眼遺傳病是一組由于基因缺陷導致的眼部疾病，具有多種遺傳方式及基因變異類型眾多等遺傳特點。在過去的幾十年中，基因檢測取得了顯著進步，越來越多的已知致病基因變異被鑒定出。隨著高通量測序技術的飛速發展，加速了眼遺傳病的臨床診斷及治療的步伐，眼遺傳病的分子診斷成為精準診療的重要一步。如何正確選擇、評價每種基因檢測技術，合理規范的運用基因檢測技術，為患者提供更加精準的遺傳咨詢，是臨床醫生需要切實考慮的問題。
引用本文： 睢瑞芳, 姚鳳霞. 了解基因檢測技術在眼遺傳病精準診療中的應用. 中華眼底病雜志, 2021, 37(11): 831-835. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20211027-00608 復制
全球約有千分之一的人患有基因缺陷所致的眼遺傳病。此類疾病病種多，臨床表現各異，可以僅為眼部疾病，也可以是全身多系統疾病同時伴有眼部癥狀的綜合征[1]。眼遺傳病不僅涉及常染色體和性染色體遺傳，還包含線粒體遺傳的疾病，如Leber遺傳性視神經病變。眼遺傳病致病基因的變異類型眾多，除了常見的單核苷酸變異、核苷酸的缺失或插入外、甚至包含整個基因或染色體的重排。另外，遺傳異質性、基因組嵌合及單親同源或異源二倍體等致病機制的存在，給眼遺傳病的基因診斷帶來了困難。近些年隨著基因檢測技術的飛速發展，尤其二代測序技術（NGS）的問世將遺傳病的基因診斷推向了一個新的時代，促進了對疾病更加深入的認識。
我國目前開展基因檢測的機構提供了相對全面的基因檢測報告，然而有時臨床醫師對報告的解讀非常困惑，如基因結果與臨床診斷不符；一種疾病檢測出1個基因的多個變異，難以明確致病性位點；基因檢測結果僅羅列出幾種不相關疾病的錯義突變或臨床意義不明確的變異；基因檢測報告包含2個以上有害突變，如剪切突變、無義突變等可能改變蛋白質結構和功能的突變。上述情況不僅不能加深臨床醫師對遺傳病的深入了解，反而可能引起臨床醫師對基因結果做出錯誤的判斷、解讀或者產生誤解甚至抵觸。同時也反映出我國基因檢測服務與臨床實踐的脫節、基因檢測報告不規范、部分臨床醫師亟待補充醫學遺傳學知識和對檢測報告解讀不熟悉等問題[2]。本文從目前已有的基因檢測技術入手，評價每種方法的優缺點，然后對報告中變異的解釋進行了闡述。掌握這些原則，臨床醫師將能夠合理地運用這些方法，為患者提供更加精準的遺傳咨詢。
1 基因檢測技術
1.1 Sanger測序（一代測序）
1977年Sanger測序技術的問世徹底改變了DNA研究。2001年完成的人類基因組計劃以Sanger測序為關鍵手段，將人類長達3×109堿基對的基因組DNA的序列解碼，成為目前應用廣泛的參考基因組序列（最新版本是hg38）。由于其具有高達99.999%準確性[3]，Sanger 測序是目前驗證遺傳病致病變異的金標準。但是Sanger測序一次只對不超過800個堿基進行序列測定。
1.2 NGS
就成本和生成的數據而言，NGS方法從低到高分別是靶向捕獲測序（Panel測序）、全外顯子測序（WES）和全基因組測序（WGS）。Panel測序針對疾病相關的幾個或幾十個基因進行捕獲、富集和測序；WES捕獲人類基因組中編碼蛋白質的外顯子及側翼內含子序列；WGS對待檢DNA的全基因組序列進行測序，理論上對樣本中的每個核苷酸進行了再測序。
1.2.1 Panel測序
