引用本文： 張宇航, 薛夢姣, 謝瀟杭, 胡延忠, 張鳳妍. 過表達嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型刺突蛋白抑制人視網膜色素上皮細胞生長. 中華眼底病雜志, 2023, 39(3): 232-237. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20211104-00630 復制
隨著嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（SARS-CoV-2）引起的新型冠狀病毒感染（COVID-19）在全球范圍內的流行，目前已有較多以眼部感染癥狀為首發表現或全身感染引起眼部繼發癥狀的報道。除目前報道較多的結膜、角膜等眼表結構感染外[1-5]，COVID-19引起眼底病變的報道也逐漸增多[6-8]。COVID-19患者的尸檢結果顯示其視網膜SARS-CoV-2陽性[9]，表明了該病毒對視網膜的感染能力。COVID-19眼底臨床表現多樣，包括視力下降、眼前固定黑影、色覺障礙甚至單眼失明等[7-8]。SARS-CoV-2為帶有外膜的高致病性冠狀病毒，其表面帶有的刺突蛋白（S-蛋白）是介導其感染宿主細胞的關鍵蛋白。在病毒表面S-蛋白與宿主表面相關受體[如血管緊張素轉換酶2（ACE2）]的作用下，介導病毒外膜與細胞膜進行融合，病毒顆粒進入細胞內并激發一系列病理過程[10]。現有研究表明，S-蛋白在不同冠狀病毒基因組中差異較大，是新型冠狀病毒的特異性蛋白[11]。S-蛋白可誘導宿主細胞產生多種病理改變，但其在視網膜細胞中的作用尚不清楚。本研究以人視網膜色素上皮（RPE）細胞為研究對象，研究了SARS-CoV-2 S-蛋白對RPE細胞生長的影響，以期為COVID-19相關眼底病變的進一步研究提供思路。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
人ARPE-19、HEK293細胞（美國組織細胞庫ATCC）；Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM）/F12培養基、DMEM高糖培養基（美國Corning公司）；胎牛血清（美國Gibco 公司）；青霉素-鏈霉素、質粒提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Hoechest33342染色劑（美國MedChemexpress生物科技公司）；細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；細胞轉染試劑盒（美國Ivitrogen公司）；SARS-CoV-2 S-蛋白抗體、ACE2抗體（美國Abcam公司）；Flag抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；載體p3xflag-CMV-7.1質粒、pQCXIP-綠色熒光蛋白（GFP）1-10質粒（以下簡稱為GFP1-10質粒）、pQCXIP-BSR-GFP11質粒（以下簡稱為GFP11質粒）、pCMV-ACE2-Myc質粒（美國Addgene公司）；pSV-Wuhan Spike質粒由上海復旦生物醫學研究院院長徐建青教授惠贈。
1.2 方法
細胞培養。ARPE-19細胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養基中；HEK293細胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養基中。細胞均于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，定期更換培養液，細胞增生至皿底面積80%左右時，胰酶消化傳代并選擇狀態良好的細胞進行后續實驗。
