展望
在無脈絡膜癥研究基金會臨床報告中提到，目前CHM相關的基因治療結果尚不如RPE65相關的Leber先天性黑朦成功，可能還需要進一步改進AAV載體并優化靶組織表達、治療劑量及不良反應，同時挑選最有可能受益的合適的患者[43]。中國人群遺傳性視網膜病的突變類型及表型譜與西方人群存在顯著差異[44]，目前國內針對CHM的前瞻性的自然病程和臨床表型的研究較少。近年來CHM診斷率的提高為大樣本的臨床觀察提供了良好的基礎，我們需加深對CHM自然病程的認識，針對治療時間窗采取個性化的治療及終點評價指標。通過評估疾病嚴重程度差異，針對不同階段采取個性化治療方案更有益于疾病的預后。