Panel測序通常捕獲的數據較少，且可依據需要定制，如一些遺傳性視網膜病（IRD）的臨床表型與多個基因相關，另外一些基因（如USH2A）的致病變異位于離外顯子遠處的內含子區，這些采用Panel測序較WES更經濟有效，WGS雖然可以使用，但會產生更多的冗余數據，需要更高標準的數據存儲空間和生物信息分析。Panel測序的優點有：（1）對目標區域可以實現深度測序，使得檢出較低頻率的變異（如線粒體基因組中較低水平的異質性變異）或低比例嵌合的幾率高。（2）由于生成較少的數據，在數據存儲、序列比對及變異解析上更便捷、清晰。（3）Panel測序中次級或偶然發現較低，一旦檢出基因變異更有針對性，基因型與臨床表型之間的相關性好，醫師在遺傳咨詢中會更好地為患者提供相關的知識。綜上所述，Panel測序一直被廣泛用于眼遺傳病的基因檢測中，尤其是遺傳性視網膜變性的基因篩查。
不同研究或者檢測機構的Panel基因列表可能不同，對于Panel探針不包含的區域，如該類疾病新的致病基因，或Panel所包含的基因罕見變異等均無法檢出，需重新設計Panel來涵蓋新的發現。Panel測序可以檢測到部分基因結構變異，但需要斷裂點恰好在所定制的基因組區段內，故識別結構變異的陽性率并不高。由于奠基者效應，一些疾病在不同人群中致病基因變異的類型也不同。如日本的遺傳性視網膜色素變性（RP）中51%的病例由于EYS基因變異引起[4]，而我國最常見的遺傳性視網膜變性基因是CYP4V2。這種在不同人群中變異不同在Panel設計時需要重點關注。還需要注意的是，已有研究顯示，同一IRD患者家庭甚至同一個IRD患者發現多個基因變異位點，這給IRD的分子診斷帶來更多的挑戰。我們報道過多例中國患者同時攜帶2種基因的2個或多個致病變異，包括USH2A+EYS、USH2A+CDH23等[5]。
1.2.2 WES與WGS
盡管蛋白質編碼區僅占全基因組的約1.5%，但超過85%的致病變異位于該區域內。WES是針對人類基因組內蛋白質編碼序列進行測序，一般使用商品化的外顯子捕獲試劑結合NGS測序完成。當測序深度達到40X以上，變異檢測的靈敏度和特異性均達到98%以上[6]。WGS與WES比較，由于不需要外顯子捕獲的聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，從而能夠覆蓋到諸如富含GC區的序列。另外，WGS可以識別拷貝數變異（CNV）、結構變異、基因間、基因的調控區和深度內含子變異，這些優勢是Panel測序和WES無法達到的。隨著WES檢測費用的降低以及可以對所有人類已知基因進行序列測定，其同樣被廣泛應用于眼遺傳病的診斷。研究表明，WES技術的應用將IRD的診斷率提高到50%～80%。針對臨床診斷不明確的患者優先應用WES，致病變異的總體檢出率為28.8%[7]，提示臨床醫師在整個診治活動中需要參與其中，與分子檢測團隊不斷溝通，才能提高檢出率。盡管成本昂貴（每個樣本為基本單位，WGS的價格是WES的約五倍），對通過Panel測序或WES未發現的致病變異，仍需要WGS來發現非編碼區變異、CNV及結構變異等[8]。盡管WES和WGS均能夠對外顯子進行測序，WGS外顯子覆蓋率（98%）大于WES外顯子覆蓋率（95%）[9]。WES和WGS均存在3個局限性，分別是鏈偏好、基因組覆蓋的均勻性和覆蓋轉錄本的完整性。