p3xflag-S質粒構建。以pSV-Wuhan Spike質粒為模版，按照下列引物采用聚合酶鏈反應擴增S-蛋白cDNA，并在cDNA兩端分別加入Sal Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點。正向引物：CCCAAGCTTTTCGTGTTCCTGGTGCTC，反向引物：CCCGTCGACTCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGGTGTAGTGGAGCTTCACGCC。應用Sal Ⅰ和Hind Ⅲ酶切載體p3xflag-CMV-7.1質粒。將S-蛋白編碼cDNA克隆至p3xflag-CMV-7.1質粒中，形成p3xflag-S重組質粒。并將該重組質粒進行酶切和DNA測序鑒定。載體p3xflag-CMV-7.1質粒、GFP1-10質粒、GFP11質粒、pCMV-ACE2-Myc質粒利用DH5α感受態大腸桿菌進行質粒轉化擴增。將質粒轉染到HEK293細胞中，對表達的標簽蛋白進行蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測。
細胞質粒轉染。ARPE-19、HEK293細胞接種于6孔細胞培養板上，細胞生長至30%～50%時，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗并更換不含血清的培養基。無菌離心管中加入50 μl Opti-MEM及2 μg目的質粒，室溫靜置5 min。另取無菌離心管加入50 μl Opti-MEM及8 μl lipofectamine3000轉染試劑，室溫靜置5 min后與質粒溶液混合。靜置20 min后將混合溶液逐滴加入待轉染細胞中，6 h后更換完全培養基繼續培養48 h。
細胞融合檢測。HEK293細胞分別接種于2個6 cm細胞培養皿中，培養至細胞生長30%～50%時，按照前述質粒細胞轉染方法向其中一皿細胞內轉染GFP11質粒及pCMV-ACE2-Myc質粒；另一皿細胞轉染GFP1-10質粒及p3xflag-S質粒，24 h后應用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化，將兩組細胞混合后接種于10 cm培養皿中共培養，24 h后分別在明場顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察細胞融合情況。
HEK293細胞分別接種于2個6 cm細胞培養皿中，培養至細胞生長30%～50%時，將細胞分為細胞1、2、3、4，按照前述質粒細胞轉染方法，細胞1轉染GFP11質粒和空載質粒，細胞2轉染GFP1-10質粒和空載質粒，細胞3轉染GFP11和pCMV-HA-ACE2質粒；細胞4轉染GFP1-10和p3xflag-S質粒。轉染后24 h應用不含EDTA的胰酶消化，將細胞1與細胞2（對照組1）、細胞2與細胞3（對照組2）、細胞3與細胞4（觀察組）、細胞1與細胞2、3、4（對照組3）混合后分別接種于10 cm培養皿中共培養，24 h后分別在明場顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察細胞融合情況。
細胞計數試劑盒8（CCK-8）檢測ARPE-19細胞增生情況。將細胞分為對照組、過表達S-蛋白組。依照前述轉染方法，選取轉染后48 h細胞，PBS清洗后用不含EDTA胰酶消化，100 μl細胞懸液以細胞密度2×103個/孔接種于96孔板中，培養后0、24、48、72 h（即轉染后12、36、60、84 h），棄上清液后每孔加入10 μl CCK-8溶液孵育2 h，酶標儀測定450 nm處的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值，繪制生長曲線。
流式細胞儀檢測ARPE-19細胞周期。將細胞分為對照組、過表達S-蛋白組，對照組轉載空載質粒，過表達S-蛋白組轉載S-蛋白質粒。依照前述轉染方法，選取轉染48 h后細胞，PBS洗滌細胞1次，胰酶消化后調整細胞濃度為1×106個/ml，取1 ml細胞懸液去除上清，加入500 μl 70%冷乙醇重懸細胞，4 ℃固定3 h，PBS洗滌。預先按照RnaseA：PI=1:9配置染色工作液，固定后細胞離心加入500 μl工作液重懸，室溫避光孵育1 h，流式細胞儀檢測細胞周期，記錄波長488 nm處熒光。