另一種測序策略是特定基因全長測序（GS），其保留了與WGS相同的優勢，只針對某些基因進行WGS。GS能夠捕獲到感興趣的目標基因外顯子、全部內含子和調控區，可以更加全面地對目標基因進行測序。GS已成功地用于單基因或少數基因致病的疾病中。如不完全先天性靜止性夜盲（icCSNB）其主要致病基因是CACNA1F，對189例icCSNB患者進行GS發現，除了常見變異外，約4%的CACNA1F基因的致病變異是內含子變異和同義突變[10]。
1.3 三代測序
與二代測序相比，不論是“單分子實時”測序還是納米孔測序，它們有兩個主要優勢：第一，在無PCR下進行實時測序；第二，生成＞10 kb的超長測序讀數。第三代測序憑借其在高度同源區域分析、結構變異、單倍型和轉錄組分析方面的卓越性能，徹底改變了醫學遺傳學的研究和運用領域。我們團隊最近通過WGS和三代測序確定了首例亞洲NCMD（North Carolina macular dystrophy）的致病基因變異，其為6號染色體上134.6 kb的串聯重復（g.99932464-100067110dup）[11]。三代測序不足之處在于所需成本高，限制了除研究之外的廣泛應用；同時，三代測序技術需要高質量的超長雙鏈DNA，且比一、二代測序錯誤率高。
1.4 CNV芯片
細胞遺傳學檢測方法可用于驗證NGS結果、檢測染色體異常或CNV等。細胞遺傳學包括核型分析、基于微陣列的比較基因組雜交（array-CGH）、熒光原位雜交、多重連接探針擴增技術、熒光定量PCR（QF-PCR）等。核型分析是檢測染色體異常的最傳統方法之一，但它只能檢測大的異常（最小5～10 Mb），如缺失、倒位或重復。CNV一般指大于50 bp的基因組重排。Array-CGH 僅需少量的DNA即可系統地檢測整個基因組DNA的CNV。Array-CGH分辨率能夠達到0.05 Mb，可以檢測到一些核型分析檢測不到的染色體的微小缺失或重復，是研究整個基因組缺失或重復的重要技術。
1.5 動態突變
動態突變是人類基因組中的短串聯重復序列，尤其是基因編碼序列或側翼序列的三核苷酸重復，在一代代傳遞過程中重復次數發生明顯增加，從而導致某些遺傳病的發生。目前由于動態突變導致的疾病有幾十種，其中遺傳性脊髓小腦性共濟失調7型常伴有視網膜變性，其致病基因ATXN7基因外顯子3內CAG重復次數增加超過38個重復時即可致病，而正常等位基因上7到17個重復次數[12]。動態突變由于重復序列長且GC含量高，常規的一代和二代測序方法不能檢測出，故需要使用其他方法，如三重重復引物PCR、Southern印記雜交甚至三代測序來完成。
2 變異解讀
2.1 美國醫學遺傳學會（ACMG）
ACMG提供了一個框架來標準化孟德爾疾病的序列變異解讀。每個變異都使用統一的評分系統進行分類：良性、可能良性、不確定意義、可能致病或致病。分類系統采用多個分層步驟，包括參考文獻和數據庫的使用、計算和預測數據、功能數據和家系內共分離分析。變異分類是臨床分子遺傳學檢測的基石。因此，ACMG指南提供了一個統一的且適用性強的系統來指導這一過程。但是對于識別新基因疾病關聯的研究，ACMG指南的實踐應用中很困難且不太適合。
2.2 數據庫以及表型和基因型
變異頻率數據庫是在群體中等位基因頻率的有用資源。當今最全面的等位基因頻率數據庫是gnomAD，這個組織收集和整理了各種大規模的WES和WGS數據，并面向全世界免費開放。另外與遺傳病致病基因相關的數據庫還包括在線《人類孟德爾遺傳》數據庫（OMIM）、ClinVar數據庫、LOVD數據庫、人類基因突變數據庫（HGMD）等。其中HGMD數據庫中收集的變異均來源于已在文獻中發表的數據并手動錄入。
同一基因的不同等位基因突變可能導致不同的表型，如約70%的Stargardt病是由于ABCA4基因的雙等位基因變異引起，但ABCA4基因的雙等位基因變異還可以導致RP和視錐視桿細胞營養不良。我們對我國129個ABCA4基因相關視網膜變性研究發現，具有兩個“無效”變異的患者的發病年齡更小，并且比具有兩個“非無效”變異的患者更早達到法定失明標準。具有一種或多種“非無效”變異的患者往往具有更好的視功能。此外，大多數具有c.6563T>C （p.Phe2188Ser）變體的患者都具有輕度表型[13]。
除了臨床表型的鑒別外，還應將預期的遺傳模式和變異的致病機制如單倍體不足、功能喪失或獲得，與文獻報告進行比較。對于以前與目標疾病無關的基因，OMIM和GeneCards提供了該基因已知臨床和功能信息的摘要。對于候選疾病基因，研究感興趣組織中的基因表達，并探索相關的蛋白質相互作用網絡可能是有價值的。
2.3 其他
一旦確定了候選致病變異，應進行家系內共分離分析，以確認觀察到的變異與家族史相匹配。如果基因變異與家族內的表型共分離，這可以作為基因變異與疾病關聯的支持性證據。
盡管有的變異等位基因頻率很高，但同樣需要判定為是疾病的致病變異。TYR基因中的c.575C＞A（p.Ser192Tyr）和c.1205G＞A（p.Arg402Gln）變異，在gnomAD數據庫中，等位基因頻率分別為36.4%和27.3%，而具有順式p.[Ser192Tyr;Arg402Gln] 等位基因的等位基因頻率為1.9%。此兩種變異在群體頻率相對較高，但當 p.[Ser192Tyr;Arg402Gln] 等位基因以純合狀態或與具有已知致病性TYR反式變異的三等位基因型存在時，就會致病[14-15]。
另一個復雜因素是單親二體（UPD），其中由于減數分裂過程中的錯誤，2條同源染色體從同一親本遺傳。到目前為止，已有報道在1號染色體上存在UPD導致Stargardt病[16]。
3 遺傳咨詢
遺傳咨詢除遵循傳統的遺傳咨詢基本原則外，需要特殊說明的是：ACMG更新了基于臨床基因組測序數據報告次級發現的建議。ACMG將應報告為次級發現的變異分為已知的致病變異和預期的致病變異，后者表示“之前未報告的序列變異屬于預期導致疾病的類型”。該建議對應該或不應該報告預期致病變異的基因進行了分類。
一旦收到遺傳檢測報告，轉診臨床醫生應以適當的方式將這些結果及時反饋給患者，并提供有效的遺傳咨詢。具有雙等位基因RPE65變異的患者導致常染色體隱性視網膜病變，第一個批準的視網膜基因療法（Luxturna）可以治療該病，改善患者的臨床癥狀[17]。一些與眼部疾病相關的基因結果可能會改變診斷，或者可能會揭示以前可能不明顯的其他綜合征問題的風險。例如一些纖毛病基因缺陷，如IQCB1，可以表現為IRD，但預示將來患有腎臟疾病的風險大。這些患者應轉診給相關的醫師進行早期管理、篩查和代謝測試。這些案例需要復雜的管理體系，包括長期的隨診管理和各科室醫師多學科團隊的共同努力。
在遺傳檢測陰性（無主要發現）結果的情況下，醫師應與患者討論這些結果，并解釋可能導致陰性結果的原因。與患者的對話包括所用技術的局限性以及目前對致病基因的了解情況。應該明確的是，陰性結果不排除患者病情的內部遺傳原因而未被發現，應該向患者提供其他的基因檢測技術。如果患者從全基因組或外顯子組測序中獲得未解決的結果，還應解釋說，由于隨后的基因發現，基因診斷可能會在稍后提供，無需進一步檢測。