Western blot檢測轉染與未轉染質粒的APRE-19細胞中S-蛋白、ACE2的表達。質粒轉染48 h后，加入200 μl含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取蛋白，檢測蛋白濃度后取各組蛋白樣本與4倍樣品緩沖液混合后放入100 ℃金屬浴中5 min使蛋白變性。取20 μg蛋白樣品于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠中電泳，跑膠結束后以濕轉印法將分離的蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶、洗膜緩沖液（TBST）、0.1% Tween-20室溫封閉2 h，一抗4 ℃過夜孵育，TBST/0.1% Tween-20洗膜4次；加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，再次洗膜4次；最后加入化學發光底物進行曝光并拍照。以磷酸甘油醛脫氫酶作為內參照，進行灰度分析。
細胞凋亡檢測。采用膜聯蛋白（Annexin）Ⅴ-熒光素異硫氰酸酯（FITC）/碘化丙啶（PI）雙染法檢測ARPE-19細胞凋亡情況。選取轉染48 h后細胞，PBS清洗后用不含EDTA胰酶消化后離心。PBS洗滌細胞1次后收集5×105個細胞再次離心，加入500 μl Binding Buffer重懸細胞。加入5 μl Annexin V-FITC溶液及5 μl PI溶液混勻。室溫、避光反應15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。輸出數據左下象限為活細胞[Annexin V（－）PI（－）]；左上象限為壞死細胞[Annexin V（－）PI（＋）]；右下象限為早期凋亡細胞[Annexin V（＋）PI（－）]；右上象限為晚期凋亡細胞[Annexin V（＋）PI（＋）]。凋亡細胞記右上和右下象限細胞。
1.3 統計學方法
采用GraphPad Prism Software Version 8.4.3軟件行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
）表示。兩組間比較采用最小顯著差法t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 SARS-CoV-2 S-蛋白哺乳類細胞表達質粒的構建與表達
DNA序列測定結果顯示，S-蛋白cDNA與標簽蛋白融合在一起。Western blot檢測結果顯示，與未轉染p3xflag-S質粒的細胞比較，轉染細胞中S-蛋白相關表達量升高（圖1），即p3xflag-S質粒可在HEK293細胞中表達。
圖1
p3xflag-S質粒驗證蛋白免疫印跡電泳像 GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶
2.2 過表達S-蛋白誘導細胞融合
明場顯微鏡觀察發現，觀察組可見大而多核的融合細胞團（圖2A）；熒光顯微鏡觀察發現 ，觀察組可見融合細胞內有多個核且融合細胞呈現明顯的綠色熒光（圖2B）；即p3xflag-S質粒在HEK293細胞中表達，并具有調控細胞融合活性。
圖2
觀察組細胞融合明場顯微鏡、熒光顯微鏡像 2A示明場顯微鏡像，可見大而多核的融合細胞團 ×60；2B示熒光顯微鏡像，可見融合細胞內有多個核且融合細胞呈現明顯的綠色熒光 ×60
2.3 過表達S-蛋白抑制RPE細胞生長
Western blot檢測結果顯示，與未轉染p3xflag-S質粒的ARPE-19細胞比較，轉染p3xflag-S質粒的ARPE-19細胞存在S-蛋白的表達（圖3A）；與轉染ACE2質粒的ARPE-19細胞比較，未轉染ACE2質粒的ARPE-19細胞中也存在ACE2的表達（圖3B）。
圖3
轉染與未轉染質粒的ARPE-19細胞中ACE2、S-蛋白的蛋白免疫印跡電泳像 ACE2：血管緊張素轉換酶2；S-蛋白：刺突蛋白；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶。3A示ACE2；3B示S-蛋白
CCK-8增生分析結果顯示，與對照組比較，過表達S-蛋白組RPE細胞增生能力顯著降低，差異有統計學意義（t=22.70、16.75、23.38，P＜0.000 1）（圖4A）。流式細胞儀檢測結果顯示，對照組、過表達S-蛋白組G1期細胞分別為41.1%、67.0%；S期細胞分別為29.2%、15.3%。與對照組比較，過表達S-蛋白組G1期細胞明顯升高，S期細胞明顯降低，差異均有統計學意義（t=4.76、13.26，P=0.018、0.001）（圖4B）。對照組、過表達S-蛋白組細胞凋亡率分別為4.47%、14.81%；過表達S-蛋白組細胞凋亡率較對照組明顯增加，差異有統計學意義（t=4.91，P=0.008）（圖4C）。
圖4