4 小結
在過去的幾十年中，基因檢測取得了顯著進步，越來越多的已知致病基因變異被鑒定出，同時隨著高通量測序技術的臨床應用，加速了眼遺傳病的臨床診斷及治療的步伐。可以預計，在不久的將來，新技術和改進的生物信息學分析工具將加速縮短臨床診斷實驗室之間的差距，并將有助于為受影響的家庭提供全面的遺傳咨詢。
全球約有千分之一的人患有基因缺陷所致的眼遺傳病。此類疾病病種多，臨床表現各異，可以僅為眼部疾病，也可以是全身多系統疾病同時伴有眼部癥狀的綜合征[1]。眼遺傳病不僅涉及常染色體和性染色體遺傳，還包含線粒體遺傳的疾病，如Leber遺傳性視神經病變。眼遺傳病致病基因的變異類型眾多，除了常見的單核苷酸變異、核苷酸的缺失或插入外、甚至包含整個基因或染色體的重排。另外，遺傳異質性、基因組嵌合及單親同源或異源二倍體等致病機制的存在，給眼遺傳病的基因診斷帶來了困難。近些年隨著基因檢測技術的飛速發展，尤其二代測序技術（NGS）的問世將遺傳病的基因診斷推向了一個新的時代，促進了對疾病更加深入的認識。
我國目前開展基因檢測的機構提供了相對全面的基因檢測報告，然而有時臨床醫師對報告的解讀非常困惑，如基因結果與臨床診斷不符；一種疾病檢測出1個基因的多個變異，難以明確致病性位點；基因檢測結果僅羅列出幾種不相關疾病的錯義突變或臨床意義不明確的變異；基因檢測報告包含2個以上有害突變，如剪切突變、無義突變等可能改變蛋白質結構和功能的突變。上述情況不僅不能加深臨床醫師對遺傳病的深入了解，反而可能引起臨床醫師對基因結果做出錯誤的判斷、解讀或者產生誤解甚至抵觸。同時也反映出我國基因檢測服務與臨床實踐的脫節、基因檢測報告不規范、部分臨床醫師亟待補充醫學遺傳學知識和對檢測報告解讀不熟悉等問題[2]。本文從目前已有的基因檢測技術入手，評價每種方法的優缺點，然后對報告中變異的解釋進行了闡述。掌握這些原則，臨床醫師將能夠合理地運用這些方法，為患者提供更加精準的遺傳咨詢。
1 基因檢測技術
1.1 Sanger測序（一代測序）
1977年Sanger測序技術的問世徹底改變了DNA研究。2001年完成的人類基因組計劃以Sanger測序為關鍵手段，將人類長達3×109堿基對的基因組DNA的序列解碼，成為目前應用廣泛的參考基因組序列（最新版本是hg38）。由于其具有高達99.999%準確性[3]，Sanger 測序是目前驗證遺傳病致病變異的金標準。但是Sanger測序一次只對不超過800個堿基進行序列測定。
1.2 NGS
就成本和生成的數據而言，NGS方法從低到高分別是靶向捕獲測序（Panel測序）、全外顯子測序（WES）和全基因組測序（WGS）。Panel測序針對疾病相關的幾個或幾十個基因進行捕獲、富集和測序；WES捕獲人類基因組中編碼蛋白質的外顯子及側翼內含子序列；WGS對待檢DNA的全基因組序列進行測序，理論上對樣本中的每個核苷酸進行了再測序。
1.2.1 Panel測序
Panel測序通常捕獲的數據較少，且可依據需要定制，如一些遺傳性視網膜病（IRD）的臨床表型與多個基因相關，另外一些基因（如USH2A）的致病變異位于離外顯子遠處的內含子區，這些采用Panel測序較WES更經濟有效，WGS雖然可以使用，但會產生更多的冗余數據，需要更高標準的數據存儲空間和生物信息分析。Panel測序的優點有：（1）對目標區域可以實現深度測序，使得檢出較低頻率的變異（如線粒體基因組中較低水平的異質性變異）或低比例嵌合的幾率高。（2）由于生成較少的數據，在數據存儲、序列比對及變異解析上更便捷、清晰。（3）Panel測序中次級或偶然發現較低，一旦檢出基因變異更有針對性，基因型與臨床表型之間的相關性好，醫師在遺傳咨詢中會更好地為患者提供相關的知識。綜上所述，Panel測序一直被廣泛用于眼遺傳病的基因檢測中，尤其是遺傳性視網膜變性的基因篩查。