對照組、過表達S-蛋白組細胞增生能力、細胞周期比例及細胞凋亡率比較（n=3） 4A示細胞增生能力，****P＜0.000 1；4B示細胞周期比例，*P＜0.05，***P＜0.001；4C示細胞凋亡率，**P＜0.01
3 討論
SARS-CoV-2是一種帶有脂質外膜的RNA病毒，病毒表面的S-蛋白是其特異性蛋白[11]，在感染宿主細胞過程中，S-蛋白與宿主細胞受體識別后介導病毒外膜與細胞膜融合，從而進入宿主細胞中[10]。首先，我們構建了SARS-CoV-2 S-蛋白基因質粒，并利用SARS-CoV-2受體之一ACE2對S-蛋白質粒的生物活性進行了驗證。ACE2受體已經被證明具有SARS-CoV-2受體活性[12-16]，分布在人體內多種組織表面，在眼角膜、結膜上皮、RPE細胞及視網膜毛細血管中均有表達[17-19]。細胞表達S-蛋白后，與SARS-CoV-2受體作用產生膜融合進而引起細胞融合。ACE2膜蛋白是SARS-CoV-2的主要受體[18]，S-蛋白與ACE2受體的結合可產生膜融合過程[10]。有報道體外過表達冠狀病毒S-蛋白可誘導細胞融合。我們利用ACE2 S-蛋白介導的膜融合作用，在HEK293細胞中驗證了p3xflag-S質粒的活性。本實驗應用的GFP11質粒和GFP1-10質粒分別表達GFP蛋白的N-和C-段，兩片段在獨立存在時失去產生綠色熒光的作用，而在兩片段同時表達在一個細胞內時，可組成完整的GFP，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光。我們利用該系統測試了S-蛋白介導的細胞融合作用。我們將ACE2表達質粒轉染的HEK293細胞與轉染S-蛋白的HEK293細胞共培養后，S-蛋白與ACE2受體相互作用介導細胞膜融合，使得在不同細胞胞質內的GFP片段相遇并在融合細胞中重組，呈現綠色熒光。通過細胞的融合作用，證明了構建S-蛋白質粒的生物活性，與報道結果相符[20]。
COVID-19自2019年12月被首次報道后，有大量出現眼部癥狀的病例出現，很多研究確認了其對眼后節的損傷[6, 9, 21]。RPE是人視網膜的重要結構，在維持人視網膜正常的生理狀態和視覺功能上起到重要作用。RPE間的緊密連接是構成血視網膜屏障的結構基礎[22]。有研究表明，SARS-CoV-2引起的血視網膜屏障結構的破壞是導致眼后節感染的重要機制，其主要途徑包括血液中的病毒顆粒可直接感染視網膜細胞，也可以通過感染血細胞穿過被破壞的血視網膜屏障引起眼底的繼發感染[23-24]。這些研究和理論凸顯了RPE細胞在SARS-CoV-2眼后節感染過程中的重要作用。SARS-CoV-2相關的眼底病變表現多樣[25-26]，包括視網膜出血、Roth斑、眼底動脈缺血等。此外，在COVID-19患者痊愈后的長期隨訪中也有患者出現了不同程度的眼部癥狀[23, 27-28]。但是，SARS-CoV-2誘導視網膜病變的機制尚不清楚。基于此，我們測定了SARS-CoV-2 S-蛋白對RPE細胞的致病作用。首先我們檢測到自然狀態下體外培養的RPE細胞存在ACE2的表達，受體表達是RPE細胞能夠被病毒感染的基礎。在轉染S-蛋白表達質粒后，過表達S-蛋白可抑制RPE細胞增生，誘發細胞周期停滯，上調細胞的凋亡通路。在細胞周期實驗中，過表達S-蛋白使G1期細胞比例明顯增加，細胞周期停滯于G0/G1期。很多研究證明了細胞凋亡在眼部病毒感染過程中的關鍵作用，病毒感染后細胞通過激活凋亡通路來避免病毒的進一步復制[29]。在關于RPE細胞其他病毒感染的相關研究中，視網膜細胞死亡在眼底疾病發生中的作用已經被證明[30-31]。本研究結果顯示了S-蛋白對RPE細胞周期的抑制或誘導細胞凋亡是SRAS-CoV-2誘發視網膜病變的機制之一，在血液中SARS-CoV-2的刺激下，RPE細胞凋亡增加引發的血視網膜屏障破壞可能成為病毒進一步攻擊眼部其他組織，引發眼底病變的開始。RPE細胞生長的抑制可能阻礙了視網膜的修復，使血視網膜屏障的破壞加重，加劇病毒介導的眼底損傷，并且可能使損傷持續存在。另外，我們分析S-蛋白對細胞周期的影響除了在病變早期影響視網膜組織對病毒的抵抗力外，還可能成為誘發視網膜慢性病變的促進因素之一，目前缺乏COVID-19患者的長期隨訪資料佐證，但本實驗數據提示了對COVID-19康復者的長期眼部隨訪的必要性。S-蛋白可促使RPE細胞凋亡，我們推測S-蛋白可能與細胞內活性氧產生相關。但具體的調控機制還需要進一步研究。