不同研究或者檢測機構的Panel基因列表可能不同，對于Panel探針不包含的區域，如該類疾病新的致病基因，或Panel所包含的基因罕見變異等均無法檢出，需重新設計Panel來涵蓋新的發現。Panel測序可以檢測到部分基因結構變異，但需要斷裂點恰好在所定制的基因組區段內，故識別結構變異的陽性率并不高。由于奠基者效應，一些疾病在不同人群中致病基因變異的類型也不同。如日本的遺傳性視網膜色素變性（RP）中51%的病例由于EYS基因變異引起[4]，而我國最常見的遺傳性視網膜變性基因是CYP4V2。這種在不同人群中變異不同在Panel設計時需要重點關注。還需要注意的是，已有研究顯示，同一IRD患者家庭甚至同一個IRD患者發現多個基因變異位點，這給IRD的分子診斷帶來更多的挑戰。我們報道過多例中國患者同時攜帶2種基因的2個或多個致病變異，包括USH2A+EYS、USH2A+CDH23等[5]。
1.2.2 WES與WGS
盡管蛋白質編碼區僅占全基因組的約1.5%，但超過85%的致病變異位于該區域內。WES是針對人類基因組內蛋白質編碼序列進行測序，一般使用商品化的外顯子捕獲試劑結合NGS測序完成。當測序深度達到40X以上，變異檢測的靈敏度和特異性均達到98%以上[6]。WGS與WES比較，由于不需要外顯子捕獲的聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，從而能夠覆蓋到諸如富含GC區的序列。另外，WGS可以識別拷貝數變異（CNV）、結構變異、基因間、基因的調控區和深度內含子變異，這些優勢是Panel測序和WES無法達到的。隨著WES檢測費用的降低以及可以對所有人類已知基因進行序列測定，其同樣被廣泛應用于眼遺傳病的診斷。研究表明，WES技術的應用將IRD的診斷率提高到50%～80%。針對臨床診斷不明確的患者優先應用WES，致病變異的總體檢出率為28.8%[7]，提示臨床醫師在整個診治活動中需要參與其中，與分子檢測團隊不斷溝通，才能提高檢出率。盡管成本昂貴（每個樣本為基本單位，WGS的價格是WES的約五倍），對通過Panel測序或WES未發現的致病變異，仍需要WGS來發現非編碼區變異、CNV及結構變異等[8]。盡管WES和WGS均能夠對外顯子進行測序，WGS外顯子覆蓋率（98%）大于WES外顯子覆蓋率（95%）[9]。WES和WGS均存在3個局限性，分別是鏈偏好、基因組覆蓋的均勻性和覆蓋轉錄本的完整性。
另一種測序策略是特定基因全長測序（GS），其保留了與WGS相同的優勢，只針對某些基因進行WGS。GS能夠捕獲到感興趣的目標基因外顯子、全部內含子和調控區，可以更加全面地對目標基因進行測序。GS已成功地用于單基因或少數基因致病的疾病中。如不完全先天性靜止性夜盲（icCSNB）其主要致病基因是CACNA1F，對189例icCSNB患者進行GS發現，除了常見變異外，約4%的CACNA1F基因的致病變異是內含子變異和同義突變[10]。
1.3 三代測序