目前針對于COVID-19眼部遠期并發癥的隨訪研究尚少，我們觀察到過表達SARS-CoV-2 S-蛋白引起的細胞生長減緩、周期變化及細胞凋亡，可能為SARS-CoV-2引起眼部的遠期并發癥提供研究線索。S-蛋白誘導RPE細胞凋亡增加，可能成為血視網膜屏障急性破壞的因素之一，這可能為急性發作的眼底損傷病例提供一定的理論支持。
隨著嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（SARS-CoV-2）引起的新型冠狀病毒感染（COVID-19）在全球范圍內的流行，目前已有較多以眼部感染癥狀為首發表現或全身感染引起眼部繼發癥狀的報道。除目前報道較多的結膜、角膜等眼表結構感染外[1-5]，COVID-19引起眼底病變的報道也逐漸增多[6-8]。COVID-19患者的尸檢結果顯示其視網膜SARS-CoV-2陽性[9]，表明了該病毒對視網膜的感染能力。COVID-19眼底臨床表現多樣，包括視力下降、眼前固定黑影、色覺障礙甚至單眼失明等[7-8]。SARS-CoV-2為帶有外膜的高致病性冠狀病毒，其表面帶有的刺突蛋白（S-蛋白）是介導其感染宿主細胞的關鍵蛋白。在病毒表面S-蛋白與宿主表面相關受體[如血管緊張素轉換酶2（ACE2）]的作用下，介導病毒外膜與細胞膜進行融合，病毒顆粒進入細胞內并激發一系列病理過程[10]。現有研究表明，S-蛋白在不同冠狀病毒基因組中差異較大，是新型冠狀病毒的特異性蛋白[11]。S-蛋白可誘導宿主細胞產生多種病理改變，但其在視網膜細胞中的作用尚不清楚。本研究以人視網膜色素上皮（RPE）細胞為研究對象，研究了SARS-CoV-2 S-蛋白對RPE細胞生長的影響，以期為COVID-19相關眼底病變的進一步研究提供思路。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
人ARPE-19、HEK293細胞（美國組織細胞庫ATCC）；Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM）/F12培養基、DMEM高糖培養基（美國Corning公司）；胎牛血清（美國Gibco 公司）；青霉素-鏈霉素、質粒提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Hoechest33342染色劑（美國MedChemexpress生物科技公司）；細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；細胞轉染試劑盒（美國Ivitrogen公司）；SARS-CoV-2 S-蛋白抗體、ACE2抗體（美國Abcam公司）；Flag抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；載體p3xflag-CMV-7.1質粒、pQCXIP-綠色熒光蛋白（GFP）1-10質粒（以下簡稱為GFP1-10質粒）、pQCXIP-BSR-GFP11質粒（以下簡稱為GFP11質粒）、pCMV-ACE2-Myc質粒（美國Addgene公司）；pSV-Wuhan Spike質粒由上海復旦生物醫學研究院院長徐建青教授惠贈。
1.2 方法
細胞培養。ARPE-19細胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養基中；HEK293細胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養基中。細胞均于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，定期更換培養液，細胞增生至皿底面積80%左右時，胰酶消化傳代并選擇狀態良好的細胞進行后續實驗。
p3xflag-S質粒構建。以pSV-Wuhan Spike質粒為模版，按照下列引物采用聚合酶鏈反應擴增S-蛋白cDNA，并在cDNA兩端分別加入Sal Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點。正向引物：CCCAAGCTTTTCGTGTTCCTGGTGCTC，反向引物：CCCGTCGACTCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGGTGTAGTGGAGCTTCACGCC。應用Sal Ⅰ和Hind Ⅲ酶切載體p3xflag-CMV-7.1質粒。將S-蛋白編碼cDNA克隆至p3xflag-CMV-7.1質粒中，形成p3xflag-S重組質粒。并將該重組質粒進行酶切和DNA測序鑒定。載體p3xflag-CMV-7.1質粒、GFP1-10質粒、GFP11質粒、pCMV-ACE2-Myc質粒利用DH5α感受態大腸桿菌進行質粒轉化擴增。將質粒轉染到HEK293細胞中，對表達的標簽蛋白進行蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測。