與二代測序相比，不論是“單分子實時”測序還是納米孔測序，它們有兩個主要優勢：第一，在無PCR下進行實時測序；第二，生成＞10 kb的超長測序讀數。第三代測序憑借其在高度同源區域分析、結構變異、單倍型和轉錄組分析方面的卓越性能，徹底改變了醫學遺傳學的研究和運用領域。我們團隊最近通過WGS和三代測序確定了首例亞洲NCMD（North Carolina macular dystrophy）的致病基因變異，其為6號染色體上134.6 kb的串聯重復（g.99932464-100067110dup）[11]。三代測序不足之處在于所需成本高，限制了除研究之外的廣泛應用；同時，三代測序技術需要高質量的超長雙鏈DNA，且比一、二代測序錯誤率高。
1.4 CNV芯片
細胞遺傳學檢測方法可用于驗證NGS結果、檢測染色體異常或CNV等。細胞遺傳學包括核型分析、基于微陣列的比較基因組雜交（array-CGH）、熒光原位雜交、多重連接探針擴增技術、熒光定量PCR（QF-PCR）等。核型分析是檢測染色體異常的最傳統方法之一，但它只能檢測大的異常（最小5～10 Mb），如缺失、倒位或重復。CNV一般指大于50 bp的基因組重排。Array-CGH 僅需少量的DNA即可系統地檢測整個基因組DNA的CNV。Array-CGH分辨率能夠達到0.05 Mb，可以檢測到一些核型分析檢測不到的染色體的微小缺失或重復，是研究整個基因組缺失或重復的重要技術。
1.5 動態突變
動態突變是人類基因組中的短串聯重復序列，尤其是基因編碼序列或側翼序列的三核苷酸重復，在一代代傳遞過程中重復次數發生明顯增加，從而導致某些遺傳病的發生。目前由于動態突變導致的疾病有幾十種，其中遺傳性脊髓小腦性共濟失調7型常伴有視網膜變性，其致病基因ATXN7基因外顯子3內CAG重復次數增加超過38個重復時即可致病，而正常等位基因上7到17個重復次數[12]。動態突變由于重復序列長且GC含量高，常規的一代和二代測序方法不能檢測出，故需要使用其他方法，如三重重復引物PCR、Southern印記雜交甚至三代測序來完成。
2 變異解讀
2.1 美國醫學遺傳學會（ACMG）
ACMG提供了一個框架來標準化孟德爾疾病的序列變異解讀。每個變異都使用統一的評分系統進行分類：良性、可能良性、不確定意義、可能致病或致病。分類系統采用多個分層步驟，包括參考文獻和數據庫的使用、計算和預測數據、功能數據和家系內共分離分析。變異分類是臨床分子遺傳學檢測的基石。因此，ACMG指南提供了一個統一的且適用性強的系統來指導這一過程。但是對于識別新基因疾病關聯的研究，ACMG指南的實踐應用中很困難且不太適合。
2.2 數據庫以及表型和基因型
變異頻率數據庫是在群體中等位基因頻率的有用資源。當今最全面的等位基因頻率數據庫是gnomAD，這個組織收集和整理了各種大規模的WES和WGS數據，并面向全世界免費開放。另外與遺傳病致病基因相關的數據庫還包括在線《人類孟德爾遺傳》數據庫（OMIM）、ClinVar數據庫、LOVD數據庫、人類基因突變數據庫（HGMD）等。其中HGMD數據庫中收集的變異均來源于已在文獻中發表的數據并手動錄入。
同一基因的不同等位基因突變可能導致不同的表型，如約70%的Stargardt病是由于ABCA4基因的雙等位基因變異引起，但ABCA4基因的雙等位基因變異還可以導致RP和視錐視桿細胞營養不良。我們對我國129個ABCA4基因相關視網膜變性研究發現，具有兩個“無效”變異的患者的發病年齡更小，并且比具有兩個“非無效”變異的患者更早達到法定失明標準。具有一種或多種“非無效”變異的患者往往具有更好的視功能。此外，大多數具有c.6563T>C （p.Phe2188Ser）變體的患者都具有輕度表型[13]。