細胞質粒轉染。ARPE-19、HEK293細胞接種于6孔細胞培養板上，細胞生長至30%～50%時，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗并更換不含血清的培養基。無菌離心管中加入50 μl Opti-MEM及2 μg目的質粒，室溫靜置5 min。另取無菌離心管加入50 μl Opti-MEM及8 μl lipofectamine3000轉染試劑，室溫靜置5 min后與質粒溶液混合。靜置20 min后將混合溶液逐滴加入待轉染細胞中，6 h后更換完全培養基繼續培養48 h。
細胞融合檢測。HEK293細胞分別接種于2個6 cm細胞培養皿中，培養至細胞生長30%～50%時，按照前述質粒細胞轉染方法向其中一皿細胞內轉染GFP11質粒及pCMV-ACE2-Myc質粒；另一皿細胞轉染GFP1-10質粒及p3xflag-S質粒，24 h后應用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化，將兩組細胞混合后接種于10 cm培養皿中共培養，24 h后分別在明場顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察細胞融合情況。
HEK293細胞分別接種于2個6 cm細胞培養皿中，培養至細胞生長30%～50%時，將細胞分為細胞1、2、3、4，按照前述質粒細胞轉染方法，細胞1轉染GFP11質粒和空載質粒，細胞2轉染GFP1-10質粒和空載質粒，細胞3轉染GFP11和pCMV-HA-ACE2質粒；細胞4轉染GFP1-10和p3xflag-S質粒。轉染后24 h應用不含EDTA的胰酶消化，將細胞1與細胞2（對照組1）、細胞2與細胞3（對照組2）、細胞3與細胞4（觀察組）、細胞1與細胞2、3、4（對照組3）混合后分別接種于10 cm培養皿中共培養，24 h后分別在明場顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察細胞融合情況。
細胞計數試劑盒8（CCK-8）檢測ARPE-19細胞增生情況。將細胞分為對照組、過表達S-蛋白組。依照前述轉染方法，選取轉染后48 h細胞，PBS清洗后用不含EDTA胰酶消化，100 μl細胞懸液以細胞密度2×103個/孔接種于96孔板中，培養后0、24、48、72 h（即轉染后12、36、60、84 h），棄上清液后每孔加入10 μl CCK-8溶液孵育2 h，酶標儀測定450 nm處的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值，繪制生長曲線。
流式細胞儀檢測ARPE-19細胞周期。將細胞分為對照組、過表達S-蛋白組，對照組轉載空載質粒，過表達S-蛋白組轉載S-蛋白質粒。依照前述轉染方法，選取轉染48 h后細胞，PBS洗滌細胞1次，胰酶消化后調整細胞濃度為1×106個/ml，取1 ml細胞懸液去除上清，加入500 μl 70%冷乙醇重懸細胞，4 ℃固定3 h，PBS洗滌。預先按照RnaseA：PI=1:9配置染色工作液，固定后細胞離心加入500 μl工作液重懸，室溫避光孵育1 h，流式細胞儀檢測細胞周期，記錄波長488 nm處熒光。
Western blot檢測轉染與未轉染質粒的APRE-19細胞中S-蛋白、ACE2的表達。質粒轉染48 h后，加入200 μl含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取蛋白，檢測蛋白濃度后取各組蛋白樣本與4倍樣品緩沖液混合后放入100 ℃金屬浴中5 min使蛋白變性。取20 μg蛋白樣品于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠中電泳，跑膠結束后以濕轉印法將分離的蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶、洗膜緩沖液（TBST）、0.1% Tween-20室溫封閉2 h，一抗4 ℃過夜孵育，TBST/0.1% Tween-20洗膜4次；加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，再次洗膜4次；最后加入化學發光底物進行曝光并拍照。以磷酸甘油醛脫氫酶作為內參照，進行灰度分析。
細胞凋亡檢測。采用膜聯蛋白（Annexin）Ⅴ-熒光素異硫氰酸酯（FITC）/碘化丙啶（PI）雙染法檢測ARPE-19細胞凋亡情況。選取轉染48 h后細胞，PBS清洗后用不含EDTA胰酶消化后離心。PBS洗滌細胞1次后收集5×105個細胞再次離心，加入500 μl Binding Buffer重懸細胞。加入5 μl Annexin V-FITC溶液及5 μl PI溶液混勻。室溫、避光反應15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。輸出數據左下象限為活細胞[Annexin V（－）PI（－）]；左上象限為壞死細胞[Annexin V（－）PI（＋）]；右下象限為早期凋亡細胞[Annexin V（＋）PI（－）]；右上象限為晚期凋亡細胞[Annexin V（＋）PI（＋）]。凋亡細胞記右上和右下象限細胞。
1.3 統計學方法
采用GraphPad Prism Software Version 8.4.3軟件行統計學分析。計量資料以均數±標準差（）表示。兩組間比較采用最小顯著差法t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 SARS-CoV-2 S-蛋白哺乳類細胞表達質粒的構建與表達
DNA序列測定結果顯示，S-蛋白cDNA與標簽蛋白融合在一起。Western blot檢測結果顯示，與未轉染p3xflag-S質粒的細胞比較，轉染細胞中S-蛋白相關表達量升高（圖1），即p3xflag-S質粒可在HEK293細胞中表達。
圖1
p3xflag-S質粒驗證蛋白免疫印跡電泳像 GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶
2.2 過表達S-蛋白誘導細胞融合
明場顯微鏡觀察發現，觀察組可見大而多核的融合細胞團（圖2A）；熒光顯微鏡觀察發現 ，觀察組可見融合細胞內有多個核且融合細胞呈現明顯的綠色熒光（圖2B）；即p3xflag-S質粒在HEK293細胞中表達，并具有調控細胞融合活性。
圖2
觀察組細胞融合明場顯微鏡、熒光顯微鏡像 2A示明場顯微鏡像，可見大而多核的融合細胞團 ×60；2B示熒光顯微鏡像，可見融合細胞內有多個核且融合細胞呈現明顯的綠色熒光 ×60
2.3 過表達S-蛋白抑制RPE細胞生長
Western blot檢測結果顯示，與未轉染p3xflag-S質粒的ARPE-19細胞比較，轉染p3xflag-S質粒的ARPE-19細胞存在S-蛋白的表達（圖3A）；與轉染ACE2質粒的ARPE-19細胞比較，未轉染ACE2質粒的ARPE-19細胞中也存在ACE2的表達（圖3B）。
圖3
轉染與未轉染質粒的ARPE-19細胞中ACE2、S-蛋白的蛋白免疫印跡電泳像 ACE2：血管緊張素轉換酶2；S-蛋白：刺突蛋白；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶。3A示ACE2；3B示S-蛋白
CCK-8增生分析結果顯示，與對照組比較，過表達S-蛋白組RPE細胞增生能力顯著降低，差異有統計學意義（t=22.70、16.75、23.38，P＜0.000 1）（圖4A）。流式細胞儀檢測結果顯示，對照組、過表達S-蛋白組G1期細胞分別為41.1%、67.0%；S期細胞分別為29.2%、15.3%。與對照組比較，過表達S-蛋白組G1期細胞明顯升高，S期細胞明顯降低，差異均有統計學意義（t=4.76、13.26，P=0.018、0.001）（圖4B）。對照組、過表達S-蛋白組細胞凋亡率分別為4.47%、14.81%；過表達S-蛋白組細胞凋亡率較對照組明顯增加，差異有統計學意義（t=4.91，P=0.008）（圖4C）。
圖4
對照組、過表達S-蛋白組細胞增生能力、細胞周期比例及細胞凋亡率比較（n=3） 4A示細胞增生能力，****P＜0.000 1；4B示細胞周期比例，*P＜0.05，***P＜0.001；4C示細胞凋亡率，**P＜0.01
3 討論