除了臨床表型的鑒別外，還應將預期的遺傳模式和變異的致病機制如單倍體不足、功能喪失或獲得，與文獻報告進行比較。對于以前與目標疾病無關的基因，OMIM和GeneCards提供了該基因已知臨床和功能信息的摘要。對于候選疾病基因，研究感興趣組織中的基因表達，并探索相關的蛋白質相互作用網絡可能是有價值的。
2.3 其他
一旦確定了候選致病變異，應進行家系內共分離分析，以確認觀察到的變異與家族史相匹配。如果基因變異與家族內的表型共分離，這可以作為基因變異與疾病關聯的支持性證據。
盡管有的變異等位基因頻率很高，但同樣需要判定為是疾病的致病變異。TYR基因中的c.575C＞A（p.Ser192Tyr）和c.1205G＞A（p.Arg402Gln）變異，在gnomAD數據庫中，等位基因頻率分別為36.4%和27.3%，而具有順式p.[Ser192Tyr;Arg402Gln] 等位基因的等位基因頻率為1.9%。此兩種變異在群體頻率相對較高，但當 p.[Ser192Tyr;Arg402Gln] 等位基因以純合狀態或與具有已知致病性TYR反式變異的三等位基因型存在時，就會致病[14-15]。
另一個復雜因素是單親二體（UPD），其中由于減數分裂過程中的錯誤，2條同源染色體從同一親本遺傳。到目前為止，已有報道在1號染色體上存在UPD導致Stargardt病[16]。
3 遺傳咨詢
遺傳咨詢除遵循傳統的遺傳咨詢基本原則外，需要特殊說明的是：ACMG更新了基于臨床基因組測序數據報告次級發現的建議。ACMG將應報告為次級發現的變異分為已知的致病變異和預期的致病變異，后者表示“之前未報告的序列變異屬于預期導致疾病的類型”。該建議對應該或不應該報告預期致病變異的基因進行了分類。
一旦收到遺傳檢測報告，轉診臨床醫生應以適當的方式將這些結果及時反饋給患者，并提供有效的遺傳咨詢。具有雙等位基因RPE65變異的患者導致常染色體隱性視網膜病變，第一個批準的視網膜基因療法（Luxturna）可以治療該病，改善患者的臨床癥狀[17]。一些與眼部疾病相關的基因結果可能會改變診斷，或者可能會揭示以前可能不明顯的其他綜合征問題的風險。例如一些纖毛病基因缺陷，如IQCB1，可以表現為IRD，但預示將來患有腎臟疾病的風險大。這些患者應轉診給相關的醫師進行早期管理、篩查和代謝測試。這些案例需要復雜的管理體系，包括長期的隨診管理和各科室醫師多學科團隊的共同努力。
在遺傳檢測陰性（無主要發現）結果的情況下，醫師應與患者討論這些結果，并解釋可能導致陰性結果的原因。與患者的對話包括所用技術的局限性以及目前對致病基因的了解情況。應該明確的是，陰性結果不排除患者病情的內部遺傳原因而未被發現，應該向患者提供其他的基因檢測技術。如果患者從全基因組或外顯子組測序中獲得未解決的結果，還應解釋說，由于隨后的基因發現，基因診斷可能會在稍后提供，無需進一步檢測。
4 小結
在過去的幾十年中，基因檢測取得了顯著進步，越來越多的已知致病基因變異被鑒定出，同時隨著高通量測序技術的臨床應用，加速了眼遺傳病的臨床診斷及治療的步伐。可以預計，在不久的將來，新技術和改進的生物信息學分析工具將加速縮短臨床診斷實驗室之間的差距，并將有助于為受影響的家庭提供全面的遺傳咨詢。