SARS-CoV-2是一種帶有脂質外膜的RNA病毒，病毒表面的S-蛋白是其特異性蛋白[11]，在感染宿主細胞過程中，S-蛋白與宿主細胞受體識別后介導病毒外膜與細胞膜融合，從而進入宿主細胞中[10]。首先，我們構建了SARS-CoV-2 S-蛋白基因質粒，并利用SARS-CoV-2受體之一ACE2對S-蛋白質粒的生物活性進行了驗證。ACE2受體已經被證明具有SARS-CoV-2受體活性[12-16]，分布在人體內多種組織表面，在眼角膜、結膜上皮、RPE細胞及視網膜毛細血管中均有表達[17-19]。細胞表達S-蛋白后，與SARS-CoV-2受體作用產生膜融合進而引起細胞融合。ACE2膜蛋白是SARS-CoV-2的主要受體[18]，S-蛋白與ACE2受體的結合可產生膜融合過程[10]。有報道體外過表達冠狀病毒S-蛋白可誘導細胞融合。我們利用ACE2 S-蛋白介導的膜融合作用，在HEK293細胞中驗證了p3xflag-S質粒的活性。本實驗應用的GFP11質粒和GFP1-10質粒分別表達GFP蛋白的N-和C-段，兩片段在獨立存在時失去產生綠色熒光的作用，而在兩片段同時表達在一個細胞內時，可組成完整的GFP，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光。我們利用該系統測試了S-蛋白介導的細胞融合作用。我們將ACE2表達質粒轉染的HEK293細胞與轉染S-蛋白的HEK293細胞共培養后，S-蛋白與ACE2受體相互作用介導細胞膜融合，使得在不同細胞胞質內的GFP片段相遇并在融合細胞中重組，呈現綠色熒光。通過細胞的融合作用，證明了構建S-蛋白質粒的生物活性，與報道結果相符[20]。
COVID-19自2019年12月被首次報道后，有大量出現眼部癥狀的病例出現，很多研究確認了其對眼后節的損傷[6, 9, 21]。RPE是人視網膜的重要結構，在維持人視網膜正常的生理狀態和視覺功能上起到重要作用。RPE間的緊密連接是構成血視網膜屏障的結構基礎[22]。有研究表明，SARS-CoV-2引起的血視網膜屏障結構的破壞是導致眼后節感染的重要機制，其主要途徑包括血液中的病毒顆粒可直接感染視網膜細胞，也可以通過感染血細胞穿過被破壞的血視網膜屏障引起眼底的繼發感染[23-24]。這些研究和理論凸顯了RPE細胞在SARS-CoV-2眼后節感染過程中的重要作用。SARS-CoV-2相關的眼底病變表現多樣[25-26]，包括視網膜出血、Roth斑、眼底動脈缺血等。此外，在COVID-19患者痊愈后的長期隨訪中也有患者出現了不同程度的眼部癥狀[23, 27-28]。但是，SARS-CoV-2誘導視網膜病變的機制尚不清楚。基于此，我們測定了SARS-CoV-2 S-蛋白對RPE細胞的致病作用。首先我們檢測到自然狀態下體外培養的RPE細胞存在ACE2的表達，受體表達是RPE細胞能夠被病毒感染的基礎。在轉染S-蛋白表達質粒后，過表達S-蛋白可抑制RPE細胞增生，誘發細胞周期停滯，上調細胞的凋亡通路。在細胞周期實驗中，過表達S-蛋白使G1期細胞比例明顯增加，細胞周期停滯于G0/G1期。很多研究證明了細胞凋亡在眼部病毒感染過程中的關鍵作用，病毒感染后細胞通過激活凋亡通路來避免病毒的進一步復制[29]。在關于RPE細胞其他病毒感染的相關研究中，視網膜細胞死亡在眼底疾病發生中的作用已經被證明[30-31]。本研究結果顯示了S-蛋白對RPE細胞周期的抑制或誘導細胞凋亡是SRAS-CoV-2誘發視網膜病變的機制之一，在血液中SARS-CoV-2的刺激下，RPE細胞凋亡增加引發的血視網膜屏障破壞可能成為病毒進一步攻擊眼部其他組織，引發眼底病變的開始。RPE細胞生長的抑制可能阻礙了視網膜的修復，使血視網膜屏障的破壞加重，加劇病毒介導的眼底損傷，并且可能使損傷持續存在。另外，我們分析S-蛋白對細胞周期的影響除了在病變早期影響視網膜組織對病毒的抵抗力外，還可能成為誘發視網膜慢性病變的促進因素之一，目前缺乏COVID-19患者的長期隨訪資料佐證，但本實驗數據提示了對COVID-19康復者的長期眼部隨訪的必要性。S-蛋白可促使RPE細胞凋亡，我們推測S-蛋白可能與細胞內活性氧產生相關。但具體的調控機制還需要進一步研究。
目前針對于COVID-19眼部遠期并發癥的隨訪研究尚少，我們觀察到過表達SARS-CoV-2 S-蛋白引起的細胞生長減緩、周期變化及細胞凋亡，可能為SARS-CoV-2引起眼部的遠期并發癥提供研究線索。S-蛋白誘導RPE細胞凋亡增加，可能成為血視網膜屏障急性破壞的因素之一，這可能為急性發作的眼底損傷病例提供一定的理論支持。
